Ассоциированная вакцина против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек Российский патент 2024 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, разработке ассоциированной вакцины против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита.

Для уменьшения количества случаев заболевания вирусными болезнями среди кошек наиболее эффективно себя показала профилактическая вакцинация. Она оправдана с точки зрения экономических затрат, улучшения эпизоотологической обстановки и непосредственно состояния здоровья животных. Среди инфекционных болезней кошек особое значение представляют панлейкопения, калицивироз и вирусный ринотрахеит. В последние годы разработано и повсеместно применяется значительное количество отечественных и импортных биопрепаратов для кошек. На основе всесторонне изученных штаммов возбудителей этих болезней в отечественной и зарубежной практике были созданы ассоциированные вакцины, которые в настоящее время выпускает 1 предприятие в РФ и множество предприятий за рубежом.

По данным Центра Ветеринарии за 2020-2022 гг.эпизоотическая ситуация по трем данным вирусным болезням кошек на территории РФ выглядит следующим образом: лидирующее место занимает калицивироз - его регистрировали в 38,17% случаях, на втором месте вирусный ринотрахеит -35,23%, на третьем месте панлейкопения - 26,60%. Данные болезни встречаются повсеместно у кошек разных пород и возрастов [2, 3].

Для профилактики и предотвращения распространения вирусов панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита среди кошек разрабатывают и используют культуральные живые и инактивированные вакцины из различных штаммов. При разработке вакцин особое внимание уделяют безопасности готовой продукции и напряженности иммунитета. Для формирования более напряженного и продолжительного иммунитета у вакцинированных животных в качестве неспецифических стимуляторов иммуногенеза используют широкий спектр адъювантов, в частности, гидрат окиси алюминия (ГОА) - при изготовлении сорбированных вакцин [4, 5].

Применение ассоциированных вакцин - оптимальное решение не только для кошек, содержащихся индивидуально, но особенно для использования в питомниках, приютах, где скученное содержание животных способствует возникновению и распространению инфекций. В целом применение ассоциированных вакцин, включающих несколько иммуногенов, позволяет снизить стрессовые ситуации у прививаемых животных, создать напряженный иммунитет в сжатые сроки и уменьшить трудозатраты [4].

Панлейкопения кошек (FPV, feline panleukopenia virus) - высококонтагиозное заболевание вирусной этиологии, характеризующееся лихорадкой, острым геморрагическим энтеритом, лейкопенией, обезвоживанием организма и высокой летальностью (до 90%) [2]. Возбудителем панлейкопении кошек является безоболочечный вирус с одноцепочечной ДНК и икосаэдрическим капсидом, принадлежащий к семейству Parvoviridae, роду Protoparvovirus, виду Carnivore protoparvovirus 1 [6].

Наиболее благоприятны для репродукции возбудителя FPV митотически активные клетки костного мозга, лимфатической ткани и эпителиальные клетки крипт тонкого кишечника [7]. Вирус выделяется со всеми секретами и экскретами животного во время активной стадии инфекции, но максимальная концентрация возбудителя достигается в фекалиях [2]. Обычно выделение вируса происходит около двух дней после проявления клинических признаков, однако FPV способен выделяться с фекалиями и мочой до 6 месяцев после выздоровления [8]. Факторами передачи могут являться контаминированные предметы, обувь, одежда, поэтому риск заражения домашних невакцинированных кошек, не имеющих свободного доступа на улицу, остается высоким.

FPV известен с начала 20 века и на протяжении последующих десятилетий сохранял определенную генетическую стабильность [9]. Но в 1970-х годах был зарегистрирован возбудитель парвовирусного энтерита собак (CPV-2 - Canine parvovirus-2), эволюционировавший из FPV, приобретя около 6 аминокислотных изменений в капсиде, которые позволили вирусу также заражать собак [10]. В то время как собаки восприимчивы только к оригинальному CPV-2 и всем его вариантам, кошки восприимчивы как к вариантам FPV, так и к вариантам CPV-2 [7]. Данная особенность демонстрирует, что, несмотря на общую консервативность ДНК-содержащих вирусов, данный возбудитель меняется, и существует риск заражения других видов животных [11]. Согласно руководству по вакцинации собак и кошек Международной ветеринарной ассоциации мелких домашних животных (WSAVA - the World Small Animal Veterinary Association), вакцина против вируса панлейкопении кошек относится к базовым («соге») вакцинам, которые должны получать все кошки независимо от обстоятельств (они обеспечивают защиту от заболеваний, опасных для жизни животных и распространенных по всему миру) [12]. Несмотря на широкое распространение и значительный выбор вакцин для кошек, панлейкопения по-прежнему остается значимой болезнью. В связи с этим вопрос о необходимости разработки средств вакцинопрофилактики, обеспечивающих надежную защиту от новых штаммов панлейкопении кошек, остается актуальным.

В настоящее время наиболее известны следующие производственные штаммы вируса панлейкопении кошек, которые применяются для производства средств специфической профилактики против данной болезни:

- Штамм «РЫ IV» [13];

- Штамм «MW-1» [14];

- Штамм «LR 72» [15];

- Штамм «Snow Leopard» [16];

- Штамм «Мяу» [2].

Штаммы «PLI IV», «MW-1», «LR 72», «Snow Leopard» входят в составы импортных вакцин против болезней кошек, которые созданы на основе штаммов, имеющих наибольшее распространение на территории стран-производителей. Штамм «Мяу» используется для производства вакцин отечественным производителем. Тенденция к ежегодному росту случаев заболеваний панлейкопенией кошек может свидетельствовать о недостаточной эффективности зарубежных и отечественных вакцин против штаммов, циркулирующих в популяции кошек на территории РФ. Кроме того, данные вакцины имеют высокую стоимость.

Вирусный геном представлен одноцепочечной ДНК без оболочки. Форма вирионов полиморфная, преобладает сферическая. Внутренняя часть вириона представляет собой закрученную спиралью нить рибонуклеопротеида, который окружен оболочкой с радиально расположенными отростками. Вирус однороден в иммунобиологическом отношении. Размер вириона колеблется от 115 до 160 нм [2].

Вирус сохраняет определенную степень генетической стабильности [17], однако молекулярные исследования не проводились в течение нескольких десятилетий, поэтому антигенные свойства циркулирующих в настоящее время штаммов недостаточно хорошо известны. Кроме того, генетическое и иммунологическое родство между полевыми штаммами FPV и вакцинными штаммами не оценивалось, хотя все известные вакцины производятся с использованием давно известных штаммов FPV. Несколько исследований продемонстрировали, что некоторые вспышки панлейкопении у кошек вызваны не классическими штаммами FPV, а антигенными вариантами собачьего CPV-2 [18].

Калицивироз кошек {калицивирусная инфекция кошек, Feline calicivirus, FCV) - высококонтагиозное вирусное заболевание, характеризующееся преимущественно поражением слизистой ротовой полости и верхних дыхательных путей [2]. Вирус распространен повсеместно и поражает домашних кошек всех пород и возрастов, а также зоопарковых и диких представителей семейства кошачьих. По литературным данным, FCV обнаруживали в 18-30% случаев заболеваний, связанных с поражением верхних дыхательных путей [19, 20, 21]. Также широко распространено вирусоносительство (до 75%), особенно среди бродячих кошек [2]. Помимо часто встречающихся симптомов язвенного стоматита, ринита и конъюнктивита, заболевание может проявляться хромотой, отеками головы и конечностей, пневмонией, некрозами языка и неба, поражением желудочно-кишечного тракта [22, 23]. В различных источниках описана системная инфекция, вызывающая гибель до 60% заболевших животных [19]. FCV характеризуется высокой степенью изменчивости и большим антигенным разнообразием штаммов, что значительно снижает эффективность существующих вакцин.

Возбудитель заболевания Feline calicivirus (FCV), относится к семейству Caliciviridae, роду Vesivirus.

В настоящее время известны следующие штаммы вируса калицивироза кошек, которые применяются для диагностики FCV, а также производства вакцин против данного заболевания:

- Штамм «F-9» [24].

- Штамм «Ларе» [25].

- Штамм «Эшли» [26].

Генетически штаммы FCV принадлежат к одной разнообразной геногруппе, однако, в Восточной Азии была описана вторая геногруппа. Филогенетический анализ обычно приводит к «звездообразной» филогении. Это генетическое разнообразие сопровождается антигенным разнообразием, хотя перекрестная реактивность достаточна, чтобы все изоляты считались принадлежащими к одному серотипу. При исследовании пространственного и временного распределения штаммов FCV была описана очень высокая генетическая и антигенная сложность штаммов FCV, при этом в популяции кошек циркулирует множество различных штаммов FCV, и ни один отдельный полевой штамм не преобладает в ней [23, 25].

Штамм «F-9» входит в состав импортных ассоциированных вакцин против инфекционных болезней кошек, данные о нем представлены в GenBank, однако, исследования показывают, что с момента его выделения, вирус калицивироза претерпел значительные генетические изменения, и вакцины на основе штамма «F-9» (и альтернативного ему «F-255») не могут обеспечить надежную защиту от заражения новыми штаммами [19]. Кроме того, на территории РФ импортные препараты, изготовленные на основе этого штамма имеют высокую стоимость.

Штамм калицивирусной инфекции «Эшли» запатентован в 2016 г. для изучения противовирусной активности препаратов в отношении возбудителя калицивироза кошек и не применяется для изготовления вакцин [26].

Вирусный ринотрахеит кошек {feline viral rhinotracheitis, FHV-1, FHV, инфекционный ринотрахеит кошек) - контагиозное вирусное заболевание, характеризующееся поражением верхних дыхательных путей, конъюнктивитами и кератитами [2, 3].

Возбудителем вирусного ринотрахеита кошек является вирус, принадлежащий к семейству Herpesviridae, роду Varicellovirus, виду Alphaherpesvirus 1 (FHV-1 - Feline alphaherpesvirus-1) [27].

