ЗАМЕЩЕННЫЕ ПИПЕРИДИН-2,6-ДИОНЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2002 года по МПК C07D401/04 A61K31/454 A61P37/02 A61P37/06 

Изобретение относится к аналогам талидомида из класса пиперидин-2,6-дионов, способу их получения и их применению в лекарственных средствах.

При патогенезе синдрома реакции "трансплантат против хозяина", рассеянного склероза, отторжения трансплантата, афтозного стоматита, эритемы нодозной лепроматозной, болезни Бека, ревматоидного артрита и целого ряда других заболеваний, сопровождаемых воспалительными явлениями, чрезмерное образование являющегося цитокином фактора-α некроза опухоли (TNF-α, Tumor-Necrosis-Factor-α) играет главную роль. Один из подходов в терапии этих болезней состоит в целенаправленном подавлении высвобождения ΤΝF-α введением в качестве активных веществ иммунодепрессантов или модуляторов, например дексаметазона, пентоксифиллина или талидомида.

Однако среди показаний к применению следует проводить различия между такими, которые требуют общей иммуносупрессии, и такими, при которых требуется в полной мере учитывать все достоинства и недостатки иммуносупрессии. Было установлено, что при лечении афтозного стоматита талидомид превосходит классические иммунодепрессанты. Другими примерами заболеваний, в которых талидомид показал хорошую эффективность, не приводя к общей иммуносупрессии, являются кожная красная волчанка, (H+G 69, 816-822 (1994)), гангренозная пиодермия и орогенитальные язвы при болезни Бехчета (The Lancet, 20.05.89, 1093-1095). Патогенными факторами этих ограниченных кожей и слизистыми оболочками поражений являются эндогенные медиаторы с действием на эндотелий и циркулирующие лейкоциты. Под влиянием ΤΝF-α и других цитокинов адгезивность эндотелия по отношению к лейкоцитам фокально возрастает, что решающим образом способствует образованию васкулитидов. При системных картинах болезни действие самого талидомида на кожу и слизистые оболочки ограничено, что (дополнительно) требует иммуносупрессии. Примерами этого является системная красная волчанка, которая наряду с кожными явлениями вызывает также опасные для жизни изменения внутренних сосудов, в частности почек, лепрареакция типа II с поражением глаз и/или суставов, а также болезнь Бехчета с поражением глаз и/или суставов.

Вещества, которые аналогично талидомиду подавляют это изменение эндотелия, но одновременно полностью или частично блокируют реакции специфической клеточной иммунной защиты, могут способствовать значительному прогрессу в терапии названных системных картин болезни. Ключевым информационным веществом клеточного иммунного ответа является интерлейкин 2, от которого зависит пролиферация антигенспецифичных лимфоцитов.

Поэтому при разработке новых лекарственных средств ставится цель в полной мере использовать противовоспалительные свойства талидомида совместно с иммуносупрессивными активными компонентами, которыми талидомид при его индивидуальном клиническом применении не обладает.

В основу изобретения была положена задача создать аналоги талидомида из класса пиперидин-2,6-дионов, подавляющих обусловленное воспалением высвобождение ΤΝF-α, а также индуцированный антигеном синтез интерлейкина 2.

Было установлено, что указанным требованиям удовлетворяют предлагаемые согласно изобретению соединения.

Таким образом, объектом настоящего изобретения являются замещенные в положении 3 и 5 пиперидин-2,6-дионы общей формулы (I)

где Z обозначает одну из групп:

причем атом углерода с заместителем R¹ связан по карбонильной группе, и
где R¹ обозначает фталимидный радикал (когда Z обозначает -C(R¹R²)-CH₂-) или одно- либо двукратно замещенный гидрокси-, метокси- или аминогруппами фталимидный радикал (когда Z обозначает -C(R¹)=СН-),
R² обозначает водород или С_1-6 алкил (линейный или разветвленный),
R³ обозначает водород, С_1-6 алкильную группу (линейную или разветвленную) или ароматическую либо гетероароматическую кольцевую систему и
R⁴ обозначает С_1-6 алкильную группу (линейную или разветвленную) или ароматическую либо гетероароматическую кольцевую систему.

