НАБОР ЭСТРОГЕН-РЕЦЕПТОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РЕЦЕПТОРОВ К ЭСТРОГЕНАМ В БИОПСИЙНЫХ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2003 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к области медицины.

Эстрогены - семейство стероидных гормонов, регулирующих жизнедеятельность человеческого организма путем воздействия на ряд органов-мишеней, в первую очередь - органов половой системы. Действие эстрогенов на организм человека осуществляется через стадию связывания гормона с молекулой специфического белка - эстрогенового рецептора (ЭР), который после такого связывания с гормоном способен активировать генетический аппарат клетки и реализовать биологическую активность гормона.

Необходимость определения ЭР в человеческих клетках связана в первую очередь с тем, что целый ряд злокачественных опухолей, в том числе - очень распространенный рак молочной железы, могут быть гормон-чувствительными, т. е. рост гормон-чувствительных форм опухолей ускоряется при действии эстрогенов (см., например, Saunders РТ, Мillar MR, Williams К, Macpherson S, Bayne C, O'Sullivan С, Anderson TJ, Groome NP, Miller WR. Expression of oestrogen receptor beta (ERbetal) protein in human breast cancer biopsies. Br J Cancer 2002 Jan 21;86(2):250-6).

На этой чувствительности основано действие многих противоопухолевых препаратов, однако прежде чем такие препараты применять, необходимо убедиться в том, что опухоль обладает гормон-чувствительностью. Поскольку в подавляющем большинстве случаев причиной нечувствительности является именно отсутствие ЭР, определение этого рецептора при помощи тест-набора дает ответ на вопрос о возможности применения противоопухолевых препаратов, действующих через ЭР, т.е. позволяет выбрать правильный путь лечения.

Принцип действия набора основан на следующем:
- взаимодействии молекул ЭР (на микроскопических срезах) со специфическими антителами;
- присоединении к специфическим антителам, модифицированным биотином, комплекса стрептавидина и щелочной фосфатазы;
- получении окрашенного продукта щелочной фосфатазы и его регистрации при помощи светового микроскопа.

Принцип специфического взаимодействия антител с антигенами является фундаментальным принципом физико-химии белков и иммунохимии. В общем он описан во всех руководствах по иммунологии и иммунохимии, например "Иммунология", А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл, Мир, 2000 г.

В применении к рецепторам к стероидным гормонам и, в частности, к эстрогенам, он описан: Dabbs DJ, Landreneau RJ, Liu Y, Raab SS, Maley RH, Tung MY, Silverman JF. Detection of estrogen receptor by immunohistochemistry in pulmonary adenocarcinoma. Ann Thorac Surg. 2002 Feb; 73(2):403-5.

Принцип использования биотиновой модификации с последующим присоединением фермента и получением окрашенного продукта также является общепринятым; в применении к ЭР он описан: McCluggage WG, Sumathi VP, McBride НА, Patterson A. A panel of immunohistochemical stains, including carcinoembryonic antigen, vimentin, and estrogen receptor, AIDS the distinction between primary endometrial and endocervical adenocarcinomas. Int J Gynecol Pathol. 2002 Jan; 21(l): 11-5.

Основной не иммунохимический метод определения экспрессии ЭР основан на использовании обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Этот метод имеет существенные недостатки. Во-первых, метод ПЦР дает возможность анализировать экспрессию гена ЭР на уровне образования мРНК, но активный белок ЭР может не образовываться в клетке и в присутствии нормальной мРНК. Во-вторых, метод ПЦР с обратной транскрипцией требует выделения РНК, что весьма трудоемко, сложно технически и вообще неприменимо для широкомасштабных диагностических анализов. Оба эти недостатка отсутствуют в методе определения ЭР, предлагаемом в данном патенте.

В настоящее время в России не производятся наборы для иммунохимического определения ЭР, наиболее близким из наборов, производимых вне России, является тест-набор DAKO ER/PR System фирмы "Дако", Дания (kat. #1900 по каталогу 2002 г.).

Задачей настоящего изобретения является создание отечественного набора для иммунохимического определения эстрогенного рецептора, предназначенного для диагностических целей (см. табл.1).

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом и представляющая собой варианты.

1-й вариант.