FHV-1 был впервые выделен в США в 1957 году от кошки с симптомами заболевания верхних дыхательных путей [28].

Вирусный ринотрахеит зарегистрируется у многих представителей семейства кошачьих, таких как европейских дикие кошки (Felis silvestris silvestris), песчаные кошки (Felis margarita), леопардовые кошки (Felis bengalensis), гепарды (Acinonyx jubatus), горные львы (Puma concolor), оцелоты (Leopardus pardalis) и др. [16]. К инфекции восприимчивы как взрослые кошки всех пород, так и котята, но у молодых животных, зараженных FHV-1, нередок летальный исход в результате осложнения пневмонией [29]. Также в литературе описаны случаи развития менингоэнцефалита в результате заражения FHV-1 [3, 30]. После острой фазы заболевание часто переходит в латентную форму с пожизненным вирусоносительством [31]. Исследователи из Австралии определили серопревалентность FHV-1 на уровне 11-17% у диких представителей семейства кошачьих и 37% у домашних кошек, однако, по другим оценкам около 90% кошек считаются серопозитивными по отношению к FHV-1, из них 45%) выделяют вирус в течение всей жизни [28, 32].

В настоящее время известны следующие штаммы вируса инфекционного ринотрахеита кошек, которые применяются для диагностики FHV-1, а также производства вакцин против данного заболевания:

- Штамм «F-2» [13].

- Штамм «G 2620А» [14].

- Штамм «FVRm» [16].

- Штамм «Гранд» [33].

Все штаммы FHV-1 принадлежат к одной серогруппе, хотя для некоторых штаммов были зафиксированы незначительные генетические изменения [2, 28, 34]. Генетически и антигенно FHV-1 имеет сходство с герпесвирусом собак 1-го типа (CHV-1), а также герпесвирусом тюленей 1-го типа (PhHV-1). Есть сообщения о перекрестной защите между FHV-1 и PhHV-1 [2].

К настоящему времени известно множество ассоциированных вакцин российского и зарубежного производства различной валентности против панлейкопении, калицивироза и инфекционного ринотрахеита кошек.

В настоящее время имеется огромный выбор вакцин отечественного и импортного производства.

Из российских вакцин на рынке предлагается: Мультифел - 4 - вакцина из инактивированных формалином производственных штаммов вирусов панлейкопении, инфекционного ринотрахеита, калицивируса кошек, Chlamydia psittaci и адъюванта в количестве 10% от объема вакцины [42].

Из зарубежных вакцин на рынке предлагается:

• Фелоцел (Felocell) CVR-C, производитель Zoetis LLC 601 W (США) -лиофилизированная масса и раствор для инъекций. Вакцина изготовлена из аттенуированных вирусов ринотрахеита (штамм FVRm - 10^5,7 ЭИД50), калицивирусной инфекции (штамм F-9 - 10^6,2 ЭИД₅₀), панлейкопении кошек (штамм Snow Leopard - 10^3,0 ЭИД₅₀), Chlamydia psittacci (штамм Baker) с добавлением гентамицина в качестве консерванта и стабилизатора (в состав которого входят: казеин, желатин, сахароза) [43];

• Пуревакс (Purevax) RCPCh - содержит в своем составе: аттенуированный штамм вируса инфекционного ринотрахеита кошек FFTV F-2, комбинацию двух инактивированных штаммов вируса калицивироза кошек FCV 431 и FCV G1, аттенуированный штамм вируса панлейкопении кошек PLIIV и аттенуированный штамм хламидиоза кошек 905 [44];

• Лейкофелиген (Leucofeligen) - двухкомпонентная вакцина. Первый компонент содержит аттенуированный вирус панлейкопении (штамм LR 72 FPV, мин. 10^3,7 - 10⁴ TCID₅₀/мл); калицивирус (штамм F-9 FCV, мин. 10^4,6 - 10^6,1 ТСID₅₀/мл); вирус ринотрахеита (штамм F2 мин. 10⁵ - 10^6,6 TCID₅₀/мл). Второй компонент содержит инактивированный вирус лейкемии кошек (очищенный белок р45 антиген > 102 мкг/мл), и вспомогательные компоненты: гидроксид алюминия, очищенный экстракт мыльного дерева и изотонический раствор до 1 мл [45];

• Квадрикат (Qadricat) - вакцина против панлейкопении, респираторных вирозов и бешенства кошек состоит из двух компонентов, которые смешиваются непосредственно при применении:

- лиофилизированной вакцины «Рабиффа-Фелиниффа», представляющей собой смесь аттенуированного вируса панлейкопении кошачьих с инактивированным вирусом бешенства - это сухая однородная масса белого цвета в виде таблетки;

- жидкой вакцины «Корифелин», представляющей собой масляный раствор гликопротеиновой фракции кошачьего герпесвируса с очищенным антигеном кошачьего калицивируса. По внешнему виду это маслянистая жидкость молочно-белого цвета [46];

На данный момент эта вакцина не выпускается.

• Нобивак Трикет Трио (Nobivac Tricat Trio) - сухая живая вакцина получена из культуральной жи дкости перевиваемой линии клеток FEF, инфицированных аттенуированными (ослабленными) штаммами вирусов. В 1 мл вакцина содержит 5,2 lg БОЕ единиц вируса ринотрахеита штамма G 2620А, 4,6 lg БОЕ единиц калицивируса кошек штамма F-9 и 4,3 lg ТЦД₅₀ единиц вируса панлейкопении кошек штамма MW-1, а также стабилизаторы: гидролизованный желатин, сорбитол, панкреатический гидролизат казеина и буферный раствор гидрофосфата калия дигидрата [47];

• Нобивак Дукет (Nobivac Ducat) - сухая живая вакцина против ринотрахеита и калицивироза кошек. Вакцина изготовлена из культуральной жидкости перевиваемой линии клеток FEF, инфицированной вирусами ринотрахеита (штамм G 2620А) и калицивироза (штамм F9) кошек, с добавлением стабилизаторов (гидролизованного желатина, сахарозы) и натрия гидрофосфата дигидрата [48];

• Феловакс (Fel-O-Vax) - вакцина содержит инактивированный вирус панлейкопении кошек, два штамма калицивируса кошек, инактивированный вирус ринотрахеита кошек и Chlamydia psittaci. В качестве консервантов содержит тимеросал, неомицин, полимиксин В и амфотерицин В [49];

• Биофел PCHR (Biofel PCHR) - вакцина для профилактики панлейкопении, калицивирусной, герпесвирусной инфекций и бешенства кошек. Вакцина изготовлена из инактивированных штаммов вируса панлейкопении (штамм FPV), калицивируса (штамм FCV F), герпесвируса (штамм FITV-1) и вируса бешенства (штамм Vnukovo-32), с добавлением вспомогательных веществ (тиомерсал, масляный адъювант, эмульгаторы: производные сорбита, глицерида, глицерола) 10% [50].

• Биофел РСН (Biofel РСН) - вакцина для профилактики панлейкопении, калицивирусной, герпесвирусной инфекций кошек. Вакцина изготовлена из инактивированных штаммов вируса панлейкопении (штамм FPV), калицивируса (штамм FCV F), герпесвируса (штамм FITV-1) и вируса бешенства (штамм Vnukovo-32), с добавлением вспомогательных веществ (тиомерсал, масляный адъювант, эмульгаторы: производные сорбита, глицерида, глицерола) 10% [51].

Наиболее близкими по составу антигенов вирусов инфекционных болезней являются следующие вакцины: Фелоцел и Нобивак Трикет Трио.

Существенным недостатком данных вакцин является то, что они созданы на основе производственных штаммов вирусов, полученных за рубежом и длительное время не актуализированных, а также использование живых вирусов, что приводит к выделению вирусных частиц животными в течение некоторого времени. Это может привести к заражению животных, бессимптомному вирусоносительству и, возможно, возобновлению патогенных свойств ослабленных штаммов вирусов.

Все известные комбинированные поливалентные ассоциированные вакцины содержат в своем составе живые аттенуированные вирусы. Они характеризуются недостаточной противоэпизоотической эффективностью, обусловленной тем, что используемые для изготовления поливалентной вакцины штаммы обладают антигенными и иммунобиологическими отличиями по сравнению с аналогичными характеристиками возбудителей, циркулирующих на территории России и стран СНГ.

Поэтому проблема получения высокоэффективной ассоциированной вакцины против основных возбудителей вирусных болезней кошек остается актуальной и является основным направлением исследований по созданию искомого препарата.

В связи с этим задачей изобретения является создание безопасной и высокоиммуногенной вакцины против основных инфекционных болезней кошек, содержащей сбалансированные в антигенном и иммуногенном отношении вирусные антигены, обеспечивающих формирование устойчивого иммунитета по отношению к вирусу панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек.

Ассоциированной вакцины против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек «Карнифел РСН» в РФ не зарегистрировано, несмотря на то, что данные болезни являются для кошек высококонтагиозными, приводящими к гибели.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная совокупность признаков, в частности, состав компонентов -штаммы микроорганизмов, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала ассоциированных вакцин против основных возбудителей инфекционных болезней кошек, в повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности вакцины, а также в усилении напряженности иммунитета у вакцинированных животных за счет получения компонентов вакцины с полным спектром антигенов.

Технический результат изобретения достигается путем использования в составе вакцины новых производственных штаммов вируса панлейкопении, двух штаммов вируса калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек с высокой антигенной и иммуногенной активностью, и образования синергетической композиции поливалентной ассоциированной вакцины при объединении антигенов вирусов новых производственных штаммов.

Технический результат изобретения также достигается путем использования в составе вакцины адъюванта, который усиливает воздействие фармацевтической субстанции (антигенов) на иммунную систему вакцинируемых животных, инициируя каскад иммунных реакций и обеспечивая выработку напряженного иммунитета.

Указанный технический результат достигнут созданием ассоциированной вакцины против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек, охарактеризованной нижеуказанной совокупностью признаков.