Из пиперидин-2,6-дионов формулы (I), в которой Z обозначает -C(R¹R²)-CH₂-, R¹ обозначает фталимид и R² и R³ обозначают водород, наиболее предпочтительно соединение, в котором R⁴ является фенилом.

Из пиперидин-2,6-дионов формулы (I), в которой Z обозначает -C(R¹)=CH-, R³ обозначает этил и R⁴ обозначает фенил, наиболее предпочтительно соединение, в котором R¹ является 3,4-диметоксифталимидом.

Изобретение далее относится к способу получения аналогов талидомида из класса пиперидин-2,6-дионов общей формулы (I).

Соединения общей формулы (I), в которой Z обозначает -C(R¹R²)-СН₂-, могут быть получены конденсацией фталевого ангидрида с помощью замещенной глутаминовой кислоты, например 4-фенилглутаминовой кислоты или 4-метилглутаминовой кислоты, в органическом растворителе, предпочтительно пиридине, циклизацией продукта в ацетангидриде и последующим переводом в имид. Превращение ангидрида в имид при этом осуществляется плавлением в присутствии мочевины.

Эти целевые соединения формулы (I) могут быть получены также взаимодействием фталевого ангидрида с 5-замещенным 3-аминоглутаримидом, предпочтительно путем нагревания в уксусной кислоте.

Соединения общей формулы (I), в которой Z обозначает -C(R¹)=СН-, могут быть получены конденсацией замещенного фталевого ангидрида, например 3,4-диметоксифталевого ангидрида, с помощью 5-замещенных 3-амино-3,4-дегидропиперидин-2,6-дионов, таких как, например 3-амино-5-этил-5-фенилглутаконимид, в органическом растворителе, например, в уксусной кислоте.

Пример 1. 2-(5-Метил-2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-1,3-дион (1)
2,00 г (11 ммоль) 4-Метилглутаминовой кислоты и 1,95 г (13 ммоль) фталевого ангидрида нагревают с обратным холодильником в 15 мл сухого пиридина в течение 6 ч. После отгонки растворителя остаток нагревают в течение 1 ч в 10 мл ацетангидрида до кипения. Выпавшее в осадок при охлаждении твердое вещество подвергают вакуум-фильтрации и фильтрат концентрируют. После смешения фильтрата с простым эфиром образовавшийся осадок подвергают вакуум-фильтрации и объединенные осадки перекристаллизовывают из абсолютного толуола. 2,00 г (7 ммоль) кристаллизата и 0,23 г (3,8 ммоль) мочевины тщательно перемешивают и расплавляют в масляной бане при приблизительно 200^oС в течение 30 мин. Застывший расплав быстро нагревают до кипения последовательно с 4 мл ацетангидрида и 6 мл этанола. Выпавшее в осадок твердое вещество подвергают вакуум-фильтрации и перекристаллизовывают из смеси ДМФ/вода. Таким путем получают 1,35 г (67% от теории) 2-(5-метил-2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-1,3-диона (1) с температурой плавления 270-272^oС.

Пример 2. 2-(5-Фенил-2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-1,3-дион (2)
3,00 г (12 ммоль) 4-Фенилглутаминовой кислоты и 2,12 г (14 ммоль) фталевого ангидрида нагревают с обратным холодильником в 40 мл сухого пиридина в течение 6 ч. После отгонки растворителя остаток растворяют в 50 мл 5%-ной НС1 и экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу промывают водой, обесцвечивают активированным углем и сушат над сульфатом натрия. После отгонки растворителя остаток нагревают с обратным холодильником в течение 1 ч в 40 мл ацетангидрида. Затем раствор концентрируют и смешивают с простым эфиром. Выпавший осадок подвергают вакуум-фильтрации и перекристаллизовывают из сухого толуола. 2,00 г (6 ммоль) кристаллизата и 0,19 г (3 ммоль) мочевины расплавляют в масляной бане при приблизительно 200^oС в течение 30 мин. Застывший расплав быстро нагревают до кипения последовательно с 4 мл ацетангидрида и 8 мл этанола. Выпавшее в осадок твердое вещество перекристаллизовывают из смеси ДМФ/вода. Таким путем получают 0,80 г (40% от теории) 2-(5-фенил-2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-1,3-диона (2) с температурой плавления 228-231^oС.

