СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНЫХ ЭФИРОВ L-КАРНОЗИНА И ИХ СОЛЕЙ Российский патент 2002 года по МПК C07K5/62 C07D233/64 

Изобретение относится к органической химии, а более конкретно к способам получения биологически активных производных гистединовых дипептидов, а именно сложных эфиров и солей сложных эфиров природного дипептида L-карнозина.

L-карнозин является природным нейропептидом, который проявляет разнообразную биологическую активность, включая высокую эффективность по защите нейронов в условиях окислительного стресса (ишемии мозга и сердца, гипобарической гипоксии и т.п.). Однако L-карнозин, как природное активно метаболизирующее соединение, имеет ограниченное время жизни в организме, подвергаясь расщеплению карнозиназой (Гуляева Н.В., Обидин А.Б., Левшина И.П. и соавт. // Бюл. эксп. биол. мед. 1989. Т. 107. 2. С. 144-147). Поэтому актуальна проблема химической модификации L-карнозина с целью получения соединений слабо расщепляемых карнозиназой, а также характеризующихся повышенной относительно L-карнозина гидрофобностью. Такими соединениями могут быть его сложные эфиры и их соли.

Известны методы этерификации пептидов в присутствии сухого хлористого водорода (Гершкович А. А., Кибирев В.К., Химический синтез пептидов. Киев, "Наукова думка", с. 198, 1992) и серной кислоты (Guttmann S., Boissonnas R. A. , Helv. Chim. Acta, v. 41, 6, pp. 1852-1867, 1958), но сложные эфиры карнозина здесь не описаны.

Известен способ получения Bос-замещенных сложных эфиров L-карнозина (патент Испании ES 496892, кл. C1 C 07 C 103/52, 1981) при взаимодействии замещенных аминокислот - Bос-защищенного β--аланина и гидрохлорида метилового эфира L-гистидина. После этого полученный замещенный эфир L-карнозина в две стадии полностью деблокировался (вначале с удалением Вос-защитной группировки, а затем с удалением сложноэфирной метальной группы) с образованием собственно L-карнозина. Этот известный способ синтеза эфиров L-карнозина сложен технологически и предназначен в основном для получения L-карнозина.

Известен также способ синтеза метилового эфира L-карнозина с использованием ионообменных смол (Yamashita S., Ishikawa N., Experientia, v. 24, 10, pp. 1079-1080, 1968), который тоже сложен и годится в основном для получения эфира в препаративных целях.

Наиболее близок к предлагаемому способ получения метилового эфира L-карнозина, включающий взаимодействие карнозина с метиловым спиртом в его безводной среде в присутствии хлористого тионила при температуре ниже нуля с последующей выдержкой при нулевой температуре. Целевой продукт выделяют после удаления растворителя, очищают повторным растворением в метаноле и его удалением путем упаривания (Pietta P. G., Chersi A., Gazz. Chim. Ital., v. 98, 12, pp. 1503-1510, 1968). Однако, по нашим данным, этот способ приводит к получению не самого метилового эфира L-карнозина, а его дигидрохлорида. Кроме того, этот способ воспроизводится с хорошими результатами лишь при использовании в качестве исходного соединения высокочистого природного L-карнозина. При использовании синтетического L-карнозина, как исходного вещества, этерификация в присутствии хлористого тионила приводит к заметному осмолению реакционных смесей, что затрудняет очистку и снижает выход целевых сложных эфиров или их солей.

Задача изобретения - разработать технологичный способ получения сложных эфиров L-карнозина и их солей, позволяющий использовать любое сырье и получать целевые продукты со стабильным выходом.

