СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЕПАРИНА В ВОДНОМ РАСТВОРЕ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/15 G01N33/48 G01N33/52 

Гепарин относится по химической структуре к полисахаридам (3;4). Официальный раствор гепарина содержит стабилизатор (2), поэтому следует уточнить, что полученный спектр является суммарным спектром данной многокомпанентной смеси. Однако это не является принципиальным препятствием определения истинной концентрации гепарина при условии, что в лаборатории есть стандарты: это может быть химически чистый гепарин или официнальный раствор гепарина с известной концентрацией.

При использовании в качестве стандарта кристаллического гепарина исследование проводят в режиме мультикомпонентного анализа. Все расчеты в мультикомпонентном анализе основаны на том, что абсорбция в любой точке спектра является суммой индивидуальных абсорбций каждого компонента пробы (5). Простейший мультикомпонентный анализ предполагает использование одной длины волны на каждый компонент. Более точное определение предполагает исследование на большем количестве длин волн, чем компонентов в пробе.

Таким образом, возможно применение предлагаемого способа как для определения концентрации гепарина в однокомпанентном растворе, так и в смеси с другими веществами.

Целью изобретения является определение малых количеств гепарина в водном растворе.

Поставленная цель осуществляется при использовании спектрофотометрии в режиме сканирования в ультрафиолетовой части спектра с построением спектральной кривой поглощения (абсорбции) и нахождения на ней характерных длин волн.

Определение малых доз гепарина осуществляют следующим образом: анализы выполняют на спектрофотометре "DU 7500" фирмы "Beckman". Для исследования используют препарат - натриевую соль гепарина во флаконах по 5 мл (5000 Ед/мл) - официнальный раствор гепарина для инъекций производства Федерального унитарного предприятия "Московский эндокринный завод" (Россия), регистрационный номер 70/307 - 1998 г.

Ход исследования.

1. Определение спектра поглощения рабочих растворов гепарина и их идентификация.

Для определения спектра поглощения рабочих растворов гепарина и их идентификации анализируют растворы гепарина следующих концентраций:
1. к 2,5 тыс. ед. (0,5 мл) гепарина добавляют 9,5 мл дистиллированной воды. Конечная концентрация - 250 ед./мл.

2. к 5 тыс. ед. (1 мл) гепарина добавляют 9 мл дистиллированной воды. Конечная концентрация - 500 ед./мл.

3. к 7,5 тыс. ед. (1,5 мл) гепарина добавляют 8,5 мл дистиллированной воды. Конечная концентрация - 750 тыс. ед./мл.

4. к 10 тыс. ед. (2 мл) гепарина добавляют 8 мл дистиллированной воды. Конечная концентрация - 1000 ед./мл.

Анализируемые растворы гепарина прозрачные, бесцветные, поэтому исследуют только ультрафиолетовый диапазон от 220 нм до 300 нм. Получают идентичные графики с максимумами поглощения на характерных длинах волн: 253 нм, 258 нм, 262 нм. Пропорционально концентрации растворов меняется оптическая плотность, но общий профиль спектра поглощения остается идентичным с характерными вышеуказанными точками перегиба (см. график 1, фиг. 1). Это свидетельствует о том, что исследуют разные концентрации одного и того же вещества. Поэтому правомочным является построение калибровочного графика по УФ спектру поглощения эталонных растворов гепарина.

2. Построение калибровочного графика.

Для индикации и идентификации гепарина и определения количества единиц гепарина в растворах построена калибровочная кривая по фармакопейному раствору гепарина. Концентрацию гепарина в опытных образцах определяют автоматически по тангенсу угла наклона калибровочного графика с допустимой погрешностью в 1%.

Исследуемые растворы гепарина имеют следующие концентрации:
1. к 2,5 тыс. ед. (0,5 мл) гепарина добавляют 9,5 мл дистиллированной воды. Конечная концентрация - 250 ед./мл.

2. к 5 тыс. ед. (1 мл) гепарина добавляют 9 мл дистиллированной воды. Конечная концентрация - 500 тыс. ед./мл.

3. к 7,5 тыс. ед. (1,5 мл) гепарина добавляют 8,5 мл дистиллированной воды. Конечная концентрация - 750 тыс. ед./мл.

4. к 10 тыс. ед. (2 мл) гепарина добавляют 8 мл дистиллированной воды. Конечная концентрация - 1000 ед./мл.

5. к 15 тыс. ед. (3 мл) гепарина добавляют 7 мл дистиллированной воды. Конечная концентрация - 1500 ед./мл.

См. график 2 (фиг. 2).

Данные калибровочного графика сохраняются в "памяти" компьютера и на основании их математической обработки (в используемой модели спектрофотометра, обеспеченном прикладными программами, этот процесс совершается автоматически) вычисляется количество гепарина в исследуемой пробе.

Для проверки правильности выполнения анализа концентрации малых доз гепарина в растворах проанализирована серия опытных растворов гепарина слепым методом (см. таблицу).

Таблица демонстрирует высокий уровень достоверности получаемых результатов. Среднее значение погрешности не превышает 5% во всем диапазоне исследования, что входит в допустимый предел погрешности измерений (6; 7).

Таким образом, метод может быть рекомендован для определения малых доз гепарина в медицинской и экспериментальной практике.

Источники информации
1. Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс "Справочник биохимика" - М., 1991 г., 464 с.

2. Фармакопейная статья 42-1331-87 ГФХ.

3. Е. П. Иванов. Диагностика нарушений гемостаза. - Минск, 1983 г., 222 с.

4. Руководство по гемотологии. Под ред. А.И. Вороева, - М., 1985, том 1, 447 с.

5. Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике". Под ред. Меньшикова В.В., -М., 1987, 368 с.

6. Методические разработки Госстандарта России "Система аккредитации аналитических лабораторий". Прилож. 2: Требование к "Руководству по качеству" - М., 1993.

7. Bradford. M., "Analytical Biochemistry", 1976, 278 p.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии. Способ осуществляют следующим образом: спектрофотометрическим методом исследуют поглощение гепарина в ультрафиолетовой части спектра при длине волны 258 нм, на которой наблюдается линейная зависимость оптической плотности от концентрации гепарина. Способ позволяет просто и доступно определить концентрацию гепарина. 1 табл., 2 ил.

Способ определения концентрации гепарина в водном растворе методом спектрофотометрии, отличающийся тем, что исследуют количество гепарина в ультрафиолетовой части спектра на длине волны 258 нм, на которой наблюдается линейная зависимость оптической плотности от концентрации водного раствора гепарина и максимум поглощения.