Пример 3. 2-(5-Этил-5-фенил-2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-1,3-дион (3)
1,00 г (4 ммоль) 3-Амино-5-этил-5-фенилглутаконимида растворяют в 40 мл безводного этанола, раствор смешивают с 0,1 г палладия на угле (10% Pd/C) и перемешивают в атмосфере водорода в течение 8,5 ч. Затем катализатор отфильтровывают и фильтрат концентрируют досуха. Остаток нагревают с обратным холодильником с 0,70 г (5 ммоль) фталевого ангидрида в 40 мл ледяного уксуса в течение 4 ч. После отгонки растворителя остаток перекристаллизовывают из этанола. Таким путем получают 0,99 г (63% от теории) 2-(5-этил-5-фенил-2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-1,3-диона (3) с точкой плавления 174-177^oС.

Пример 4. 2-(5-Этил-5-фенил-2,6-диоксо-1,2,5,6-тетрагидропиридин-3-ил)-4,5-диметокси-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-1,3-дион (4)
0,45 г (2 ммоль) 3-амино-5-этил-5-фенилглутаконимида и 0,45 г (2 ммоль) 4,5-диметоксифталевого ангидрида нагревают с обратным холодильником в 15 мл ледяного уксуса в течение 5 ч. Затем концентрируют досуха и остаток перекристаллизовывают из этанола. Таким путем получают 0,55 г (67% от теории) 2-(5-этил-5-фенил-2,6-диоксо-1,2,5,6-тетрагидропиперидин-3-ил)-4,5-диметокси-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-1,3-диона (4) с температурой плавления 203-205^oС.

Соединения по изобретению безопасны с токсикологической точки зрения и поэтому пригодны для использования в качестве фармацевтически активных веществ. Соответственно этому изобретение также относится к применению аналогов талидомида из класса пиперидин-2,6-дионов формулы (I) в качестве активных веществ в лекарственных средствах, предпочтительно в качестве супрессантов для обусловленного воспалением высвобождения ΤΝF-α, a также индуцированного антигеном синтеза интерлейкина 2.

Лекарственные средства по изобретению наряду по меньшей мере с одним соединением общей формулы (I) содержат носители, наполнители, растворители, разбавители, красители и/или связующие. Выбор вспомогательных веществ, а также применяемые количества зависят от метода введения, а именно, должно ли лекарство применяться орально, внутривенно, внутрибрюшинно, внутрикожно, внутримышечно, назально, буккально или локально. Для орального применения пригодны препараты в форме таблеток, жевательных таблеток, драже, капсул, гранул, капель, микстур или сиропов, для парентерального, местного и ингаляционного применения пригодны растворы, суспензии, легко реконституируемые сухие препараты, а также аэрозоли. Примерами пригодных форм для чрескожного применения являются предлагаемые соединения в депо в растворенной форме, в пленке-носителе или в пластыре, при необходимости с добавкой средств, способствующих проникновению через кожу. Высвобождение предлагаемых соединений в организме из препаративных форм, применяемых орально или чрескожно, может происходить пролонгированно.

Назначаемая пациенту доза активных веществ зависит от веса пациента, метода введения, показания и степени тяжести заболевания. Обычно применяемая доза составляет от 1 до 150 мг/кг по меньшей мере одного аналога талидомида формулы (I).

Фармакологические исследования
Высвобождение ΤΝF-α может быть исследовано in vitro на мононуклеарных клетках периферической крови человека (Т-лимфоциты, В-лимфоциты и моноциты) после стимуляции липополисахаридом (ЛПС). ЛПС является составной частью стенки бактериальной клетки и стимулирует моноциты и макрофаги.

Наряду со стимуляцией с помощью ЛПС высвобождение ΤΝF-α может также провоцироваться стимуляцией мононуклеарных клеток периферической крови человека специфическими в отношении Т-лимфоцитов моноклональными антителами к активирующим антигенам (антиСD2-антиСD28) или бактериальным суперантигеном токсином-1, вырабатываемым при токсическом шоке (Toxic Shock Syndrome Toxin-1 или TSST-1). Помимо высвобождения ΤΝF-α эти стимуляторы приводят, в частности, к образованию интерлейкина-2 (IL-2).