Задача изобретения реализуется предлагаемым способом получения сложных эфиров L-карнозина и их солей, который включает взаимодействие L-карнозина с низшим спиртом в безводной среде соответствующего спирта при охлаждении в присутствии кислотного катализатора, последующее выделение целевого продукта и его очистку. При этом все операции проводят в среде инертного газа. В качестве низших спиртов используют метиловый или этиловый спирт. В качестве кислотного катализатора используют, например, хлористый тионил, хлористый водород или серную кислоту. Для получения свободных сложных эфиров полученные соли обрабатывают щелочными реагентами, например гидроксидами, карбонатами, гидрокарбонатами щелочных металлов, водным аммиаком, пиридином. Очистку солей сложных эфиров проводят путем их переосаждения безводным диэтиловым эфиром из соответствующего спирта.

Строение полученных сложных эфиров L-карнозина и их солей описывается формулами А и В, соответственно:
(строение прототропного имидазольного фрагмента молекул изображено в соответствии с рекомендациями Merck Index, 10^th Ed., 1983, р. 1834)

Например, метиловый эфир карнозина, R=СН₃ (I), этиловый эфир карнозина, R= С₂Н₅ (II), дигидрохлорид метилового эфира карнозина, R=СН₃, хНА=2НСl (III), дигидрохлорид этилового эфира карнозина, R= С₂Н₅, хНА=2НСl (IV), сульфат этилового эфира карнозина, R=С₂Н₅, хНА=H₂SO₄ (V).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Для получения эфиров карнозина и их солей в присутствии хлористого тионила использовали природный карнозин производства России (пример 2 и 3). Для реакций в присутствии серной кислоты или хлороводорода использовали как природный L-карнозин производства России, так и синтетический L-карнозин производства Испании (примеры 1, 4, 5).

Степень чистоты полученных соединений изучалась методами тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинах "Silufol UV-254" в системе растворителей изопропанол-25%-ный водный аммиак - вода, 7:2:1, хроматограммы проявляли в парах иода (L-карнозин и его производные проявлялись в виде белых пятен) или при помощи реактива Паули с последующей обработкой раствором соды (L-карнозин и его производные проявлялись в виде красных пятен).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) осуществляли методом обратнофазовой гидрофобной хроматографии при высоком давлении в хроматографической системе: насос - Gilson 302, колонка - Ultrasphere I.P. SiOC₁₈(250х4,4 мм), регистратор - Waters 740 с использованием UV-детектора (Tracor 970 А, λ = 210 нм). В качестве подвижной фазы использовали 0,1 M NaH₂PO₄, pH=2,6.

Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С регистрировали на приборе "Bruker" AC 200-P с рабочими частотами 200,1 и 50,3 МГц, соответственно. Отнесение сигналов L-карнозиновой части молекулы сделано по данным (Friedrich J. О., Wasylishen R. R, Can..1. Chem., v.64. 11, pp. 2132-2138, 1986; Breitmaier E., VoelterW. , Carbon-13 NMR Spectroscopy. VCH, p. 423, 1987).