Сущность изобретения заключается в следующем: предлагаемая ассоциированная вакцина против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек содержит в качестве активного вещества смесь из:

• инактивированного очищенного антигенного материала штамма «Шеба» панлейкопении кошек;

• инактивированного очищенного антигенного материала штамма «Перс» вируса калицивироза кошек;

• инактивированного очищенного антигенного материала штамма «Фауна» вируса калицивироза кошек;

• инактивированного очищенного антигенного материала штамма «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек;

взятых в эффективных количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность в организме кошки после введения ей целевого препарата. В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина содержит адъювант гидроокись алюминия (производство «ВНИИЗЖ»).

В предлагаемой вакцине активное вещество и целевая добавка объединены в соотношении: об .%: 90,0÷10,0.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина ассоциированная против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек «Карнифел РСН»;

2. Активное вещество в виде смеси из инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Шеба» вируса панлейкопении, семейства Parvoviridae, рода Protoparvovirus, вид Carnivore protoparvovirus 1, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №455 - деп / 23-5 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»; из инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Перс» вируса калицивироза кошек, семейства Caliciviridae, рода Vesivirus, вида Feline calicivirus, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №458 - деп / 23-8 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»; из инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Фауна» вируса калицивироза кошек, семейства Caliciviridae, рода Vesivirus, вида Feline calicivirus, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №471 - деп / 23-21 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»; из инактивированного очищенного антигенного материала из штамма «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита семейства Herpesviridae, рода Varicellovirus, вида Alphaherpesvirus I, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №457 - деп / 23-7 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь из инактивированных очищенных антигенных материалов из штамма «Шеба» вируса панлейкопении, штаммов «Перс» и «Фауна» вируса калицивироза и штамма «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек (FPV), полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, в эффективном количестве.

2. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек (FPV), полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой вирусную суспензию с гемагглютинирующей активностью 9,33±0,57 log₂ НА, количестве 30,0 об. %.

3. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Перс» вируса калицивироза кошек (FCV), полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой суспензию в эффективном количестве.

4. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Перс» вируса калицивироза кошек (FCV), полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой вирусную суспензию с инфекционной активностью 7,75±0,25 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве 15,0 об. %.

5. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Фауна» вируса калицивироза кошек (FCV), полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой суспензию в эффективном количестве.

6. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Фауна» вируса калицивироза кошек (FCV), полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой вирусную суспензию с инфекционной активностью 7,75±0,25 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве 15,0 об. %.

5. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек (FHV), полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, в эффективном количестве.

6. Инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек (FHV), полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой вирусную суспензию с инфекционной активностью 6,5±0,25 lg ТЦД₅₀/cм³, в количестве 30,0 об. %.

7. Из целевых добавок вакцина содержит гидроокись алюминия.

8. 3%-ный гель гидроокиси алюминия.

9. Вакцина содержит 3%-ный гель гидроокиси алюминия в количестве не менее 10,0 об. %.

10. Смесь из инактивированных и очищенных антигенных материалов из штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек, из штамма «Перс» вируса калицивироза кошек, из штамма «Фауна» вируса калицивироза кошек, из штамма «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек и целевую добавку: адъювант гидроокись алюминия в количестве (об. %):

В результате проведенных исследований авторы определили важнейшие технологические показатели, позволившие создать препарат, в котором отсутствует конкуренция между антигенами, входящими в состав предлагаемой вакцины, а его иммуногенные свойства были сравнимы с таковыми после применения монопрепаратов. Высокий иммунологический эффект в отношении специфических антигенов, входящих в состав вакцины, был достигнут путем получения вирусных компонентов в составе вакцины, обладающих безвредностью, иммуногенностью и антигенной активностью, а также подобран вариант оптимального их соотношения в составе вакцины, обеспечивающих выработку защитного уровня антител, т.е. создание напряженного иммунитета к вирусным болезням у кошек.

Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вирусов панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек, циркулирующих на территории Российской Федерации.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения достигается за счет того, что для инактивации вируссодержащих материалов используют гидроокись алюминия (ГОА) производства «ВНИИЗЖ», что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенных материалов, а также доступно на территории РФ на данный момент.

Дополнительный технический результат предлагаемого изобретения достигается за счет того, что в состав ассоциированной вакцины входят новые производственные штаммы вируса панлейкопении, вирусного ринотрахеита и два штамма калицивироза кошек.

Сущность изобретения отражена на графических материалах:

Фиг. 1 - Дендрограмма, отражает филогенетическое взаимоотношения штаммов FPV «Шеба» с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса панлейкопении кошек. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностях VP2-гена.

Фиг. 2 - Дендрограмма, отражает филогенетическое взаимоотношения штаммов FCV «Перс» и «Фауна» с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса калицивироза кошек. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностях гена, кодирующего белок VP₂.

Фиг. 3 - Дендрограмма, отражает филогенетическое взаимоотношения штаммов FHV «Лавр» с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса инфекционного ринотрахеита кошек. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностях гена, кодирующего белок гликопротеин Е.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 - Последовательность нуклеотидов VP₂-гена ДНК вируса панлейкопении кошек штамма «Шеба» (Felinepanleukopenia Virus).

SEQ ID NO:2 - Последовательность аминокислот VP₂ белка ДНК вируса панлейкопении кошек штамма «Шеба» (Feline panleukopenia Virus).

SEQ ID NO: 3 - Последовательность нуклеотидов VP₂ гена штамма «Перс» вируса калицивироза кошек (Feline calicivirus).

SEQ ID NO: 4 - Последовательность аминокислот белка, который кодируется VP₂ геном, штамма «Перс» вируса калицивироза кошек (Feline calicivirus).

SEQ ID NO: 5 - Последовательность нуклеотидов VP₂ гена штамма «Фауна» вируса калицивироза кошек (Feline calicivirus).

SEQ ID NO: 6 - Последовательность аминокислот белка, который кодируется VP₂ геном, штамма «Фауна» вируса калицивироза кошек (Feline calicivirus).

SEQ ID NO: 7 - Последовательность нуклеотидов гена гликопротеина Е кДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек (Feline alphaherpesvirus-1) штамма «Лавр»;

SEQ ID NO: 8 - Последовательность аминокислот гликопротеина Е кДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек (Feline alphaherpesvirus-1) штамма «Лавр».

Исходный вирус для получения штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек получен из проб патологического материала (тонкий отдел кишечника), полученного от котенка из центра животных ВООО ЦЖ «Валента» г. Владимира Владимирской области РФ в 2021 г. Методом предельных разведений был адаптирован к репродукции в перевиваемой культуре клеток почки кошки (КК CrFK).

Штамм «Шеба» вируса панлейкопении кошек депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №455 - деп / 23-5 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм «Шеба» вируса панлейкопении кошек характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Вирус панлейкопении кошек обладает морфологическими признаками, характерными для представителей парвовирусов: безоболочечные вирусы с одноцепочечной ДНК и икосаэдрическим капсидом.

Антигенные свойства

Антигенно FPV родственен парвовирусу песцов (BFP), вирусу энтерита норок (МЕУ) и парвовирусу собак (CPV-2) [2]. Антитела, которые образуются у переболевших животных в сыворотках крови, выявляются в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Гено- и хемотаксономические характеристики

FPV представляет собой одноцепочечный ДНК-вирус с геномом объемом 5,1 кб, кодирующим 2 основных гена, неструктурные (NS) и структурные белковые гены. Ген NS кодирует белки NS1 и NS2, участвующие в репликации ДНК, сборке капсида и внутриклеточном транспорте, тогда как структурный ген кодирует белки VP1 и VP2 вирусного капсида. Вирусный капсид состоит из 60 белковых субъединиц (~10% VP1 и 90% VP2), расположенных в икосаэдрической симметрии.

Была проведена генетическая идентификация полученного вируса и сравнительный анализ последовательности к ДНК. Использовали обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР). Для идентификации и филогенетического анализа осуществляли секвенирование.

Редактор выравнивания последовательностей BioEdit использовался для анализа необработанных последовательностей. Выравнивания, содержащие полногеномные последовательности, были построены с использованием программы Clustal_W. Эволюционная история была выведена с использованием критерия максимального правдоподобия, основанного на 3 параметрах классической модели Tamura. Дерево было нарисовано в масштабе, с длиной ветвей, измеренной в количестве замен на сайт. Эволюционный анализ был проведен в MEGA7. Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с использованием Clustal X.

Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей VP₂ гена ДНК вируса панлейкопении кошек (FPV) (был взят участок длиной 664 п. н.). Штамм «Шеба» имеет большое количество нуклеотидных отличий от других заявленных штаммов (степень сходства не более 39%), при этом относится к геногруппе 1 вида Carninove protoparvovirus (Фиг. 1).

Биотехнологические характеристики

Штамм «Шеба» вируса панлейкопении кошек репродуцируется в перевиваемой культуре клеток почки кошки (CrFK), а также в первично-трипсинизированной и субкультуре клеток почки котенка (ПК). Инфицированная вирусом панлейкопении культура клеток (CrFK или ПК) инкубируется в термостате при температуре (37,5±0,5)°С в течение 5 суток. Репродукция вируса в культуре клеток ПК и CrFK не сопровождается специфическим цитопатическим действием. Биологические свойства характеризовали путем определения гемагглютинирующей активности вируса каждого пассажа методом РГА. При культивировании вируса гемагглютинирующая активность штамма «Шеба» составляет не ниже 9 log₂ НА. Исходные характеристики сохраняются при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Устойчивость к внешним факторам

Вирус высокоустойчив к фенолу, эфиру, хлороформу, кислотам, трипсину, 0,2%-ному раствору дезоксихолата натрия, рН 3,0. При температуре 4-25°С сохраняется до 13 месяцев. При температуре 60°С погибает за 60 мин. Хорошо сохраняется в 50%-ном глицерине с рН 7,2. Переносит двукратное размораживание и оттаивание.

