СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗМОЖНОГО КОЛИЧЕСТВА ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В КОДИРУЮЩЕЙ ЧАСТИ ГЕНА Российский патент 2002 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики и может использоваться в различных областях биологии и медицины для подсчета теоретически возможного количества точечных мутаций.

Известен способ определения общего количества точечных мутаций в кодирующей части гена, включающий определение количества мутаций с изменением смысла, нейтральных и терминирующих мутаций (Giannelli F., 1998) [1].

Однако данным известным способом определяют лишь практическое число трех типов мутаций в конкретном гене, содержащем данные мутации, но не определяют теоретически возможное общее количество мутаций в нем и теоретически возможное количество мутаций каждого из трех типов.

Техническим результатом, достигнутым настоящим изобретением, явилось определение возможного количества мутаций в гене, а также возможного количества каждого из трех типов мутаций.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения возможного количества точечных мутаций в кодирующей части гена, включающем определение количества мутаций с изменением смысла, нейтральных и терминирующих мутаций, отличительной особенностью является то, что дополнительно определяют количество аминокислотных остатков каждой аминокислоты в белке, синтезируемом кодирующей частью гена, и общее количество аминокислотных остатков в белке.

Общее возможное количество мутаций находят из математического выражения (1)
М общ = N a.a. • 9, (1)
где М общ - возможное количесто мутаций в гене;
N а.а. - общее количество аминокислотных остатков в белке.

Возможное количество нейтральных (или молчащих) мутаций находят из математического выражения (2)
М silent = [N gly + N ala + N val + N thr + N pro] • 3 + [N ile x 2] + N glu + N asp + N gln + N asn + N cys + N lys + N phe + N tyr + N his + [N leu (CTY) • 3] + [N leu (CTR) • 4] + [N leu (TTR) • 2] [N ser (TCZ) • 3] + N ser AGY + [N arg (CGY) • 3] + [N arg (CGR) • 4] + [N arg (AGR) • 2], (2)
где M silent - возможное количество молчащих мутаций;
N - количество остатков конкретной аминокислоты в белке.

Возможное количество терминирующих мутаций находят из математического выражения (3)
М nonsense = N glu + N gln + N cys + N lys + N gly (GGA) + N arg (CGA) + N arg (AGA) + N leu (TTG) + N ser (TCG) + [N trp + N tyr + N leu (TTA) + n ser (TCA)] • 2, (3)
где М nonsense - возможное количество терминирующих мутаций;
N - количество остатков конкретной аминокислоты в белке,
а возможное количество мутаций с изменением смысла находят из математического выражения (4)
М missense = М общ - (М silent + М nonsense), (4)
где М missense - возможное количество мутаций с изменением смысла;
М общ - возможное общее количество мутаций;
М silent - возможное количество молчащих мутаций;
М nonsense - возможное количество терминирующих мутаций.

Впервые по количеству аминокислотных остатков в белке и по количеству остатков каждой конкретной аминокислоты предложено определять теоретически возможное количество мутаций в гене и возможное количество каждого из трех типов мутаций.

Ниже приведен пример, иллюстрирующий изобретение.

Пример 1. В настоящее время установлено, что мутации в гене фактора IX обусловливают наследственное заболевание - гемофилию В. К настоящему времени в гене фактора IX зарегистровано 456 мутаций, обусловленных заменой нуклеотидов, в том числе 404 мутации с изменением смысла (missense мутации), 6 нейтральных (silent) мутаций и 47 терминирующих (nonsense) мутаций (1). Пользуясь результатами определения нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена фактора IX человека (2), можно произвести расчеты по оценке теоретически возможного количества мутаций в гене фактора IX человека, определив количество различных аминокислот в данном полипептиде. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности гена фактора IX приведена на фиг.1.

По способу согласно изобретению определили общее возможное количество мутаций (М общ), используя математическое выражение (1)
М общ = N a.a. • 9,
М общ = 461 • 9 = 4149.