Пример 1. Этиловый эфир карнозина (II)
Четырехгорлую колбу емкостью 250 мл, снабженную эффективной механической мешалкой, вводом инертного газа и выводящим газ счетчиком пузырьков, соединили при помощи гибкой резиновой трубки с пробиркой, в которую поместили 2,26 г (10,0 ммоль) L-карнозина. Колбу заполнили аргоном и поместили в нее 40 мл абсолютного этилового спирта. При интенсивном перемешивании и охлаждении в ледяной бане к спирту осторожно добавили 4 мл (7,92 г, 80,9 ммоль) концентрированной серной кислоты (ρ 1,98 г/мл). Прибор прогрели до комнатной температуры и, продолжая интенсивно перемешивать, медленно вводили карнозин, добиваясь полного растворения каждой порции во избежание образования трудно растворимых комков. После добавления всего L-карнозина (3-4 ч) реакционную смесь перемешивали еще 6 ч до полного растворения и оставили на ночь. Полученный раствор отфильтровали от легкой мути, разбавили его 60 мл 96%-ного этилового спирта и медленно, при интенсивном перемешивании, добавили тонкоизмельченный гидрокарбонат натрия до нейтрализации (20-25 г, pH по окончании добавления 7,5). Осадок неорганических солей отделили на фильтре Шотта и тщательно промыли этиловым спиртом (4х30 мл), соединенные спиртовые растворы дважды прокипятили с активированным углем. Бесцветный раствор отфильтровали и подщелочили несколькими каплями 25%-ного аммиака до pH 9,5. Раствор упарили на роторном испарителе, высушили в течение 1 сут в вакуум эксикаторе над Р₂О₅ при 0,5 мм рт.ст., растворили в 25 мл абсолютного этилового спирта и оставили при -25^oС. Через 3 сут раствор декантировали с выпавшего осадка, представляющего собой остаточные карнозин и неорганические соли, вновь упарили на роторном испарителе и высушили в течение 1 нед. в вакуум-эксикаторе над P₂O₅ при 0,5 мм рт. ст. Получено 2,13 г (84%) этилового эфира Z-карнозина в виде слабоокрашенного желтоватого порошка. Т. пл. 192-194^oС (с разл. ). По данным ТСХ продукт содержит остаточный L-карнозин (R_f этилового эфира L-карнозина 0,59, R_f L-карнозина 0,22).

Пример 2. Дигидрохлорид метилового эфира карнозина (III)
Четырехгорлую колбу емкостью 250 мл, снабженную эффективной механической мешалкой, вводом инертного газа и выводящим газ счетчиком пузырьков, соединили при помощи гибкой резиновой трубки с пробиркой, в которую поместили 2,26 г (10,0 ммоль) L-карнозина. Колбу заполнили аргоном и поместили в нее 100 мл абсолютного метилового спирта. При интенсивном перемешивании и охлаждении до -10^oС к спирту медленно добавили 2,60 мл (4,30 г, 36,2 ммоль) свежеперегнанного хлористого тионила. Полученный раствор прогрели до температуры -5÷0^oС и медленно добавили к нему L-карнозин, добиваясь полного растворения каждой порции. После введения всего L-карнозина (около 8 ч) смесь перемешивали еще 2 ч и оставили на ночь при температуре -10^oС. После этого полученный раствор отфильтровали под аргоном от небольшого количества взвеси, упарили досуха на роторном испарителе, остаток вновь растворили в 20 мл абсолютного метанола и добавили 150 мл абсолютного диэтилового эфира. Высадившееся масло отделили от раствора декантацией и провели последовательное высушивание продукта в вакуум-эксикаторе при 0,5 мм рт. ст. по следующей методике:
1) над гранулами гидроксида калия до прекращения образования на их поверхности кристаллов хлорида калия - для удаления избыточного хлористого водорода (2 сут);
2) над парафиновой стружкой (1 сут);
3) над пятиокисью фосфора - для удаления этанола и воды (1 сут).

Получен слабо-желтый гигроскопичный сироп. Выход 2,03 г (65%). По данным ТСХ продукт содержит остаточный L-карнозин (R_f метилового эфира L-карнозина 0,60, R_f L-карнозина 0,22). По данным ВЭЖХ содержание в образце метилового эфира L-карнозина составило 82%, содержание примесного L-карнозина 10%, гистидина 8%.

¹Н-ЯМР (D₂O), δ, м.д.: 2,73 m (2Н, β-Ala); 3,24 м (4Н, СН₂ His; β-Ala); 3,74 с (3Н, ОСН₃); 7,34 с (1Н, N-CH=C His); 8,65 с (1Н, N-CH-N His).