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Безвреден для кроликов, морских свинок, белых мышей при внутримышечном и подкожном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемой культуре клеток CrFK.

Для получения антигенного материала в культуру клеток CrFK, выращенную в культуральных флаконах, предварительно слив с них ростовую среду, вносят вируссодержащий материал с гемагглютинирующей активностью не ниже 7 log₂ НА. Флаконы помещают на один час в термостат при температуре (37,0±0,5)°С для контакта клеток культуры с вирусом. После этого вносят поддерживающую среду ПСС с добавлением 2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубируют при (37,0±0,5)°С в течение 5 дней, затем замораживают при минус (45,0±5,0)°С. Стерильный инфицированный монослой дезагрегировал с рабочей поверхности флаконов путем его разморозки при температуре (20,0±2)°С и периодического встряхивания. По окончании разморозки интенсивным встряхиванием остатки монослоя удаляют с рабочей поверхности, затем, соблюдая условия асептики, инфицированную суспензию собирают в общую емкость. Из собранного материала отбирают пробу для контроля. Контроль посевного материала штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек осуществляют по показателю отсутствия контаминации грибами, бактериями и микоплазмами. Контроль контаминации грибами и бактериями посевного материала штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек проводили по ГОСТ 28085 [35]. Контроль контаминации микоплазмами осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XIV, том II, с. 2997-3008 (ОФС.1.7.2.0031.15) [36].

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами - штамм «Шеба» не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Контроль гемагглютинирующей активности штамма «Шеба» FPV проводили согласно «Методическим рекомендациям по титрованию возбудителя панлейкопении кошек» [38]. Сущность метода заключается в способности FPV гемагглютинировать эритроциты свиньи. За титр вируса принимали его наибольшее разведение, вызывающее полную агглютинацию эритроцитов. Гемагглютинирующая активность вируса до инактивации составила 9,33±0,57 log₂ HA в РГА.

Для инактивации штамма «Шеба» FPV использовали аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляли в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025% с экспозицией 24 часов при температуре (37,0±0,5)°С. По окончании инактивации полученный материал помещали в холодильник при температуре (2-8)°С.

Инактивированный очищенный вируссодержащий материал штамма «Шеба» FPV с гемагглютинирующей активностью не ниже 9 log₂ НА использовали для изготовления вакцины «Карнифел РСН».

Изолят вируса калицивироза кошек, послуживший источником для получения штамма «Перс» был выделен из патологического материала, полученного от кота, поступившего на лечение в ветеринарную клинику ВООО Центра животных «Валента» г. Владимир, в 2021 г.

Изолят вируса калицивироза кошек, послуживший источником для получения штамма «Фауна» был выделен из патологического материала из проб клинического материала (смывы с ротовой полости), полученного от кошки, поступившей на лечение в ветеринарную клинику «Фауна» г. Вологда Вологодской области РФ.

Для получения штамма «Перс» вируса калицивироза кошек, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали перевиваемую культуру клеток почки кошки (CrFK). В результате проведения серии последовательных пассажей на данной культуре клеток из ранее выделенного изолята был получен штамм «Перс» вируса калицивироза кошек, имеющий стабильные биотехнологическими свойства и пригодный для использования при проведении лабораторных исследований и изготовления диагностических препаратов и препаратов специфической профилактики данного заболевания. Штамм адаптирован к перевиваемой культуре клеток почки кошки (CrFK), что позволяет в промышленных масштабах получать вирусный материал штамма «Перс» вируса калицивироза кошек с титрами инфекционной активности от 7,75 до 8,25 lg ТЦД₅₀/см³.

Для получения штамма «Фауна» вируса калицивироза кошек, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали перевиваемую культуру клеток почки кошки (CrFK). В результате проведения серии последовательных пассажей на данной культуре клеток из ранее выделенного изолята был получен штамм «Фауна» вируса калицивироза кошек, имеющий стабильные биотехнологическими свойства и пригодный для использования при проведении лабораторных исследований и изготовления диагностических препаратов и препаратов специфической профилактики данного заболевания. Штамм адаптирован к перевиваемой культуре клеток почки кошки (CrFK), что позволяет в промышленных масштабах получать вирусный материал штамма «Фауна» вируса калицивироза кошек с титрами инфекционной активности от 7,75 до 8,25 lg ТЦД₅₀/cм³.

Штаммы «Перс» и «Фауна» вируса калицивироза кошек характеризуются следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штаммы «Перс» и «Фауна» вируса калицивироза кошек относятся к семейству Caliciviridae, роду Vesivirus, виду Feline calicivirus и обладают морфологическими признаками, характерными для представителей калицивирусов: диаметр вирионов составляет 37-40 нм, вирионы без суперкапсидной оболочки, кубического типа симметрии, состоят из 32 капсомеров.

Антигенные свойства

В антигеном и генетическом отношении FCV отличается от калицивируса собак [2]. Все циркулирующие штаммы представляют собой единый серотип. У переболевших кошек в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в реакции нейтрализации (РН). Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в РН в культуре клеток CrFK.

Гено- и хемотаксономические характеристики Геном представляет собой 7,7 кб одноцепочечной РНК положительной полярности с тремя открытыми рамками считывания (ORF). ORF1 кодирует неструктурные белки, ORF₂ кодирует основной капсидный белок VP₁, a ORF3 кодирует второстепенный капсидный белок VP₂. ORF2 разделен на шесть областей (A-F) и обычно используется для филогенетической дифференцировки изолятов FCV. Геномные области А, В, D и F в значительной степени консервативны, в то время как области С и Е более вариабельны. Область F ORF2 (7253-7329 п. н. и начальная область ORF3 (7465-7524 п. н.) консервативны и, следовательно, удобны для точной идентификации FCV [37]. Рекомбинация является распространенным механизмом эволюции FCV. Большинство зарегистрированных событий рекомбинации в геноме FCV происходят в генном участке VP₂, который взяли за основу дифференциации штаммов данного вируса (анализировали участок нуклеотидов с длиной 318 и.о., 106 а.о.) [20].

Биотехнологические характеристики

Штамм «Перс» вируса калицивироза кошек репродуцируется в перевиваемой культуре клеток почки кошки (CrFK). Репродукция вируса в культуре клеток CrFK сопровождается специфическим цитопатическим действием, приводящим к округлению клеток и деструкции монослоя через 24-48 ч культивирования. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток CrFK. При культивировании вирус штамма «Перс» накапливается в титре не менее 7,75±0,25 lg ТЦД₅₀/см³ и сохраняет исходные характеристики при пассировании в течение не менее 5 пассажей (срок наблюдения).

Штамм «Фауна» вируса калицивироза кошек репродуцируется в перевиваемой культуре клеток почки кошки (CrFK). Репродукция вируса в культуре клеток CrFK сопровождается специфическим цитопатическим действием, приводящим к округлению клеток и деструкции монослоя через 24-48 ч культивирования. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток CrFK. При культивировании вирус штамма «Фауна» накапливается в титре не менее 7,5±0,25 lg ТЦД₅₀/см³ и сохраняет исходные характеристики при пассировании в течение не менее 5 пассажей (срок наблюдения).

Устойчивость к внешним факторам

Вирус достаточно устойчив во внешней среде. На поверхностях при температуре (22±2)°С сохраняет активность в течение 24 ч, а при температуре 10°С и ниже - в течение 30 дней. Относительно стабилен в кислой среде при рН 4,0. Практически не чувствителен к эфиру, хлороформу. Чувствителен к формальдегиду, глутаровому альдегиду, хлорсодержащим дезинфицирующим средствам. Переносит двукратное размораживание и оттаивание.

Дополнительные признаки и свойства

Патогенность - патогенны для естественно-восприимчивых животных.

Вирулентность - вирулентны для естественно-восприимчивых животных при интраназальном заражении.

Безвредны для кроликов и белых мышей при внутримышечном и подкожном заражении.

Стабильность - сохраняют исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемой культуре клеток CrFK.

Для получения антигенного материала в культуру клеток CrFK, выращенную в культуральных флаконах, предварительно слив с них ростовую среду, вносили вируссодержащий материал в дозе 0,001 ТЦД₅₀/кл. Флаконы помещали на один час в термостат при температуре (37,0±0,5)°С для контакта клеток культуры с вирусом. После этого вносили поддерживающую среду ПСС с добавлением 2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при (37,0±0,5)°С до появления ЦПД вируса. При поражении площади монослоя не менее 80% культуральные флаконы подвергали замораживанию при температуре минус (45,0±0,5)°С. Стерильный инфицированный монослой дезагрегировали с рабочей поверхности флаконов путем его разморозки при температуре (20±2)°С и периодического встряхивания. По окончании разморозки интенсивным встряхиванием остатки монослоя удаляли с рабочей поверхности, затем соблюдая условия асептики инфицированную суспензию собирали в общую емкость. Из собранного материала отбирали пробу для контроля. Контроль контаминации грибами и бактериями посевного материала штаммов «Перс» и «Фауна» вируса калицивироза кошек проводили по ГОСТ 28085 [4]. Контроль контаминации микоплазмами осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XIV, том II, с. 2997-3008 (ОФС.1.7.2.0031.15) [36].

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами - штаммы «Перс» и «Фауна» не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Контроль инфекционной активности штаммов «Перс» и «Фауна» FCV проводили согласно «Методическим рекомендациям по титрованию вируса калицивироза микрометодом» [39]. Контроль инфекционной активности проводили в перевиваемой культуре клеток CrFK путем определения титра биологической активности штамма «Перс». Сущность титрования основана на определении цитопатогенного действия (ЦПД) вируса, которое проявлялось в культуре клеток CrFK через 48-72 ч. Титром вируса считают последнее его разведение, вызывающее 50% эффект, который рассчитывают по формуле Кербера. Инфекционная активность вируса до инактивации составила 8,33±0,57 lg ТЦД₅₀/см³. Инфекционная активность вируса до инактивации составила 8,05±0,46 lg ТЦД₅₀/см³.

