РАЗБАВИТЕЛЬ ДЛЯ ВИРУС-ВАКЦИН КОНЦЕНТРИРОВАННЫЙ Российский патент 2002 года по МПК A61K39/12 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в вирусологии для разведения сухих и клеточно-ассоциированных вирус-вакцин.

Известен разбавитель для сухой вирус-вакцины против болезни Марека, содержащий пептон и глициновый буфер (А.с. СССР N 563175, кл. A 61 K 39/12; C 12 K 5/00). Однако этот разбавитель можно использовать только для бесклеточных сухих вирус-вакцин и его невозможно простерилизовать в концентрированном виде.

Известен также разбавитель для клеточно-ассоциированной вирус-вакцины против болезни Марека, содержащий полиэтиленгликоль и физиологический забуференный раствор (А.с. СССР N 1374492, кл. A 61 K 39/255). Однако этот разбавитель не может применяться для сухих бесклеточных вакцин. Таким образом, оба эти разбавителя не являются универсальными, пригодными одновременно для сухих и клеточно-ассоциированных вирус-вакцин (против болезни Марека, Ньюкасла, Гамборо, тейлериоза и др.) и не могут быть приготовлены в концентрированном виде.

Целью заявляемого изобретения является обеспечение сохранения активности разведенных сухих и клеточно-ассоциированных вирус-вакцин, получение концентрированной формы разбавителя, увеличение его срока годности, возможности визуального контроля pH, а также снижение затрат на изготовление и транспортирование препарата.

Указанная цель достигается тем, что заявляемый разбавитель содержит пептон, сахарозу, двузамещенный фосфат калия, индикатор pH феноловый красный и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов мас.%:
Пептон - 1,5-8,0
Сахароза - 21,0-41,0
Двузамещенный фосфат калия - 0,5-0,9
Индикатор pH феноловый красный - 0,005-0,01
Вода дистиллированная - Остальное до 100,0
Разбавитель готовят следующим образом.

Пример 1. Для приготовления разбавителя берут навеску, мас.%: пептона 1,5; сахарозы 21,0; двузамещенного фосфата калия 0,5; индикатора pH фенолового красного 0,005; воды дистиллированной - остальное до 100,0. Все это смешивают и измеряют pH, который должен быть в пределах 7,0-7,4. Полученный разбавитель стерилизуют фильтрованием через пластины типа "Миллипор" с диаметром пор 0,22 мкм. После этого стерильный разбавитель расфасовывают по 10 или по 20 см³ в стерильные флаконы, которые закрывают стерильными резиновыми пробками, обкатывают металлическими колпачками и этикетируют.

Пример 2. Разбавитель готовят аналогично примеру 1, только навеску компонентов берут следующую, мас.%: пептона 4,5; сахарозы 31,0; двузамещенного фосфата калия 0,7; индикатора pH фенолового красного 0,008; воды дистиллированной - остальное до 100,0.

Пример 3. Разбавитель готовят аналогично примеру 1, только навеску компонентов берут следующую, мас.%: пептона 8,0; сахарозы 41,0; двузамещенного фосфата калия 0,9; индикатора pH фенолового красного 0,01; воды дистиллированной - остальное до 100,0.

Пример 4. Разбавитель готовят аналогично примеру 1, только навеску компонентов берут следующую, мас.%: пептона 1,4; сахарозы 20,0; двузамещенного фосфата калия 0,4; индикатора pH фенолового красного 0,004; воды дистиллированной - остальное до 100,0.

Пример 5. Разбавитель готовят аналогично примеру 1, только навеску компонентов берут следующую, мас.%: пептона 9,0; сахарозы 42,0; двузамещенного фосфата калия 1,0; индикатора pH фенолового красного 0,02; воды дистиллированной - остальное до 100,0.

Вес одного флакона объемом 20 см³ разбавителя универсального, концентрированного составляет 40,0 г, что в 5-7 раз меньше, чем вес одного флакона объемом 200 см³ неконцентрированных известных разбавителей на основе пептона или полиэтиленгликоля. В процессе хранения и перед применением разбавителя осуществляют визуальный контроль его pH. Изменение насыщенно-красного цвета на оранжево-красный свидетельствует о смещении pH в кислую сторону, а изменение цвета на красно-фиолетовый - в щелочную сторону. В этих случаях препарат выбраковывают.

Перед применением для разведения вирус-вакцины концентрированный универсальный разбавитель разводят стерильной дистиллированной водой в 10 раз, для чего смешивают 20 см³ концентрированного разбавителя и 180 см³ стерильной дистиллированной воды. Готовый к употреблению универсальный разбавитель имеет оранжево-красный цвет, pH 7,0-7,4; осмолярность 210-270 единиц. Указанная осмолярность обеспечивает целостность оболочки и жизнеспособность клеток в течение периода вакцинации (использования клеточно-ассоциированной разведенной вакцины).