Пример 3. Дигидрохлорид этилового эфира карнозина (IV) (способ 1)
Четырехгорлую колбу емкостью 250 мл, снабженную эффективной механической мешалкой, вводом инертного газа и выводящим газ счетчиком пузырьков, соединили при помощи гибкой резиновой трубки с пробиркой, в которую поместили 2,26 г (10,0 ммоль) L-карнозина. Колбу заполнили аргоном и поместили в нее 40 мл абсолютного этилового спирта. При интенсивном перемешивании и охлаждении до -10^oС к спирту медленно добавили 2,60 мл (4,30 г, 36,2 ммоль) свежеперегнанного хлористого тионила. Полученный раствор прогрели до -5÷0^oС и медленно добавили к нему L-карнозин, добиваясь полного растворения каждой порции. После введения всего L-карнозина (около 8 ч) смесь перемешивали еще 2 ч при комнатной температуре и оставили на ночь. Раствор упарили досуха на роторном испарителе, оставшееся масло вновь растворили в абсолютном этиловом спирте и высадили продукт абсолютным диэтиловым эфиром, повторили переосаждение и высушили продукт в вакуум-эксикаторе при 0,5 мм рт.ст.:
1) над гранулами гидроксида калия до прекращения образования на их поверхности кристаллов хлорида калия - для удаления избыточного хлористого водорода (2 сут);
2) над парафиновой стружкой - для удаления следов диэтилового эфира (1 сут);
3) над пятиокисью фосфора - для удаления этанола и воды (1 сут).

Выход 2,98 г (91%). Белый гигроскопичный электризующийся порошок, расплывающийся на воздухе. Т. пл. 118-120^oС. По данным ТСХ продукт содержит остаточный L-карнозин (R_f этилового эфира L-карнозина 0,59, R_f L-карнозина 0,22). По данным ВЭЖХ содержание этилового эфира карнозина составило 91,0%, содержание примесного карнозина 9,0%.

Найдено, %: С 39,69; Н 6,18; Сl 21, 20; N 16,27.

С₁₁Н₁₈N₄O₃•2НСl•0,25Н₂O.

Вычислено, %: С 39,83; Н 6,23; Cl 21,38; N 16,89.

¹Н ЯМР (D₂O, pH 3), δ, м. д.: 1,28 m (3Н, СН₃; ³J=7,1 Гц); 2,78 m (2Н, СН₂СО β-Аlа; ³J=6,7 Гц); 3,26 м (3Н, Н_про-R СН₂ His; β-Ala); 3,39 дд (1H, H_про-S СН₂ His; ²J=15,0,³J=6,1 Гц); 4,27 квад (2Н, CH₂O; ³J=7,1 Гц); 7,38 с (1H, N-CH=C His); 8,69 с (1H, N-CH-N His).

¹³С-ЯМР (D₂O), δ, м. д. : 14,29 (СН₃); 27,12 (СН₂ His); 32,68 (CH₂СО β-Ala); 36,47 ( β-Ala); 52,95 (CH His); 64,08 (CH₂О); 118,24 (C=-N His); 129,53 (N-=CH His); 134,53 (N-CH-N His); 172,70, 173,05 (2CO).

Пример 4. Дигидрохлорид этилового эфира карнозина (IV) (способ 2)
В четырехгорлой колбе емкостью 250 мл, снабженной эффективной механической мешалкой, вводом хлороводорода (нижняя часть которого не должна соприкасаться с реакционной смесью), вводом инертного газа и выводящим газ счетчиком пузырьков, суспендировали 2,26 г (10,0 ммоль) L-карнозина в 100 мл абсолютного этилового спирта. При интенсивном перемешивании при комнатной температуре в смесь пропускали ток сухого хлороводорода до полного растворения карнозина. После этого смесь охладили до -10^oС и продолжали пропускать хлороводород до насыщения им раствора. Реакционную смесь оставили на ночь при -10^oС. Дигидрохлорид этилового эфира карнозина выпадал из реакционной смеси в виде творожистого белого осадка, который отфильтровали от маточного раствора под аргоном, промыли абсолютным эфиром и высушили при комнатной температуре в вакууме 0,5 мм рт.ст.:
1) над гранулами гидроксида калия;
2) над парафиновой стружкой;
3) над пятиокисью фосфора.