Стимуляция ЛПС мононуклеарных клеток: действие на ΤΝF-α
Высвобождение ΤΝF-α может быть исследовано in vitro на мононуклеарных клетках периферической крови человека, т.е. Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах и моноцитах, после стимуляции липополисахаридом (ЛПС). ЛПС является составной частью стенки бактериальной клетки и стимулирует моноциты и макрофаги.

Мононуклеарные клетки получали из гепаринизированной крови по крайней мере трех добровольных доноров. С этой целью по 20 мл крови фракционировали по известной методике в градиентах плотности с использованием фиколл-пак (Ficoll-Paque). Затем клетки собирали и трижды промывали клеточной культуральный средой. Используемая клеточная культуральная среда состояла из среды RPMI 1640, дополненной 2 мМ глутамином (фирма Life Technologies, Эггенштейн), 10%-ной фетальной телячьей сывороткой (фирма Life Technologies), 50 мкг/мл стрептомицина (фирма Sigma, Дейзенхофен), 50 МЕ/мл пенициллина (фирма Sigma) и 100 мкМ β-меркаптоэтанолом (фирма Merck, Дармштадт). Затем мононуклеарные клетки вносили в 15 мл клеточной культуральной среды и полученную смесь распределяли порциями по 1 мл по стерильным инкубационным 24-луночным планшетам (фирма Sigma). К 1-миллилитровым порциям смеси добавляли соответственно по 1 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, фирма Merck) или по 1 мкл раствора тестируемого вещества (в ДМСО; конечные концентрации в тесте: 0,5; 5; 12,5 и 50 мкг/мл) и смеси инкубировали в течение одного часа в инкубаторном шкафу в атмосфере СО₂ (5% СО₂, 90%-ная влажность воздуха). Затем добавляли, за исключением контроля, соответственно по 2,5 мкг ЛПС (Е. coli 0127: В8; фирма Sigma, Дейзенхофен). Инкубацию культур продолжали еще в течение 20 ч. Концентрацию ΤΝF-α в над осадочной жидкости культуры клеток определяли после окончания инкубации с помощью коммерческого набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA-анализ; фирма Boehringer-Mannheim). На основе данных, полученных для не обработанных активным веществом контрольных смесей и инкубированных тестируемыми соединениями смесей, рассчитывали степень ингибирования ΤΝF-α. С помощью прямой регрессии определяли концентрации, обеспечивающие 50%-ное ингибирование высвобождения ΤΝF-α (значения IC₅₀).

В таблице представлено ингибирующее влияние соединений согласно изобретению на индуцированное липополисахаридом высвобождение ΤΝF-α.
Стимуляция Т-лимфоцитов: ингибирование IL-2
Высвобождение интерлейкина-2 может быть исследовано путем стимуляции in vitro мононуклеарных клеток периферической крови человека, содержащей наряду с Т-лимфоцитами также В-лимфоциты и моноциты. Благодаря стимуляции поликлонов через постоянные эпитопы рецептора Т-лимфоцитов или так называемые добавочные сигнальные молекулы клеточной поверхности получают более показательные данные измерений по сравнению со стимуляцией антигенами отдельных малых популяций Т-лимфоцитов. Применяют комбинацию двух таких добавочных сигналов, а именно тех, воздействия которых опосредованы поверхностными молекулами CD2 и CD28.

Мононуклеарные клетки получали из гепаринизированной крови по крайней мере трех добровольных доноров. С этой целью по 20 мл крови фракционировали по известной методике в градиентах плотности с использованием фиколл-пак (Ficoll-Paque). Затем клетки собирали и трижды промывали клеточной культуральный средой. Используемая клеточная культуральная среда состояла из среды RPMI 1640, дополненной 2 мМ глутамином (фирма Life Technologies, Эггенштейн), 10%-ной фетальной телячьей сывороткой (фирма Life Technologies), 50 мкг/мл стрептомицина (фирма Sigma, Дейзенхофен), 50 МЕ/мл пенициллина (фирма Sigma) и 100 мкМ β-меркаптоэтанолом (фирма Merck, Дармштадт). Затем мононуклеарные клетки вносили в 15 мл клеточной культуральной среды и полученную смесь распределяли порциями по 1 мл по стерильным инкубационным 24-луночным планшетам (фирма Sigma). К 1-миллилитровым порциям смеси добавляли соответственно по 1 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, фирма Merck) или по 1 мкл раствора тестируемого вещества (в ДМСО; конечные концентрации в тесте: 0,5; 5; 12,5 и 50 мкг/мл) и смеси инкубировали в течение одного часа в инкубаторном шкафу в атмосфере СО₂ (5% СО₂, 90%-ная влажность воздуха). Затем добавляли, за исключением контроля, соответственно по 0,1 мкг/мл моноклинальных антител (Клон AICD2.M1, предоставлен проф. д-ром Мойером; анти-СD28, получен от CLB, Амстердам). Инкубацию культур продолжали еще в течение 20 ч. Концентрацию IL-2 в надосадочной жидкости культуры клеток определяли после окончания инкубации с помощью набора для ELISA-анализа (фирма Boehringer-Mannheim). На основе данных, полученных для не обработанных активным веществом контрольных смесей и инкубированных тестируемыми соединениями смесей, рассчитывали степень ингибирования IL-2.