Пример 6. Для определения стабилизирующей активности известных разбавителей и предлагаемого универсального концентрированного пептоно-сахарозного разбавителя сухую вакцину против болезни Марека (БМ) разводят в каждом разбавителе до прививной концентрации, которая должна составлять 2000 ФОЕ/0,2 см³ (служит базой для расчета эффективности стабилизации вируса сухой вакцины против БМ), и выдерживают при комнатной температуре (20-25^oC) в течение двух часов. Стабилизирующую активность разбавителей оценивают по выживаемости вакцинного вируса сразу после разведения и через 1 и 2 часа после разведения вакцины. Данные по выживаемости вакцинного вируса представлены в таблице 1.

Таким образом, как видно из таблицы 1, предлагаемый разбавитель по показателю выживаемости вакцинного вируса превосходит разбавитель на основе 2% пептона на глициновом буфере, а оптимальным является концентрированный разбавитель следующего состава, мас.%: пептона 4,5; сахарозы 31,0; двузамещенного фосфата калия 0,7; индикатора pH фенолового красного 0,008; воды дистиллированной - остальное до 100,0 (пример 2).

Пример 7. Для определения стабилизирующей активности известных разбавителей и предлагаемого концентрированного пептоно-сахарозного универсального разбавителя жидкую клеточно-ассоциированную вирус-вакцину против БМ, представляющую собой суспензию инфицированных вакцинным вирусом живых клеток, замороженных в жидком азоте, разводят в каждом из разбавителей до прививной концентрации, которая должна составлять 1000 ФОЕ/0,2 см³ (служит базой для расчета эффективности стабилизации клеточно-ассоциированной вирус-вакцины против БМ) и выдерживают при комнатной температуре (20-25^oC) в течение 2-х часов. Стабилизирующую активность разбавителей оценивают по выживаемости клеток и вакцинного вируса сразу после разведения и через 1 и 2 часа после разведения вакцины. Данные по выживаемости вакцинного вируса представлены в таблице 2.

Таким образом, как видно из таблицы 2, предлагаемый разбавитель по выживаемости вакцинного вируса в клеточно-ассоциированной вакцине превосходит разбавитель на основе 2% полиэтиленгликоля, а оптимальным является концентрированный универсальный разбавитель следующего состава: пептона 4,5; сахарозы 31,0; двузамещенного фосфата калия 0,7; индикатора pH фенолового красного 0,008; воды дистиллированной - остальное до 100,0 (пример 2).

Пример 8. Для определения стабилизирующей активности известных разбавителей и предлагаемого универсального концентрированного пептоно-сахарозного разбавителя вакцину против болезни Гамборо разводят в каждом разбавителе до прививной концентрации и выдерживают при 20-25^oC в течение 2-х часов. Стабилизирующую активность разбавителей оценивают по выживаемости вакцинного вируса сразу после разведения и через 1 и 2 часа после разведения вакцины. Данные по выживаемости вакцинного вируса представлены в таблице 3.

Таким образом, как видно из таблицы 3, заявляемый концентрированный универсальный разбавитель по выживаемости вакцинного вируса превосходит пептоно-глициновый разбавитель, а оптимальным является концентрированный разбавитель следующего состава, мас.%: пептона 4,5; сахарозы 31,0; двузамещенного фосфата калия 0,7; индикатора pH фенолового красного 0,008; воды дистиллированной до 100,0 (пример 2).

Пример 9. Для определения срока годности разбавителей оценивают их стабилизирующую активность через 0, 1 и 2 (срок наблюдения) года хранения при температуре 4-6^oC и 20-25^oC. В таблице 4 показана выживаемость вируса в разных вакцинах, разведенных разными разбавителями в зависимости от срока и температуры хранения.

Как видно из таблицы 4, выживаемость вакцинного вируса различных вакцин, разведенных заявляемым концентрированным универсальным разбавителем, хранившимся 2 года (срок наблюдения) при 4 - 25^oC, равна 82 - 100% и практически не отличается от выживаемости в свежеприготовленном разбавителе (85 - 100%), в то время как выживаемость вакцинного вируса разных вакцин, разведенных известными разбавителями, значительно снижается уже через год и колеблется от 56 до 80%.

Изобретение относится к биотехнологии. Концентрированный универсальный разбавитель для вирус-вакцин содержит в своем составе, мас.%: пептон 1,5-8,0, сахароза 21,0-41,0, двузамещенный фосфат калия 0,5-0,9, индикатор рН феноловый красный 0,005-0,01, вода дистиллированная остальное до 100,0. Выживаемость вакцинного вируса различных вакцин, разведенных концентрированным универсальным разбавителем, хранившимся в течение 2-х лет (срок наблюдения), практически не отличается от выживаемости в свежеприготовленном разбавителе и составляет 82-100% при 4-25^oС в течение 2 ч. 4 табл.

Разбавитель для вирус-вакцин концентрированный, содержащий пептон, отличающийся тем, что дополнительно содержит сахарозу, двузамещенный фосфат калия, индикатор рН феноловый красный и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Пептон - 1,5-8,0
Сахароза - 21,0-41,0
Двузамещенный фосфат калия - 0,5-0,9
Индикатор рН феноловый красный - 0,005-0,01
Вода дистиллированная - Остальное до 100,0