Получен белый расплывающийся на воздухе электризующийся порошок. Выход 2,22 г (68%). Т. пл. 115-118^oС.

По данным ВЭЖХ содержание этилового эфира L-карнозина составило 90,5%, содержание примесного L-карнозина составило 8,0%.

¹Н-ЯМР, δ, м. д. 1. В D₂O: 1,29 m (3Н, СН₃); 2,82 m (2Н, СН₂СО β-Ala); 3,34 м (3Н, Н_pro-R СН₂ His; β-Ala); 3,39 дд (1H, Н_про-S, СН₂, His); 4,25 квад (2Н, СН₂O); 7,41 с (1H, N-CH=C His); 8,72 с (1H, N-CH-N His). 2. В DMSO-d₆: 1,14 m (3Н, СН₃); 2,28 м, 2,95 ушир. м, 3,12 м (6Н, Н_про-R, H_про-S CH₂ His, CH₂CO β-Ala, β-Ala); 4,08 квад (2Н, СH₂О); 4,56 м (1H, CH); 7,45 с (1H, N-CH=C His); 8,18 ущир. с (3Н, NH₃ ⁺), 8,82 д (1H, NH); 9,04 с (1H, N-CH-N His).

Пример 5. Сульфат этилового эфира карнозина (V)
1,61 г (6,3 ммоль) этилового эфира карнозина (II) растворили в 20 мл абсолютного этилового спирта и при интенсивном перемешивании и охлаждении в водяной бане до 5-10^oС добавили раствор 0,31 мл (0,62 г, 6,3 ммоль) 98%-ной серной кислоты в 5 мл абсолютного этилового спирта. Немедленно начал выпадать осадок моносульфата этилового эфира карнозина в виде белой липкой массы. Образец выдержали при -25^oС в течение 12 ч, осадок отделили от жидкости декантацией, промыли 5 мл холодного абсолютного этилового спирта, затем 25 мл безводного диэтилового эфира и выдержали 3 ч в вакууме 0,5 мм рт. ст. над Р₂О₅. Полученный порошок промыли безводным диэтиловым эфиром, оберегая от влаги воздуха, отжали на фильтре Шотта, закрытым сверху воронкой с подачей аргона и снова высушили над Р₂O₅ и над парафиновыми стружками. Получено 1,98 г (85%) моносульфата этилового эфира карнозина в виде легко пересыпающегося слегка желтоватого гигроскопичного порошка, т. разл. 240-245^oС.

Найдено, %:
С 36,68; H 5,68; N 15,08.

С₁₁Н₁₈N₄O₃•1,1Н₂SO₄.

Вычислено, %: С 36,48; Н 5,62; N 15,47.

¹Н ЯМР (D₂O), δ, м. д.: 1,11 m (3Н, СН₃); 2,64 m (2Н,CH₂CO β-Ala); 3,16 м (3Н, Н_про-R CH₂ His; ); 3,22 м (1Н, H_про-S СН₂ His); 4,15 квад (2Н, СН₂O); 7.22 с (1Н, N-CH=C His); 8,54 с (1Н, N-CH-N His).

Несмотря на гигроскопичность соли сложных эфиров L-карнозина, в основном представляющие собой порошки, например соединения (IV), (V), также являются перспективной лекарственной формой наряду с самими сложными эфирами L-карнозина, которые представляют собой сиропы, например соединение (I), или порошки, например соединение (II). Соли сложных эфиров карнозина стабильны при хранении без доступа влаги (не менее 2-х лет хранения при комнатной температуре для дигидрохлорида (III), не менее 6 месяцев хранения для сульфата (V).

Водные растворы солей (III), (IV), (V) характеризуются кислой реакцией среды, поэтому рН водных растворов необходимо приводить к 7,4 (фосфатный буферный раствор) сразу после растворения солей во избежание частичного гидролиза сложноэфирной группы.