Для инактивации штаммов «Перс» и «Фауна» FCV использовали аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляли в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025% с экспозицией 24 часов при температуре (37,0±0,5)°С. По окончании инактивации полученный материал помещали в холодильник при температуре (2-8)°С.

Для изготовления ассоциированной вакцины «Карнифел РСН» используют инактивированный очищенный антигенный материал из штамма «Перс» FCV, полученного в перевиваемой культуре клеток почки кошки (КК CrFK), с активностью 8,33±0,57 lg ТЦД₅₀/см³ в количестве 15,0 об. %.

Для изготовления ассоциированной вакцины «Карнифел РСН» используют инактивированный очищенный антигенный материал из штамма «Фауна» FCV, полученного в перевиваемой культуре клеток почки кошки (КК CrFK), с активностью 8,05±0,46 lg ТЦД₅о/см³ в количестве 15,0 об. %.

Изолят вируса инфекционного ринотрахеита кошек, послуживший источником для получения штамма «Лавр», был выделен из патологического материала, полученного от кота, поступившего на лечение в ветеринарную клинику ВООО Центра животных «Валента» г. Владимир, в 2021 г.

Штамм «Лавр» FHV депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №457 - деп / 23-7 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ.

Штамм «Лавр» FHV характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек относится к семейству Herpesviridae, роду Varicellovirus, виду Alpaherpesvirus 1 и обладает морфологическими признаками, характерными для представителей герпесвирусов: размер вирионов от 120 до 180 нм, они состоят из ядра, содержащего двухцепочечную ДНК, икосаэдрического капсида, слоя оболочки, окружающего капсид, и липидного бислоя, из которого выступают шипы гликопротеина.

Антигенные свойства

Все циркулирующие штаммы представляют собой единый серотип. У переболевших кошек в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в реакции нейтрализации (РН). Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в РН в культуре клеток CrFK. Инокуляция в организм животного штамма «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек сопровождается образованием вируснейтрализующих антител в крови в титре от 6 log₂ SN₅₀ до 8,00 log₂ SN₅₀ y кроликов.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Геном вируса имеет размер приблизительно 135800 п. н., который состоит из уникальных длинных (UL) и уникальных коротких (US) последовательностей, обрамленных областями инвертированных повторов, известными как терминальный и инвертированный длинный повтор (TRL, IRL) и инвертированный и терминальный короткий повтор (IRL, TRS), соответственно. Рекомбинация является распространенным механизмом эволюции FHV. Большинство зарегистрированных событий рекомбинации в геноме FHV происходят в различных участках. Для штаммовой дифференциации в мировом научном сообществе принято использовать участок ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек, который кодирует гликопротеин Е (483 п. н. и 161 а.о.).

Биотехнологические характеристики.

Штамм «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек репродуцируется в перевиваемой культуре клеток почки кошки (CrFK). Репродукция вируса в культуре клеток CrFK сопровождается специфическим цитопатическим действием, приводящим к округлению клеток и деструкции монослоя через 48-72 ч культивирования. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток CrFK. При культивировании вирус штамма «Лавр» накапливается в титре не менее 6,5±0,25 lg ТЦД₅₀/см³ и сохраняет исходные характеристики при пассировании в течение не менее 5 пассажей (срок наблюдения).

Устойчивость к внешним факторам

Вирус довольно устойчив во внешней среде. Чувствителен к сильнокислым и слабощелочным значениям рН, при температуре 56°С инактивируется за 3-4 минуты, при температуре 37°С - за 36 часов, медленно инактивируется в формалине, устойчив к этиловому спирту. Разрушают оболочку вируса стандартные дезинфектанты (гипохлорит, четвертичные аммонийные соединения). Переносит двукратное размораживание и оттаивание.

Дополнительные признаки и свойства

Патогенность - патогенен для естественно-восприимчивых животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при интраназальном заражении.

Безвреден для кроликов, морских свинок и белых мышей при внутримышечном и подкожном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемой культуре клеток CrFK.

Для получения антигенного материала в культуру клеток CrFK, выращенную в культуральных флаконах, предварительно слив с них ростовую среду, вносили вируссодержащий материал в дозе 0,001 ТЦД₅₀/кл. Флаконы помещали на один час в термостат при температуре (37,0±0,5)°С для контакта клеток культуры с вирусом. После этого вносили поддерживающую среду ПСС с добавлением 2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при (37,0±0,5)°С до появления ЦПД вируса. При поражении площади монослоя не менее 80% культуральные флаконы подвергали замораживанию при температуре минус (45,0±0,5)°С. Стерильный инфицированный монослой дезагрегировали с рабочей поверхности флаконов путем его разморозки при температуре (20±2)°С и периодического встряхивания. По окончании разморозки интенсивным встряхиванием остатки монослоя удаляли с рабочей поверхности, затем, соблюдая условия асептики, инфицированную суспензию собирали в общую емкость. Из собранного материала отбирали пробу для контроля. Контроль посевного материала штамма «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек осуществляли по показателю отсутствия контаминации грибами, бактериями и микоплазмами. Контроль контаминации грибами и бактериями посевного материала штамма «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек проводили по ГОСТ 28085 [35]. Контроль контаминации микоплазмами осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XIV, том II, с. 2997-3008 (ОФС.1.7.2.0031.15) [36].

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами - штамм «Лавр» не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Контроль инфекционной активности штамма «Лавр» FHV проводили согласно «Методическим рекомендациям по титрованию вируса инфекционного ринотрахеита кошек микрометодом» [40]. Контроль инфекционной активности проводили в перевиваемой культуре клеток CrFK путем определения титра биологической активности штамма «Лавр». Сущность титрования основана на определении цитопатогенного действия (ЦПД) вируса, которое проявлялось в культуре клеток CrFK через 96-120 ч. Титром вируса считают последнее его разведение, вызывающее 50% эффект, который рассчитывают по формуле Кербера. Инфекционная активность вируса до инактивации составила 6,5±0,25 lg ТЦД₅₀/см³.

Для инактивации штамма «Лавр» FHV использовали аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляли в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025% с экспозицией 24 часов при температуре (37,0±0,5)°С. По окончании инактивации полученный материал помещают в холодильник при температуре (2-8)°С.

Для изготовления ассоциированной вакцины «Карнифел РСН» используют инактивированный очищенный антигенный материал из штамма «Лавр» FHV, репродуцируемого в перевиваемой культуре клеток почки кошки (КК CrFK), с инфекционной активностью 6,75±0,25 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве 30,0 об. %.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Приготовление предлагаемой ассоциированной вакцины «Карнифел РСН»

Для приготовления ассоциированной вакцины против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек «Карнифел РСН» использовали следующие штаммы вирусов: штамм «Шеба», штамм «Перс», штамм «Фауна», штамм «Лавр».

Технологический процесс состоит из следующих технологических этапов:

• получение вирусных суспензий штаммов «Шеба», «Перс», «Фауна» и «Лавр»;

• определение активности каждой суспензии;

• инактивация вируссодержащих жидкостей штаммов «Шеба», «Перс», «Фауна» и «Лавр» отдельно;

• объединение полученных инактивированных суспензий вирусов;

• добавление адъюванта к смеси инактивированных вирусов;

• расфасовка готового продукта.

Посевной материал, используемый для изготовления вакцины, получали в перевиваемых культурах клеток.

Для изготовления вакцины «Карнифел РСН» ассоциированной против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек использовали культуральный аттенуированный вирус штамма «Шеба»; культуральный вирус штамма «Перс»; культуральный вирус штамма «Фауна»; культуральный вирус штамма «Лавр», выращенные в культуральных флаконах.

Предлагаемая вакцина «Карнифел РСН» имеет оптимальный компонентный состав, об. %:

1. Антигенный материал из штамма «Шеба» FPV, репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки кошки КК CrFK, с гемагглютинирующей активностью 9,33±0,57 log₂ НА, в количестве 30,0 об. %.

2. Антигенный материал из штамма «Перс» FCV, репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки кошки КК CrFK, с инфекционной активностью 8,33±0,57 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве 15,0 об. %.

3. Антигенный материал из штамма «Фауна» FCV, репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки кошки КК CrFK, с инфекционной активностью 8,05±0,46 lg ТЦД₅о/см³, в количестве 15,0 об. %.

4. Антигенный материал из штамма «Лавр» FHV, репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки собаки КК CrFK, с инфекционной активностью 6,75±0,25 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве 30,0 об. %.

5. Адьювант 3%-ный гель гидроокиси алюминия в количестве не менее 10,0 об. %.

Содержимое антигенных материалов в предлагаемой вакцине «Карнифел РСН» в указанных выше концентрациях является их эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата от использования изобретения.

Полученная вакцина «Карнифел РСН» представляет собой: жидкость оттенков розового цвета с осадком. При встряхивании осадок легко разбивается в гомогенную взвесь (табл. 1).

Содержимое сосудов с инактивированным очищенным антигенным материал из штамма «Шеба» FPV, из штамма «Перс» FCV, из штамма «Фауна» FCV, из штамма «Лавр» FHV сливали в отдельные емкости и охлаждали при температуре (2-8)°С, освобождая от клеточного детрита при помощи низкоскоростного центрифугирования. Освобожденная от детрита суспензия должна иметь вид полупрозрачной жидкости оттенков розового цвета.

Затем из емкостей отбирали пробы для контроля вирусного сырья.

Серия штамма «Шеба» FPV должна иметь гемагглютинирующую активность не менее 9,0 log₂ НА;

Серия штамма «Перс» FCV должна иметь инфекционную активность не менее 7,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Серия штамма «Фауна» FCV должна иметь инфекционную активность не менее 7,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Серия штамма «Лавр» FHV должна иметь инфекционную активность не менее 6,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Для инактивации вирусной суспензии штаммов использовали аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляли в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025% с экспозицией 24 часов при температуре (37,0±0,5)°С.