Подсчет возможного количества нейтральных (молчащих-silent) мутаций (М silent) в гене фактора IX проводили с помощью математического выражения (2)
М silent = [N gly + N ala + N val + N thr + N pro] • 3 + [N ile • 2] + N glu + N asp + N gln + N asn + N cys + N lys + N phe + N tyr + N his + [N leu (CTY) • 3] + [N leu (CTR) • 4] + [N leu (TTR) • 2] + [N ser (TCZ) • 3] + N ser AGY + [N arg (CGY) • 3] + [N arg (CGR) • 4] + [N arg (AGR) • 2] = (36 + 22 + 37 + 31 + 15) • 3 + (25 • 2) + 43 + 19 + 14 + 32 + 24 + 28 + 21 + 16 + 10 + (14 • 3) + (5 • 4) + (9 • 2) + (17 • 3) + 10 + (2 • 3) + (9 • 4) + (9 • 2) = 881.

Подсчет возможного количества терминирующих мутаций (М nonsense) проводили с помощью математического выражения (3)
М nonsense = N glu + N gln + N cys + N lys + N gly (GGA) + N arg (CGA) + N arg (AGA) + N leu (TTG) + N ser (TCG) + [N trp + N tyr + N leu (TTA) + n ser (TCA)] • 2 = 43 + 14 + 24 + 28 + 15 + 6 + 8 + 3 + 0 + (7 + 16 + 6 + 6) • 2 = 211,
а подсчет возможного количества мутаций с изменением смысла (М missense) - с помощью математического выражения (4)
М missense = М общ - (М silent + М nonsense) = 4149 - (881 + 211) = 3057.

Пример 2.

В настоящее время установлено, что мутации в гене фенилаланингидроксилазы (ФАГ) обусловливают наследственное заболевание - фенилкетонурию. К настоящему времени в гене фенилаланингидроксилазы зарегистровано 226 мутаций, обусловленных заменой нуклеотидов, в том числе 196 мутаций с изменением смысла (missense мутации), 11 нейтральных (silent) мутаций и 19 терминирующих (nonsense) мутаций. Пользуясь результатами определения нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена фенилаланингидроксилазы человека, можно произвести расчеты по оценке теоретически возможного количества мутаций в гене фенилаланингидроксилазы человека, определив количество различных аминокислот в данном полипептиде. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности гена фенилаланингидроксилазы приведены на фиг.2.

По способу согласно изобретению определили общее возможное количество мутаций (М общ), используя математическое выражение (1)
М общ = N а.а. • 9,
М общ = 452 • 9 = 4068.

Подсчет возможного количества нейтральных (молчащих-silent) мутаций (М silent) в гене фенилаланингидроксилазы проводили с помощью математического выражения (2)
М silent = [N gly + N ala + N val + N thr + N pro] • 3 + [N ile • 2] + N glu + N asp + N gln + N asn + N cys + N lys + N phe + N tyr + N his + [N leu (CTY) • 3] + [N leu (CTR) • 4] + [N leu (TTR) • 2] + [N ser (TCZ) • 3] + N ser AGY + [N arg (CGY) • 3] + [N arg (CGR) • 4] + [N arg (AGR) • 2] = (25 + 28 + 19 + 24 + 23) • 3 + (28 • 2) + 35 + 23 + 21 + 16 + 9 + 30 + 27 + 22 + 13 + (17 • 3) + (18 • 4) + (15 • 2) + (21 • 3) + (7 • 1) + (0 • 3) + (6 • 4) + (9 • 2) = 931.

Подсчет возможного количества терминирующих мутаций (М nonsense) проводили с помощью математического выражения (3):
М nonsense = N glu + N gln + N cys + N lys + N gly (GGA) + N arg (CGA) + N arg (AGA) + N leu (TTG) + N ser (TCG) + [N trp + N tyr + N leu (TTA) + n ser (TCA)] • 2 = 35 + 21 + 9 + 30 + 6 + 4 + 5 + 11 + 0 + (3 + 22 + 4 + 7) • 2 = 193,
а подсчет возможного количества мутаций с изменением смысла (М missense) - с помощью математического выражения (4)
М missense = М общ - (М silent + М nonsense) = 4068 - (931 + 193) = 2944.

