НЕОБРАТИМЫЙ ИНГИБИТОР Ca-АДЕНОЗИНТРИФОСФАТАЗЫ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА Российский патент 2002 года по МПК C12N9/99 C07D275/04 

Изобретение относится к биохимии, в частности к применению известных производных 1,2-бензизотиазол-3-она общей формулы I

где R¹ - низший алкил или фенил и R²= Н или NО₂, в качестве необратимых ингибиторов Са²⁺-аденозинтрифосфатазы саркоплазматического ретикулума.

Са²⁺-Аденозинтрифосфатаза сарко(эндо)плазматического ретикулума (ЕС. 3.6.1.38) (SERCA) представляет собой семейство Са²⁺-транспортирующих АТФаз, имеющихся в различных типах клеток. Основная функция данного фермента заключается в регуляции внутриклеточной концентрации свободного кальция за счет энергии, выделяющейся в ходе гидролиза АТФ.

Известны различные специфические ингибиторы SЕRCA, в частности тапсигаргин и циклопиазоновая кислота (O.Thastrup, P.J.Cullen el al. "Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular calcium stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum calcium ATPase" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, v. 87, 7 p. 2466-2470; M.Suzuki, K.Muraki et al. "Cyclopiazonic acid, an inhibitor of the sarcoplasmic reticulum Ca²⁺-pump, reduces Ca²⁺-dependent K⁺ current in guinea pig smooth muscle cells" Br. J. Pharmacol. 1992. v. 107, 1б, р.134-140). Показано, что при продолжительном воздействии в условиях in vitro тапсигаргин способен вызывать апоптоз (программированную клеточную гибель) у целого ряда быстро пролиферирующих клеточных линий, включая клетки рака груди (C.Jackisch, H.A.Hahm et al. "Delayed micromolar elevation in intracellular calcium preceedes induction of apoptosis in thapsigargin-treated breast cancer cells" Clinical Cancer Res. 2000, v. 6, p. 2844-2850). Кроме этого было установлено, что тапсигаргин также обладает выраженным цитотоксичсским действием на опухолевые клетки, не зависящим от скорости их пролиферации (X.S.Lin, S.R.Denmeade et al. "The role of growth arrest in programmed (apoptotic) cell death of prostate cancer cells by thapsigargin" Prostate 1997. v.33, p.201-207).

Недостатками данного соединения, существенно ограничивающими возможность его применения в фармакологии, являются низкая растворимость в водной среде, высокая системная токсичность и нейротоксичность. В настоящее время проводится поиск менее токсичных аналогов тапсигаргина, а также эффективных ингибиторов SERCA, имеющих другую химическую структуру.

Известна водорастворимая гексанатриевая соль 8,8'-{карбонилбис[имино-3,1-фениленкарбонилимино(4-метил-3,1-фенилен)карбонилимино] } бис(нафталин-1,3,5-трисульфокислоты) - сурамин, обратимо ингибирующая активность SЕRCA (J. Т.Еmmick, S.Kwon et al. "Dual effect of suramin on calcium fluxes across sarcoplasmic rеticulum vesicle membranes" J. Pharmacol. Exp. Тher. 1994, v. 269, 2, p. 717-724) и обладающая противоопухолевыми и противопаразитарными свойствами.

Недостатками данного соединения являются сравнительно невысокая эффективность ингибирующсго действия на фермент, влияние на другие биологические объекты и нейротоксичность.

Известен N-(2-метоксиэтил)-3-нитро-1,2,4-триазол-1-ацетамид формулы II

ингибирующий активность SERCA и активный транспорт ионов кальция, а также обладающий антиместастатической активностью (Н.П. Коновалова, Л.М. Волкова и др. "Ингибирующий эффект радиосенсибилизатора АК-2123 на экспериментальные метастазы в печени и активный транспорт ионов кальция" Boпpосы онкологии 1997, т.43, 3, с.202-208).

Недостатком данного соединения является невысокая эффективность ингибирующего действия на фермент (IC₅₀ ~0,1 мМ).

Известна 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная) кислота (ДТНБ) формулы III

являющаяся модификатором SH-групп и необратимо ингибирующая SERCA (P.M. Hardwicke, P. Huvos "Effect of К⁺ and other ligands on the thiol reactivity and tryptic cleavage pattern of scallop sarcoplasmic reticulum" J. Muscle Res. Cell Motil, 1989, v.10, 3, p.229-244).

Недостатком данного соединения является сравнительно невысокая эффективность ингибирования фермента, а также неселективноcть действия на SERCA но отношению к другим биологическим объектам (напр., Mg²⁺-AТРазе, Na, K- АТРазе, Н.К-АТРазе).