По окончании инактивации антигенный материал каждого штамма охлаждали до температуры (2-8)°С и отбирали пробы для определения рН, стерильности и полноты инактивации.

Для нейтрализации АЭЭИ в вирусную суспензию антигенного материала добавляли тиосульфат натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Полученный антигенный материал из штаммов «Шеба», «Фауна» и «Перс», «Лавр» использовали для изготовления сорбированной формы вакцины против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек «Карнифел РСН». Для этого инактивированный антигенный материал тщательно смешивали с 3%-ным гелем гидроокиси алюминия в количественном соотношении 30,0: 15,0: 15,0: 30,0: 10,0 соответственно.

Вакцину контролировали на стабильность, стерильность и антигенную активность.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Методы биологического контроля стерильности». Сущность метода заключается в определении отсутствия роста бактериальной и грибной микрофлоры в посевах из образцов вакцины на питательные среды.

Вакцину контролировали на полноту инактивации (авирулентность), безвредность и фасовали в стерильные флаконы.

Полноту инактивации препарата определяли общеизвестным способом, аналогично определению безвредности.

Вакцина должна быть стерильной, авирулентной и безвредной.

Безвредность и реактогенность вакцины изучали на группе хорьков, кошек и мышей, которым вводили двукратный прививной объем вакцины. Период наблюдения за животными составил 10 суток. У опытных животных угнетенного состояния, снижения аппетита или отказа от корма не наблюдалось. Лишь у одной мыши на 3 день наблюдалось образование незначительной припухлости диаметром до 0,2 см на месте инъекции, которое исчезло на 5 сутки.

По результатам проверки безвредности животные оставались живыми в течение всего срока наблюдения. Наблюдение за животными в течение 10 дней не выявило каких-либо отклонений со стороны общего состояния организма животных, что говорит о безвредности и ареактогенности вакцины «Карнифел РСН» (предлагаемое изобретение).

Ассоциированная вакцина «Карнифел РСН» (предлагаемое изобретение) стерильна, безвредна и ареактогенна (таб. 1-2).

Пример 2. Антигенная активность и стабильность ассоциированной вакцины «Карнифел РСН».

Антигенную активность вакцины оценивали по результатам вакцинации котят образцами, полученными при определенных интервалах хранения препарата (3 мес., 6 мес., 9 мес. и 12 мес.). Для этого использовали беспородных котят в возрасте 2-3 мес.в количестве 5 голов на каждый установленный на заданный интервал времени хранения вакцины.

Каждые 3 месяца вновь создаваемой группе котят вводили вакцину внутримышечно в область бедра однократно в объеме 1,0 см³, которая хранилась 3 мес., 6 мес., 9 мес. и 12 мес. У всех животных отбирали пробы крови до иммунизации, через 21 день после иммунизации для выявления в РТГА антител к вирусу FPV, в РМН антител к вирусам FCV, FHV (табл.3). Вакцина, введенная однократно внутримышечно, должна вызывать у животных не менее чем 2-кратный прирост антител в РТГА к вирусу панлейкопении, средний титр антител в РМН к вирусу калицивироза должен быть не ниже 1:32 (5,0 log₂) и инфекционного ринотрахеита должен быть не ниже 1:16 (3,0 log₂) по отношению к титрам антител до вакцинации. У контрольной группы прироста титра антител не должно быть.

Стабильность вакцины исследовали на протяжении 12 месяцев хранения при температуре от 2°С до 8°С с периодичностью осмотра и проведения исследований каждые 3 месяца (таб. 1). Все отобранные пробы вакцины, каждые 3 месяца исследовали на стерильность по ГОСТ 28085-89 [35] и на отсутствие контаминации микоплазмами в соответствии с требованиями ГФ XIV том 2, ОФС 1.7.2.0031.15 [36].

Как представлено в таблице 1, на всех зачетных интервалах времени при хранении вакцины при температуре от 2°С до 8°С не обнаружили изменений показателей качества препарата: стерильность; полнота инактивации; безвредность и реактогенность; антигенная активность.

Все животные, вакцинированные образцами вакцины, как на момент закладки на хранение, так и образцами после 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения при температуре от 2°С до 8°С, через указанный период были иммунны. Уровень специфических антител к вирусу FPV в сыворотках крови котят опытных групп составил в среднем по группе 9,00-9,60 log₂ HI в РТГА, к вирусу FCV 6,40-7,25 log₂ в РМН, к вирусу FHV 5,55-6,25 log₂ в РМН, что указывает на стабильность вакцины в течение 12 месяцев (табл. 3).

Ассоциированной вакцина «Карнифел РСН» (предлагаемое изобретение) безвредна, ареактогенна и стабильна (в течение 12 месяцев - срок наблюдения).

Пример 3. Применение предлагаемой ассоциированной вакцины «Карнифел РСН» для иммунизации кошек.

Перед применением флакон с вакциной, содержащей 1 прививную дозу, необходимо аккуратно встряхнуть до восстановления однородности.

Вакцину вводили котятам двукратно с интервалом в 21 сутки внутримышечно в область средней трети бедра или подкожно в область лопаток в дозе 1,0 см³ с соблюдением правил асептики.

Вакцина вызывает формирование иммунного ответа у кошек к вирусам панлейкопении, калицивироза и инфекционного ринотрахеита через 14 сутки после двукратного введения, продолжительностью иммунитета против вирусов панлейкопении, калицивироза и инфекционного ринотрахеита не менее 12 месяцев.

Пример 4. Эффективность вакцинации предлагаемой вакциной Эффективность при применении вакцины ассоциированной против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек «Карнифел РСН», изготовленной так, как описано в примере 1, представлена в таблицах 4-6 по оценке иммуногенной активности.

Испытание иммуногенной активности полученного препарата проводили на 15 котятах 2-3 месячного возраста, не вакцинированных от панлейкопении (FPV), калицивироза (FCV) и вирусного ринотрахеита (FHV), а 3 котят оставляли не вакцинированными в качестве контроля.

Всех 15 котят разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. На каждой группе испытывали различные схемы применения предлагаемого изобретения.

Котят группы №1 вакцинировали вакциной (предлагаемое изобретение) подкожно двукратно с интервалом в 21 сутки в объеме 1,0 см³.

Котят группы №2 вакцинировали дважды с интервалом в 21 сутки. В 12 месячном возрасте котятам провели ревакцинацию. Каждый раз вакцину (предлагаемое изобретение) вводили подкожно в объеме 1,0 см³.

Котят группы №3 вакцину вводили подкожно однократно в объеме 1,0 см³.

Схемы отбора проб крови от животных для серологических исследований и результаты исследований титров антител по каждому компоненту вакцины представлены в таблицах 4-6. Сыворотки крови животных исследовали в РТГА на присутствие антител к вирусу FPV, в РМН на присутствие антител к вирусам FCV, FHV. Величину титра антител считали оценкой напряженности поствакцинального иммунитета против данных вирусов. РМН и РТГА ставили по общепринятым методикам.

После вакцинации вакциной против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита «Карнифел РСН» на антигены, входящие в состав препарата, иммунная система животных активно реагировала. У животных всех групп наблюдали напряженный иммунный ответ на FPV, FCV, FHV на протяжении всего срока наблюдения. Первое введение вакцины позволит защитить кошек от вирусов панлейкопении, калицивироза и ринотрахеита, исходя из данных, представленных в таблице 4-6. Однако у котят группы №3 после однократной вакцинации через 5 месяцев наблюдалось снижение уровня антител к вирусам FCV и в среднем по группе составил 4,90-6,40 log₂ в РМН; через 8 месяцев наблюдалось снижение уровня антител к вирусу FHV, в среднем по группе составил 3,80 log₂ в РМН; через 11 месяцев наблюдалось снижение уровня антител к вирусу FPV, в среднем по группе составил 6,45 log₂ HI в РТГА (таб. 6).

У котят группы №1 и группы №2 после двукратной вакцинации средний геометрической титр антител к FPV в РТГА составил 9,60±0,54 log₂ и 9,05±0,59 log₂ HI соответственно, средний геометрической титр антител к вирусам FCV в РМН у группы №1 составил 7,05±0,48 log₂ и 8,20±0,32 log₂, у группы №2 составил 7,25±0,39 log₂ и 8,25±0,25 log₂, средний геометрической титр антител к вирусу FHV в РМН составил 6,20±0,74 log₂ и 6,20±0,28 log₂ соответственно. На протяжении всего срока наблюдения уровень специфических антител к вирусам FPV, FCV, FHV в сыворотке крови котят группы №1 и №2 оставались на высоком уровне (таб. 4-5).

После ревакцинации в возрасте 12 месяцев животных группы №2 вакциной «Карнифел РСН» был установлен прирост антител к FPV, FCV, FHV. Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что титры антител превышали требуемые минимальные титры ко всем антигенным компонентам вакцины. Титры антител ко всем антигенным компонентам в контрольной группе оставались примерно на одном уровне в течение всего срока наблюдения.

Данные свидетельствует о том, что ассоциированная вакцина (предлагаемое изобретение) индуцирует у вакцинированных котят образование высоких уровней антител к вирусу панлейкопении кошек штамма «Шеба». Максимальный уровень титров антител наблюдали через 21 день после ревакцинации составил 9,45±0,44 log₂ HI.

Данные свидетельствует о том, что ассоциированная вакцина (предлагаемое изобретение) индуцирует у вакцинированных котят образование высоких уровней антител к вирусу калицивироза кошек штамма «Перс». Максимальный уровень титров антител, который наблюдали через 21 сутки после ревакцинации, составил 8,35±0,22 log₂.

Данные свидетельствует о том, что ассоциированная вакцина (предлагаемое изобретение) индуцирует у вакцинированных котят образование высоких уровней антител к вирусу калицивироза кошек штамма «Фауна». Максимальный уровень титров антител наблюдали через 21 сутки после ревакцинации составил 7,40±0,41 log₂.