С помощью данного способа было определено теоретически возможное количество мутаций в кодирующей части гена еще в 64 генах человека, обусловливающих наследственные заболевания человека. В таблице 1 представлены данные по количеству теоретически возможного количества мутаций по некоторым генам человека, обусловливающим наследственные заболевания.

На основе использования данного способа стала реальной возможность определения количества точечных мутаций в кодирующей части гена любых живых организмов. Ниже приведены примеры использования данного способа для количественного учета мутаций у растений и микроорганизмов.

Пример 3.

Пользуясь результатами определения нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена EmpI риса (Oryza sativa), приведенными на фиг.3, можно произвести расчеты по оценке теоретически возможного количества мутаций в данном гене растения Oryza sativa, определив количество различных аминокислот в данном полипептиде.

По способу согласно изобретению определили общее возможное количество мутаций (М_общ), используя математическое выражение (1)
М общ = N а.а. • 9,
М общ = 95 • 9 = 855.

Подсчет возможного количества нейтральных (молчащих-silent) мутаций (М silent) в гене EmpI риса проводили с помощью математического выражения (2)
M silent = [N gly + N ala + N val + N thr + N pro] • 3 + [N ile • 2] + N glu + N asp + N gln + N asn + N cys + N lys + N phe + N tyr + N his + [N leu (CTY) • 3] + N leu (CTR) • 4] + [N leu (TTR) • 2] + [N ser (TCZ) • 3] + N ser AGY + [N arg (CGY) • 3] + [N arg (CGR) • 4] + [N arg (AGR) • 2] = (18 + 7 + 2 + 5 + 1) • 3 + (2 • 2) + 13 + 4 + 8 +1 + 0 + 6 + 0 + 2 + 0 + (3 • 3) + (1 • 4) + (0 • 2) + (5 • 3) + 3 + (7 • 3) + (0 • 4) + (2 • 2) = 193.

Подсчет возможного количества терминирующих мутаций (М nonsense) проводили с помощью математического выражения (3)
M nonsense = N glu + N gln + N cys + N lys + N gly (CGA) + N arg (CGA) + N arg (AGA) + N leu (TTG) + N ser (TCG) + [N trp + N tyr + N leu (TTA) + n ser (TCA)] • 2 = 13 + 8 + 0 + 6 + 0 + 0 + 0 + 0 + 1 + (0 + 2 + 0 + 0) • 2 = 32,
а подсчет возможного количества мутаций с изменением смысла (М missense) - с помощью математического выражения (4):
М missense = М общ - (М silent + М nonsense) = 855 - (193 + 32) = 630.

Пример 4.

Пользуясь результатами определения нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена резолвазы (resolvase TnpR) стрептококка (Streptococcus faecalis), приведенными на фиг.4, можно произвести расчеты по оценке теоретически возможного количества мутаций в данном гене микроорганизма, определив предварительно количество различных аминокислот в данном полипептиде.

По способу согласно изобретению определили общее возможное количество мутаций (М общ), используя математическое выражение (1)
М общ = N а.а. • 9,
М общ = 179 • 9 = 1611.

Подсчет возможного количества нейтральных (молчащих-silent) мутаций (М silent) в гене резолвазы стрептококка проводили с помощью математического выражения (2)
M silent = [N gly + N ala + N val + N thr + N pro] • 3 + [N ile • 2] + N glu + N asp + N gln + N asn + N cys + N lys + N phe + N tyr + N his + [N leu (CTY) • 3] + N leu (CTR) • 4] + [N leu (TTR) • 2] + [N ser (TCZ) • 3] + N ser AGY + [N arg (CGY) • 3] + [N arg (CGR) • 4] + [N arg (AGR) • 2] = (10 + 9 + 8 + 7 + 4) • 3 + (15 • 2) + 12 + 13 + 7 + 8 + 0 + 15 + 7 + 5 + 2 + (7 • 3) + (4 • 4) + (12 • 2) + (10 • 3) + 6 + (3 • 3) + (8 • 4) + (2 • 2) = 355.