Известны производные 1,2-бензизотиазол-3-она общей формулы IV

где R¹=Н, С₆Н₅, ниридил-2 и др., R² и R³ (независимо)=Н, СН₃О, Сl и др., ингибирующие агрегацию тромбоцитов (K. H. Baggaley, P. D. English et al. "Inhibitors of blood platelet aggregation. Effects of some 1,2-benzisothiazol-3-ones on platelet responsiveness to adenosine diphosphate and collagen". J. Mеd. Chem. 1985, v. 28, p. 1661-1667). Известно также, что 2-фенил-1,2-бензизотиазол-3-он вышеукачанной формулы IV, где R¹= C₆H₅ и R²=R³=Н (PZ25), обладает противовоспалительным действием, механизм которого связан с ингибированием образования супероксиданион-радикала (R.Leurs, H.Тimmеrman. A. Вast "Inhibition of superoxide anion radical production by ebselen (PZ51) and its sulfur analogue (PZ25) in guinea pig alveolar macrophages" Biochem. Internal, 1989, v.18, 2, p.295-299).

Влияние данных соединений на активность SERCA не изучено.

Известны производные 1,2-бензизотиазол-3-она вышеуказанной общей формулы I, где R¹ и R² имеют приведенные значения, в качестве продуктов органического синтеза (R. Ponci, F. Gialdi, A. Baruffini "2,2'-Dicarbomoyl-5,5'-dinitrodiphenyl disulfides and 6-nitro-1,2-benzisothiazolones" Farmaco (Pavia) Ed. Sci. 1964, 19(3), p.254-268 [10]. S.G. Ziotin. P. G. Kislitsin, A. I. Podgursky, A. V. Samеt and V. V. Semenov "Syntetic Utilization of Polynitroaromatic Compaunds. 2. Synthesis of 4,6-Dinitro-l,2-benzisothiazol-3-ones and 4,6-Dinitro-l, 2-benzisothiazoles from 2-Benzylthio-4,6-dinitrobenzamides" J. Org. Chem. 2000, 65 (25), р.8439-8443.

Биохимические свойства данных соединений не изучены.

Наиболее близким к производным общей формулы I является 7-хлор-4-нитробенз-2,1,3-оксадиазол (NBD-CI) формулы VI

необратимо ингибирующий SERCA, взаимодействуя с ее ATР-связывающим участком (А. М. Рубцов "Влияние субстратов Са²⁺-AТФазы на кинетические свойства SH-гpyпп саркоплазматического ретикулума" Биохимия, 1982, т.47, 6, с.1046-54 - прототип).

Недостатком данного соединения является сравнительно невысокая эффективность ингибирующего действия на фермент.

Целью изобретения является выявление новых ингибиторов Са²⁺-аденозинтрифосфатазы саркоплазматического ретикулума, обладающих улучшенными ингибирующими свойствами.

Поставленная цель достигается применением известных производных 1,2-бензизотиазол-3-она вышеуказанной общей формулы I, где R¹ и R² имеют приведенные значения в качестве необратимых ингибиторов SERCA.

Соединения общей формулы I, где R²=Н были получены известным способом, заключающимся во взаимодействии 2,2'-дитиодисалициловой кислоты с PCI₅ и последующим взаимодействием с R¹NН₂ [10]. Соединения общей формулы I, где R²=NO₂ ,были получены известным способом, заключающимся в реакции соответствующих 2,4,6-тринитробензамидов с бензилмеркаптаном в среде диметилформамида при комнатной температуре с последующей обработкой SO₂Cl₂.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример 1. Ингибирующее действие производных 1,2-бензизотиазол-3-она на активность SERCA.

Препарат саркоплазматического ретикулума, содержащий SERCA, получали из скелетных мышц кролика известным способом с помощью дифференциального центрифугирования. В данном препарате было показано отсутствие AТРазных активностей, не принадлежащих SERCA (Nа,К-АТРазы, Н,К-АТФазы), активность Mg-АТРазы составляла 5-7% от активности Са-АТФазы.

Концентрацию белка измеряли по методу Лоури в присутствии 1%-ного раствора дезоксихолата натрия. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.

Для регистрации активности Са-АТФазы использовали метод непрерывной спектрофотометрической регистрации в присутствии Са-ионофора А23187, используя систему сопряженных ферментативных реакций (пируваткиназа + лактатдегидрогеназа).

1. ATP+H₂О-->ADP+H₂PO₄ ^-+H⁺ (AТРаза);
2. ADP+ФЕН-->ATP+пируват (нируваткиназа - ПК);
3. Пируват+NADH-->лактат+NAD⁺ (лактатдегидрогеназа - ЛДГ).