Данные свидетельствует о том, что ассоциированная вакцина (предлагаемое изобретение) индуцирует у вакцинированных котят образование высоких уровней антител к вирусу инфекционного ринотрахеита кошек штамма «Лавр». Максимальный уровень титров антител наблюдали через 21 сутки после ревакцинации составил 7,15±0,48 log₂.

На основании проведенных исследований был сделан вывод о том, что ассоциированная вакцина против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек «Карнифел РСН» (предлагаемое изобретение) формирует у иммунизированных животных стойкий иммунный ответ против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек продолжительностью не менее 12 месяцев при введении препарата двукратно с интервалом 21 день и ревакцинацией животных в 12 месячном возрасте.

По результатам можно сделать вывод, что ассоциированная вакцина против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек «Карнифел РСН» (предлагаемое изобретение) не препятствует формированию иммунного ответа на возбудителей панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек. После введения вакцины против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек «Карнифел РСН» вырабатывается напряженный иммунитет, способный обеспечить надежную защиту против указанных возбудителей. На этом основании считаем, что компоненты вакцины против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек совместимы между собой.

Таким образом, ассоциированная вакцина против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек «Карнифел РСН» (предлагаемое изобретение) обладает высокой иммуногенной и антигенной активностью в отношении всех 4 антигенных компонентов и безвредна для кошек.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Ассоциированная вакцина против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита «Карнифел РСН»:

1. Greene СЕ. Feline enteric viral infections // Infectious diseases of the dog and cat. 4^th ed., Elsevier, 2012, p.80-91.

2. Алипер Т.И., Непоклонов Е.А., Мухин А.Н. и др. Диагностика и профилактика инфекционных болезней кошек и кошек: руководство для практикующих ветеринарных врачей. Под ред. Т. И. Алипера. М.: ЗооВетКнига; 2017. 300 с. 2.

3. Wu Q, Wu Н., Не S., Liu Y., Chen Y. end et. Feline herpesvirus infection and pathology in captive snow leopard. Sci Rep.2022 Apr 28; 12(1):4989.

4. Мороз H.B. Разработка и усовершенствование контроля ассоциированных вакцин против болезней плотоядных / Н.В. Мороз // Актуальные проблемы науки в АПК: Мат. научно-практ. конф. - Кострома, 2003. С. 102-103.

5. ТУ - 10-09-98-91 - https://www.tenderguru.ru/standart/tu-10-09-98-91 ?ysclid=18x0pokhe8385403360

6. Rehme Т., Hartmann К., Truyen U., Zablotski Y., Bergmann M. Feline Panleukopenia Outbreaks and Risk Factors in Cats in Animal Shelters. Viruses. 2022 Jun8; 14(6):1248.

7. Truyen U., Addie D., Belak S., Boucraut-Baralon C. et al.. Feline panleukopenia. ABCD guidelines on prevention and management. J Feline Med Surg. 2009 Jul; 11 (7):538-46.

8. Cotmore S.F., Tattersall P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv Virus Res. 2007; 70:183-232.

9. Mira F., Canuti M., Purpari G., Cannella V. et al.. Molecular Characterization and Evolutionary Analyses of Carnivore Protoparvovirus 1 NS1 Gene. Viruses. 2019 Mar29; 11(4):308.

10. Truyen U., Parrish C.R. Canine and feline host ranges of canine parvovirus and feline panleukopenia virus: distinct host cell tropisms of each virus in vitro and in vivo. J Virol. 1992 Sep; 66(9):5399-408.

11. Truyen U., Parrish C.R. Feline panleukopenia virus: its interesting evolution and current problems in immunoprophylaxis against a serious pathogen. Vet Microbiol. 2013 Jul 26; 165(1-2):29-32.

12. WSAVA Руководство по вакцинации собак и кошек. - URL: https://wsava.org/ (дата обращения 28.03.23 г.).

13. Пуревакс RCPCh. - URL: https://www.vetlek.ru/directions/?id=448 (дата обращения 28.03.23 г)

14. Нобивак Tricat Trio. - URL: https://vetsnab.info/vetpreparaty/nobivak-tricat-trio-s-rastvoritelem-nobivak-diluent/ (дата обращения 28.03.23 г.).

15. Лейкофелиген. - URL: https://www.vetlek.ru/directions/?id=1113 (дата обращения 28.03.23 г.).

16. Фелоцел CVR. - URL: https://www.vetlek.ru/articles/?id=250 (дата обращения 28.03.23 г.)

17. Battilani М., Bassani М., Forti D., Morganti L. / Analysis of the evolution of feline parvovirus (FPV). // Vet Res Commun - 2006a. P - 223-226.

18. Truyen U. 2006; Evolution of canine parvovirus-A need for new vaccines?. Vet Microbiol 117:9-13.

19. Глотова Т.Н., Семенова O.B., Никонова A.A., Глотов А.Г., Вяткин Ю.В., Бондарь А.А. Выделение и филогенетический анализ калицивируса кошек в Сибири. Вопросы вирусологии. 2018; 63(6):268-274.

20. Hou J, Sanchez-Vizcaino F, McGahie D. et al.. European molecular epidemiology and strain diversity of feline calicivirus. Vet Rec. 2016 Jan 30; 178(5):114-5.

21. Komina A., Krasnikov N., Kucheruk O., Zhukova E., Yuzhakov A., Gulyukin A. Distribution and genetic diversity of Feline calicivirus in Moscow metropolitan area. J Vet Sci. 2022 Nov; 23(6):e92.

22. Рахманина M.M. Калицивирусная инфекция кошек: биологические свойства возбудителя, эпизоотология, специфические средства и методы профилактики: Автореф. дисс.… д-ра ветеринар, наук. М.; 2005.

23. Hofmann-Lehmann R., Hosie M.J., Hartmann K. et al.. Calicivirus Infection in Cats. Viruses. 2022 Apr 29; 14(5):937.

24. Вакцина против калицивироза, вирусного ринотрахеита и панлейкопении кошек Нобивак Tricat Trio. - URL: https://www.vetlek.ru/directions/?id=l 12 (дата обращения 03.03.23 г.).

25. Патент RU 2 184 567, МПК А61К 39/125(2006.01), C12N 7/00(2006.01). Штамм feline calicivirus, используемый для контроля иммуногенной активности вакцин, изготовления специфических лечебно-профилактических и диагностических биопрепаратов / Рахманина М.М., Элизбарашвили Э.И., Уласов В.П.; заявитель и патентообладатель ФГБУ «ВГНКИ». - №2001113087/13; заявл. 2001.05.16; опубл. 2002.07.10.

26. Патент RU 2 628 196, МПК А61К 39/125(2006.01), C12N 7/00(2006.01). Штамм Эшли вируса калицивироза кошек для изучения противовирусной активности препаратов в отношении калицивироза кошек / Глотова Т.П., Семенова О.Э., Глотов А.Г.; заявитель и патентообладатель ФГБУ «ВГНКИ». -№2016121721; заявл. 2016.06.01; опубл. 2017.08.14.

27. Sun Н., Li Y., Jiao W., Liu С, Liu X. et al.. Isolation and identification of feline herpesvirus type 1 from a South China tiger in China. Viruses. 2014 Feb 28;6(3):1004-14.

28. Magouz A., Lokman M.S., Albrakati A., Elmahallawy E.K. First Report of Isolation and Molecular Characterization of Felid Herpesvirus-1 from Symptomatic Domestic Cats in Egypt. Vet Sci. 2022 Feb 15; 9(2):81.

29. Povey R.C. A review of feline viral rhinotracheitis (feline herpesvirus I infection). Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 1979; 2(2-3):373-87.

30. Hora A.S., Tonietti P.O., Guerra J.M. et al.. Felid herpesvirus 1 as a causative agent of severe nonsuppurative meningoencephalitis in a domestic cat. J Clin Microbiol. 2013 Feb; 51(2):676-9.

31. Maes R. Felid herpesvirus type 1 infection in cats: a natural host model for alphaherpesvirus pathogenesis. ISRN Vet Sci. 2012 Nov 14; 2012:495830.

32. Cottingham E., Johnstone Т., Hartley C.A., Devlin J.M. Update on feline alphaherpesvirus-1 seroprevalence in Victorian feral and owned cats. Aust Vet J. 2022 May; 100(5): 187-189. doi: 10.111 l/avj.13147. Epub 2022 Jan 25. Erratum in: Aust Vet J. 2022 Aug; 100(8):414.

33. Патент RU 2 215 031 Российская Федерация, МПК A61K 39/245 (2006.01), C12N 7/00(2006.01). Штамм Feline herpesvirus-1, используемый для контроля иммуногенной активности вакцин, изготовления специфических лечебно-профилактических и диагностических биопрепаратов / Элизбарашвили Э.И., Рахманина М.М., Уласов В.И.; заявитель и патентообладатель ФГБУ «ВГНКИ». - №2002107022/13; заявл. 2002.03.20; опубл. 2003.10.27.

34. Vaz Р.К., Job N., Horsington J, Ficorilli N. et al.. Low genetic diversity among historical and contemporary clinical isolates of felid herpesvirus 1. BMC Genomics. 2016 Sep 2; 17(1):704.

35. ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».

36. ГФ XIV, т. 2, с. 2997-3008 Испытания на присутствие микоплазм (ОФС.1.7.2.0031.15).

37. Zhou L, Fu N, Ding L, Li Y, Huang J, Sha X, et al. Molecular characterization and cross-reactivity of feline calicivirus circulating in Southwestern China. Viruses. 2021; 13(9):1812.

38. Методические рекомендации по титрованию возбудителя панлейкопении кошек / А.А. Комарова, Т.С. Галкина А.А. Климова, A.M. Киселев,; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2023 - 20 с.