Подсчет возможного количества терминирующих мутаций (М nonsense) проводили с помощью матемитического выражения (3)
M nonsense = N glu + N gln + N cys + N lys + N gly (GGA) + N arg (CGA) + N arg (AGA) + N leu (TTG) + N ser (TCG) + [N trp + N tyr + N leu (TTA) + n ser (TCA)] • 2 = 12 + 7 + 0 + 15 + 4 + 7 + 2 + 1 + 0 + (0 + 5 + 11 + 4) • 2 = 88,
а подсчет возможного количества мутаций с изменением смысла (М missense) - с помощью математического выражения (4)
М missense = М _общ - (М silent + М nonsense) = 1611 - (355 + 88) = 1168.

Таким образом, используя предложенный способ определения возможного количества точечных мутаций в кодирующей части гена реально провести оценку мутагенного воздействия различных физических и химических факторов на генетический материал (ДНК и РНК) живых организмов. Представленное изобретение может быть использовано в различных областях биологии, в здравоохранении, сельском хозяйстве, а также в экологии для оценки воздействия опасных для жизни мутагенов окружающей среды обитания. Перспективное применение данное изобретение найдет в медицинской практике для точной оценки спектра мутаций в генах человека, обусловливающих наследственные заболевания человека. Данное изобретение не имеет аналогов.

Источники информации
1. Giannelli F., Green P.M., Sommer S.S., Poon M.C., Ludwig M., Schwaab R. , Reitsma P.M., Gossens M., Yoshioka A., Figueriredo M.S., Brownlee G.G. Nucleic acid res., 1998, v.26, p.265-285.

2. Yoshitake S. , Schach B.G., Foster D.C., Davie E.W., Kurachi K. Biochemistry, 1985, v.24, p.3736-3750.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики и может использоваться в различных областях биологии и медицины для подсчета теоретически возможного количества точечных мутаций. Для определения возможного количества точечных мутаций в кодирующей части гена определяют количество аминокислотных остатков каждой аминокислоты в белке, синтезируемом кодирующей частью гена, а затем находят общее возможное количество мутаций из математического выражения М общ=N а.а.•9, где М общ - возможное общее количество мутаций в гене; N а.а. - общее количество аминокислотных остатков в белке. Используя предложенный способ возможно провести оценку мутагенного воздействия различных физических и химических факторов на генетический материал (ДНК и РНК) живых организмов. 4 ил., 1 табл.

Способ определения возможного количества точечных мутаций в кодирующей части гена, включающий определение количества мутаций с изменением смысла, нейтральных мутаций и терминирующих мутаций, отличающийся тем, что дополнительно определяют количество аминокислотных остатков каждой аминокислоты в белке, синтезируемом кодирующей частью гена, и общее количество аминокислотных остатков в белке, а возможное общее количество мутаций находят из математического выражения (1)
М_общ= N а. а. •9, (1)
где М_общ - возможное общее количество мутаций в гене;
N а. а. - общее количество аминокислотных остатков в белке,
возможное количество нейтральных (или молчащих) мутаций находят из математического выражения (2):
M silent = [N gly + N ala + N val + N thr + Npro] • 3 + [N ile • 2] + N glu + N asp + N gln + N asn + N cys + N lys + N phe + N tyr + N his + [N leu (CNY) • 3] + [N leu (CTR) • 4] + [N leu (TTR) • 2] + [N ser (TCZ) • 3] + N ser AGY + [N arg (CGY) • 3] + [N arg (CGR) • 4] + [N arg (AGR) • 2] , (2)
где M silent - возможное количество молчащих мутаций;
N - количество остатков конкретной аминокислоты в белке,
возможное количество терминирующих мутаций находят из математического выражения (3)
M nonsense = N glu + N gln + N cys + N lys + N gly (GGA) + N arg (CGA) + N arg (AGA) + N leu (TTG) + N ser (TCG) + [N trp + N tyr + N leu (TTA) + N ser (TCA)] • 2, (3)
где M nonsense - возможное количество терминирующих мутаций;
N - количество остатков конкретной аминокислоты в белке,
а возможное количество мутаций с изменением смысла находят из математического выражения (4)
М missense = M_общ - (М silent + M nonsense), (4)
где М missense - возможное количество мутаций с изменением смысла;
М_общ - возможное общее количество мутаций;
М silent - возможное количество молчащих мутаций;
М nonsense - возможное количество терминирующих мутаций.