Реакцию регистрировали но изменению оптической плотности раствора при 340 нм, которое происходит в результате уменьшения концентрации NADH в системе.

Среда для определения активности фермента содержала 80 мМ КСl, 50 мМ MOPS (рН 7,0), 5 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭГТА, 2 мМ ФЕП, 2,5 мМ АТФ (рН 7,0), 0,3 мг/мл НАДН, 5 ед. ПК, 10 ед. ЛДГ, при 37^oС (Anderson, Murphy, 1983).

Фракция саркоплазматического ретикулума из скелетных мышщ кролика не обладала активностью NADH-редуктазы. Реакцию начинали добавлением белка (4 мкг) в пробу объемом 1 мл). Измерения проводили на спектрофотометре "Hitachi 200-20" при 37^oС. Длина оптическою пути составляла 1 см.

Для изучения влияния производных 1,2-бензизотиазол-3-она на активность SERCA препарат фермента разводили средой хранения (0,25 мМ сахароза, 25 мМ имидазол, рН 7,0) так, чтобы содержание белка в среде преинкубации составляло 4 мкг в 20 мкл и преинкубировали с избытком изучаемого соединения (молярное соотношение ингибитор/фермент составляло 10-50/1) при комнатной температуре в течение различных промежутков времени, а затем из смеси, содержащей комплекс фермент-ингибитор,отбирали аликвоты объемом 20 мкл и переносили их в среду для регистрации активности объемом 1 мл. В результате раствор, содержащий комплекс фермент-ингибитор, разводили в 50 раз. Было показано, что при увеличении времени преинкубации фермента с 1,2-бензизотиазол-3-оном происходит развитие ингибирующего эффекта. После разведения ингибирование SERCA не устранялось. Активность фермента после перенесения его в среду инкубации была линейна во времени в течение (но крайней мере) 15 мин, что свидетельствует об отсутствии медленной диссоциации комплекса фермент-ингибитор. Кроме тою, ингибирующее действие изучаемых соединений на активность SЕRCA развивалось во времени. Полученные данные свидетельствуют о том, что соединения общей формулы I в интервале концентраций 10-150 мкМ проявляли свойства необратимых ингибиторов данною фермента. Анализ ингибирования (представление процесса ингибирования в виде суммы двух экспонент или одной экспоненты) и расчет констант скоростей ингибирования псевдопервого порядка проводили известным способом с использованием компьютерной программы Biochemical Utilites 3,0.

На чертеже представлена зависимость активности Са-АТФазы от времени преинкубации с различными концентрациями (25, 62,5 и 125 мкМ) 6-нитро-2-фенил-1,2-бензизотиазол-3-она (НФБИТ) и при его различном молярном избытке (10/1, 25/1 и 50/1). Расчеты молярного соотношения фермент/ингибитор проводили исходя из того, что процентное содержание фермента в используемом препарате составляло около 70% от общего количества белка. В таблице приведены расчетные константы скорости инактивация SЕRCA различными концентрациями НФБИТ.

Приведенные результаты показывают, что соединения настоящею изобретения оказывают выраженное необратимое ингибирующее действие на SЕRCA. Из данных прототипа следует, что известный аналог NBD-Cl в близких условиях так же необратимо ингибировал фермент, но его эффект, проявляющийся в концентрации 0,75 мМ, сравним с действием НФБИТ в концентрации 0,15 мМ.

Таким образом, применение производных 1,2-бензизотиазол-3-она общей формулы I расширяет ассортимент высокоэффективных необратимых ингибиторов Са²⁺-аденозинтрифосфатазы саркоплазматического ретикулума.

Изобретение относится к биохимии, в частности к применению известных производных 1,2-бензизотиазол-3-она общей формулы, где R¹ - низший алкил или фенил и R²=H или NO₂, в качестве необратимого ингибитора Са²⁺-аденозинтрифосфатазы саркоплазматического ретикулума (SERCA). Производные 1,2-бензизотиазол-3-она общей формулы оказывают более выраженное необратимое ингибирующее действие на SERCA по сравнению с аналогом - 7-хлор-4-нитробенз-2,1,3-оксадиазола (NBD-C1). NBD-C1 в близких условиях также необратимо ингибировал фермент, но его эффект, проявляющийся в концентрации 0,75 мМ, был сравним с действием 6-нитро-2-фенил-1,2-бензизотиазол-3-она в концентрации 0,15 мМ. 1 ил., 1 табл.

Применение производных 1,2-бензизотиазол-3-она общей формулы I

где R¹ - низший алкил или фенил и R²= H или NО₂,
в качестве необратимого ингибитора Са²⁺-аденозинтрифосфатазы саркоплазматического ретикулума.