39. Методические рекомендации по титрованию вируса калицивироза микрометодом / A.M. Киселев, Т.С. Галкина, А.А. Комарова, А.А. Климова, О.Г. Яшина; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2023 - 20 с.

40. Методические рекомендации по титрованию вируса инфекционного ринотрахеита кошек микрометодом / О.Г. Яшина, Т.С.Галкина, А.А. Комарова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2023 - 21 с.

42. https://vetbio.ru/catalog/pets/vaccine/multifel-4/

43. https://www.vidal.ru/veterinar/felocell-cvr-c-28027

44. https://www.boehringer-ingelheim.ru/veterinary-division/purevax-rcp

45. https://www.vettorg.ru/catalog/item-1765.html

46. https://www.vetlek.ru/directions/?id=313

47. https://www.nobivac.ru/нобивак-tricat-trio/

48. https://www.nobivac.ru/нобивак-ducat/

49. https://www.vidal.ru/veterinar/fel-o-vax-4-28026

50. https://www.bioveta.cz/ru/preparaty/zdorove-zhivotnyh/biofelr-pchr.html

51. https://www.bioveta.cz/ru/preparaty/zdorove-zhivotnyh/biofelr-pch.html

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Vaccine

Carniphel.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-05-03">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-05-02</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>504</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-05-02</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Ассоциированная вакцина против

панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита

«Карнифел-PCH</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>664</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..664</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FPV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catgtacaaattgtaacaccttggtcattggttgatgcaaatgcttggg

gagtttggtttaatccaggagattggcaactaattgttaatactatgagtgagttgcatttagttagttt

tgaacaagaaatttttaatgttgttttaaagactgtttcagaatctgctactcagccaccaactaaagtc

tataataatgatttaactgcatcattgatggttgcattagatagtaataatactatgccatttactccag

cagctatgagatctgagacattaggtttttatccatggaaaccaaccataccaactccatggagatatta

ttttcaatgggatagaacattaataccatctcatactggaactagtggcacaccaacaaatgtatatcat

ggtacagatccagatgatgttcaattttatactattgaaaattctgtgccagtgcacttactaagaacag

gtgatgaatttgctacaggaacatttttttttgattgtaaaccatgtagactaacacatacatggcaaac

aaatagagcattgggcttaccaccatttctaaattctttgcctcaatctgaaggagctactaactttggt

gatataggagttcaacaagataaaagacgtggtgtaactcaaatgggaaatacag</INSDSeq_seque

nce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>221</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..221</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FPV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>HVQIVTPWSLVDANAWGVWFNPGDWQLIVNTMSELHLVSFEQEIFNVVL

KTVSESATQPPTKVYNNDLTASLMVALDSNNTMPFTPAAMRSETLGFYPWKPTIPTPWRYYFQWDRTLIP

SHTGTSGTPTNVYHGTDPDDVQFYTIENSVPVHLLRTGDEFATGTFFFDCKPCRLTHTWQTNRALGLPPF

LNSLPQSEGATNFGDIGVQQDKRRGVTQMGNT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>318</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..318</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FCV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaattcaatattgggcttaattgatactgttactaatacaattggta

aagcacaacaaattgaattggataaggctgcactcggtcaacaacgtgagttggcattgcaacgaatgaa

cctcgatcgccaagcgttgaataaccaagtggagcaatttaacaaaattcttgagcagagggtacaaggc

ccactccaatcggttcgtctcgcacgggctgctggatttagggttgacccttactcatacacaaatcaaa

atttttatgatgatcaattaaatgcaattaggctatcatataggaatctgtttaagatg</INSDSeq_s

equence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>106</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..106</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FCV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MNSILGLIDTVTNTIGKAQQIELDKAALGQQRELALQRMNLDRQALNNQ

VEQFNKILEQRVQGPLQSVRLARAAGFRVDPYSYTNQNFYDDQLNAIRLSYRNLFKM</INSDSeq_seq

uence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>318</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..318</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FCV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaaaactcaatactaggcctaattgatactgttactaatactattggta

aagctcaacgaattgaattggacaaagctgcacttgatcaacacagtgagttggcatttcaacgattgaa

tttggaccaccaggcactgaacaaccaggtcgagcaatttaacaaacttcttgaacagagggtacaaggc

cccatccagtctgtacgtcttgcacgtgccgctggatttagggtcgacccttattcatacacaaatcaaa

acttttatgacgatcaattaaatgcaatttggctatcatatagaaatttgtttaaaacc</INSDSeq_s

equence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>106</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..106</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FCV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>KNSILGLIDTVTNTIGKAQRIELDKAALDQHSELAFQRLNLDHQALNNQ

VEQFNKLLEQRVQGPIQSVRLARAAGFRVDPYSYTNQNFYDDQLNAIWLSYRNLFKT</INSDSeq_seq

uence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>483</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..483</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgtatcaacactccaagtataaatcatatgccatatatcgaacagccgg

ccaataacgtggatctaaagtttatcaatgtacccaccaacgcttctgggttgtacgtattcatacttcg

ttataatggacatccggaagaatggacctatacactcatatcaacaggagctaaatttttgaatgtgatt

agggatctgacacgcccacgtcttggtagtcatcaaatagagaccgatattagcacatcttcgcagtcgc

ctaccacggagacaccacgaaacatacatataacgtgggcgagacgttatctaaaggttatcataggaat

aatttgcgtagctggtatccttttgattgtaatctctatcacatgttatattcgatttcgtcatatgcga

tataaaccatatgaagtgatcaacccattccctgcggtatataccagcattcctagtaacgatcccgacg

aactctactttgaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>161</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..161</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>CINTPSINHMPYIEQPANNVDLKFINVPTNASGLYVFILRYNGHPEEWT

YTLISTGAKFLNVIRDLTRPRLGSHQIETDISTSSQSPTTETPRNIHITWARRYLKVIIGIICVAGILLI

VISITCYIRFRHMRYKPYEVINPFPAVYTSIPSNDPDELYFE</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Вакцина содержит активное вещество и целевую добавку. В качестве активного вещества вакцина содержит смесь из аттенуированного очищенного антигенного материала из штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек, семейства Parvoviridae, рода Protoparvovirus, вида Carnivore protoparvovirus 1, из инактивированного и очищенного антигенного материала из штамма «Перс» калицивироза кошек, семейства Caliciviridae, роду Vesivirus, виду Feline calicivirus, из инактивированного и очищенного антигенного материала из штамма «Фауна» калицивироза кошек, семейства Caliciviridae, рода Vesivirus, вида Feline calicivirus, из инактивированного и очищенного антигенного материала из штамма «Лавр» вирусного ринотрахеита кошек, семейства Herpesviridae, рода Varicellovirus, вида Alpaherpesvirus 1, в качестве целевых добавок: 3%-ный гель гидроокиси алюминия и стабилизатор; взятых в эффективном соотношении. Вакцина обеспечивает протективную иммунную активность каждого антигена в организме собак после введения ему целевого препарата. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 4 пр.

1. Вакцина, ассоциированная против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек, содержащая активное вещество и целевую добавку, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь из инактивированного очищенного антигенного материала: из штамма «Шеба» панлейкопении кошек, сем. Parvoviridae, рода Protoparvovirus, вид Carnivore protoparvovirus 1, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №455 - деп / 23-5 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»; из штамма «Перс» калицивироза кошек, семейства Caliciviridae, рода Vesivirus, вида Feline calicivirus, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №458 - деп / 23-8 ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»; из штамма «Фауна» калицивироза кошек, семейства Caliciviridae, рода Vesivirus, вида Feline calicivirus, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №471 - деп / 23-21 ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»; из штамма «Лавр» инфекционного ринотрахеита кошек семейству Herpesviridae, роду Varicellovirus, виду Alpaherpesvirus 1, коллекция ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №457 - деп / 23-7; и в качестве целевой добавки: 3%-ный гель гидроокиси алюминия, взятых в объемном соотношении 30,0: 15,0: 15,0: 30,0: 10,0 и в количествах, обеспечивающих протективную иммуногенную активность каждого антигена в организме кошек после введения им целевого препарата.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Шеба» панлейкопении кошек (FPV) Carnivore protoparvovirus 1, полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой вирусную суспензию в количестве 30,0 об. %.

3. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Перс» вируса калицивироза кошек (FCV) Feline calicivirus, полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой суспензию в количестве 15,0 об. %.

4. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит инактивированный и очищенный антигенный материал из штамма «Фауна» вируса калицивироза кошек (FCV) Feline calicivirus, полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой суспензию в количестве 15,0 об. %.

5. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит инактивированного и очищенного антигенного материала из штамма «Лавр» инфекционного ринотрахеита (FHV) Alphaherpesvirus 1, полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, представляющий собой суспензию в количестве 30,0 об. %.

6. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве адъюванта она содержит 3%-ный гель гидроокиси алюминия в количестве не менее 10,0 об. %.

7. Вакцина по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что она содержит смесь из инактивированных и очищенных антигенных материалов из штамма «Шеба» панлейкопении кошек (FPV), полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, с инфекционной активностью 9,00±0,57 log₂ НА; из штамма «Перс» вируса калицивироза кошек (FCV), полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, с инфекционной активностью 8,33±0,57 lg lg ТЦД₅₀/см³; из штамма «Фауна» вируса калицивироза кошек (FCV), полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, с инфекционной активностью 8,05±0,46 lg ТЦД₅₀/см³; из штамма «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита (FHV), полученный в перевиваемой культуре клеток CrFK, с инфекционной активностью 6,5±0,25 lg ТЦД₅₀/см³; и целевые добавки: адъювант в количестве, об. %:

антигенный материал из штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек 30,0 антигенный материал из штамма «Перс» вируса калицивироза кошек 15,0 антигенный материал из штамма «Фауна» вируса калицивороза кошек 15,0 антигенный материал из штамма «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек 30,0 адъювант 3%-ный гель гидроокиси алюминия 10,0