Вещество из примера 4 в этих условиях при концентрации 50 мкг/мл ингибирует стимулированный CD2/CD28 синтез IL-2 на 86±6%. При применении стафилоккового суперантигена (Е. coli 0127: В8; Sigma, Дайзенгофен) TSST-1 (0,1 мкг/мл) в качестве стимулятора Т-лимфоцитов синтез IL-2 подавляется на 77±20%.

Вышеприведенные исследования показывают, что аналоги талидомида из класса пиперидин-2,6-дионов формулы (I) ингибируют как обусловленное воспалением высвобождение ΤΝF-α, так и индуцированный антигенами синтез интерлейкина-2.

Изобретение относится к новым замещенным пиперидин-2,6-дионам формулы (I)
где Z - -C(R¹R²)-CH₂ или -C(R¹)=CH-; R¹ - фталимид, когда Z - -C(R¹R²)-CH₂-, или одно- либо двукратно замещенный гидрокси-, метокси- или аминогруппами фталимидный радикал, когда Z обозначает -C(R¹)=CH-, R² - водород или C_1-6 алкильная группа; R³ - водород, С_1-6 алкильная группа или ароматическая кольцевая система; R⁴ - C_1-6 алкил или ароматическое кольцо. Соединения формулы (I) обладают ингибирующим действием на высвобождение TNF-α, а также на индуцированный антигеном синтез интерлейкина 2. Соединения формулы (I) могут быть получены конденсацией фталевого ангидрида с замещенной глутаминовой кислотой с последующей циклизацией полученного продукта и переводом его в имид. Другой способ получения соединений формулы (I) заключается в конденсации фталевого ангидрида с замещенным 3-аминоглутаконимидом или 5-замещенным 3-аминоглутаримидом. 3 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Замещенные пиперидин-2,6-дионы формулы (I)

в которой Z - -C(R¹R²)-CH₂- или -C(R¹)= CH-;
R¹ - фталимид, когда Z - -С(R¹R²)-CH₂-, или одно- либо двукратно замещенный гидрокси-, метокси- или аминогруппами фталимидный радикал, когда Z - -C(R¹)= CH-;
R² - водород или С_1-6 алкильная группа;
R³ - водород, C_1-6 алкильная группа или ароматическая кольцевая система;
R⁴ - C_1-6 алкил или ароматическое кольцо. 2. Замещенные пиперидин-2,6-дионы формулы (I) по п. 1, отличающиеся тем, что Z - -С(R¹R²)-CH₂-; R¹ - фталимид; R² - водород; R³ - водород или этил и R⁴ - метил или фенил. 3. Замещенные пиперидин-2,6-дионы формулы (I) по п. 1, отличающиеся тем, что Z - -С(R¹)= СН₂-; R¹ - 3,4-диметоксифталимид; R³ - этил и R⁴ - фенил. 4. Способ получения замещенных пиперидин-2,6-дионов формулы (I) по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что фталевый ангидрид конденсируют с замещенной глутаминовой кислотой, продукт циклизуют до ангидрида и последний переводят в имид. 5. Способ получения замещенных пиперидин-2,6-дионов формулы (I) по пп. 1-3, отличающийся тем, что фталевый ангидрид конденсируют с замещенным 3-аминоглутаконимидом или 5-замещенным 3-аминоглутаримидом.