Пример 6. Ферментативный гидролиз карнозина и его эфиров.

L-карнозин, как природное активно метаболизирующее соединение, имеет ограниченное время жизни в организме, подвергаясь расщеплению специфическим ферментом карнозиназой. Через 15 мин после внутрибрюшинного введения крысам его содержание в крови достигает максимума, после чего сразу начинает снижаться, возвращаясь к исходному низкому уровню через 30 мин после введения. Мозг и печень характеризуются схожей кинетикой накопления карнозина, хотя время достижения максимума сдвинуто к 30 мин, а убыли до исходного уровня - к 45-60 мин (Гуляева Н.В., Обидин А.Б., Левшина И.П. и соавт. // Бюл. эксп. биол. мед. 1989. Т. 107. 2. С. 144-147).

Устойчивость исследуемых соединений в сравнении с L-карнозином к действию карнозиназы сыворотки донорской крови исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Скорость накопления гистидина оценивали в ходе ферментативного гидролиза карнозина и его производных. Сыворотку получали из негемолизированной крови пациентов.

Активность карнозиназы измеряли в соответствии с Lenney et al (Lenney, R.P.George, A.M.Weiss, C.M.Kucera, P.W.H.Chan, G.S.Rinzler. // Clin.Chim.Acta. 1982. V. 123. P. 221-231 Roth М. // Analyt. Chem. 1971. V. 43. Р. 880-882). ВЭЖХ дипептидов и гистидина проводили на хроматографе "Altex"-334 с колонкой фирмы "Serva", использовали флуоресцентный детектор "Schoeffel GM970" (λ_возб 340 нм, λ_флуор 455 нм).

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Как показало проведенное сравнение, исследуемые производные карнозина - его синтетические этиловый и метиловый эфиры, в отличие от него самого, практически не подвергаются гидролизу карнозиназой.

Метиловый и этиловый эфиры L-карнозина являются перспективными в качестве основы для создания антигипоксических лекарственных препаратов. Они не подвергаются действию карнозиназы, зарактеризуются более длительным временем жизни в кровотоке и в тканях, чем собственно карнозин, и имеют тем самым преимущество перед ним в качестве потенциальных антигипоксических средств.

Таким образом, предлагаемый способ технологичен и позволяет получать эфиры карнозина и их соли со стабильным выходом, используя для этого карнозин любого происхождения.

Изобретение относится к способу получения сложных эфиров L-карнозина и их солей, включающему взаимодействие L-карнозина с низшим спиртом в безводной среде соответствующего спирта при охлаждении, в присутствии кислотного катализатора, последующее выделение целевого продукта и его очистку. Все стадии проводят в атмосфере инертного газа, а в качестве кислотного катализатора применяют хлористый тионил, хлористый водород или серную кислоту. Способ позволяет получить целевые продукты, которые обладают высокой биологической активностью и повышенной относительно L-карнозина гидрофобностью, со стабильным выходом из карнозина любого происхождения. 4 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения сложных эфиров L-карнозина и их солей, включающий взаимодействие L-карнозина с низшим спиртом в безводной среде соответствующего спирта при охлаждении, в присутствии кислотного катализатора, последующее выделение целевого продукта и его очистку, отличающийся тем, что все стадии проводят в атмосфере инертного газа, а в качестве кислотного катализатора применяют хлористый тионил, хлористый водород или серную кислоту. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве низших спиртов используют метиловый или этиловый. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что сложные эфиры выделяют, обрабатывая реакционную массу щелочным реагентом. 4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что в качестве щелочного реагента используют гидроксид, карбонат, гидрокарбонат щелочного металла, водный аммиак или пиридин. 5. Способ по пп.1-4, отличающийся тем, что очистку сложных эфиров проводят переосаждением безводным этиловым эфиром из соответствующего спирта.