Набор для обнаружения рецепторов к эстрогенам (ЭР) в биопсийных гистологических препаратах содержит
- раствор, восстанавливающий структуру антигена, 10х-концентрат;
- первичные антитела, представляющие собой раствор мышиных моноклональных антител к ЭР в 0,05М Трис-НСl буфере, рН 7,6, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия;
- вторичные антитела, представляющие собой раствор мышиных моноклональных биотин-меченных антител к иммуноглобулину мыши в 0.05М Трис-НСl буфере, рН 7,6, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия;
- стрептавидин-пероксидазу, представляющую собой стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена в PBS, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия;
- 3% раствор перекиси водорода;
- имидазол-НСl-буфер, рН 7,5, содержащий перекись водорода и 15 mM азид натрия;
- DAB-хромогенный субстрат: 3,3'-диаминобензидин в растворе хромогена;
- промывочный раствор, содержащий смесь солей на 1 л Трис-НСl 50 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM.

2-й вариант.

Набор для обнаружения рецепторов к эстрогенам (ЭР) в биопсийных гистологических препаратах содержит
- раствор, восстанавливающий структуру антигена, 10х-концентрат;
- первичные антитела, представляющие собой раствор мышиных моноклональных антител к ЭР в 0,05М Трис-НСl буфере, рН 7,6, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия;
- вторичные антитела, представляющие собой раствор мышиных моноклональных биотин-меченных антител к иммуноглобулину мыши в 0,05М Трис-НСl буфере, рН 7,6, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия;
- буфер-детектор, Сигма А4955;
- Стрептавидин, раствор 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе;
- Биотинилированная щелочная фосфатаза, 1 мг/мл, раствор в
- буфере-детекторе;
- NBT-BCIP - реагент, Сигма, В 1911;
- реакционный буфер, включающий Трис-HCl 50 mM, pH 9,5; NaCl 100 mM, MgCl₂ 1 mM, NaN₃ 0.1%, левамизол 0.1 мМ;
- промывочный раствор, содержащий смесь солей на 1 л Трис-НСl 50 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM.

В предлагаемом наборе "ЭСТРОГЕН-РЕЦЕПТОР":
- использованы новые моноклональные антитела к бета-цепи ЭР, специально полученные для иммунохимического окрашивания (IgG, Sigma AER311) и стандартные моноклональные антитела против IgG, коньюгированные с биотином, производства компании Sigma, также предназначенные для иммунохимического окрашивания;
- использована в качестве фермента, дающего окрашенный продукт, регистрируемый методом световой микроскопии, не только пероксидаза, но и щелочная фосфатаза, что дает более широкие возможности для оптимизации окрашивания препаратов из различных тканей, обладающих разными свойствами;
- использован комплекс щелочная фосфатаза-стрептавидин, причем стрептавидин и щелочная фосфатаза включены в состав набора раздельно, это дает возможность менять их соотношение для оптимизации определения ЭР;
- в отличии от набора PathoGene, ЭСТРОГЕН-РЕЦЕПТОР предназначен для диагностических целей.

СОСТАВ НАБОРА.

1) Раствор, восстанавливающий структуру антигена: 10x-концентрат. 100мл.

2) Первичные антитела: 7 мл раствора мышиных моноклональных антител к эстрогеновому рецептору (ЭР) в 0,05М Трис-НСl буфере, рН 7,6, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия.

3) Вторичные антитела: 7 мл раствора мышиных моноклональных биотин-меченных антител к иммуноглобулину мыши в 0,05М Трис-НСl буфере, рН 7,6, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия.

4) Стрептавидин-Пероксидаза: стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена в PBS, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия.

5) Перекись водорода: 3% раствор перекиси водорода. 15 мл.

6) Имидазол-HCl-буфер, рН 7,5, содержащий перекись водорода и 15 mM азид натрия.

7) DAB-хромогенный субстрат: 3,3'-диаминобензидин в растворе хромогена.

8) Буфер-детектор, 10 мл. Сигма, А4955.

9) Стрептавидин, раствор 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе ( 8), 2 мл.

10) Биотинилированная щелочная фосфатаза, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе ( 8), 1 мл.

11) NBT-BCIP - реагент, 200 мкл. Сигма, В 1911.

12) Реакционный буфер, 10 мл:
Трис-HCl 50 mM, pH 9,5; NaCl 100 mM, MgCl₂ 1 mM, NaN₃ 0,1%, левамизол 0.1 мМ.

13) Смесь солей для промывочного раствора - на 1 л:
Трис-НСl 50 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM.

МЕТОДИКА ПРИМЕНЕНИЯ НАБОРА.

Подготовка и предварительная обработка гистологических срезов.

Приготавливают парафиновые срезы гистологического материала толщиной 4-6 мкм. Необходимо использовать высокоадгезивные стекла, предварительно обработанные раствором полилизина или силана. Высушивают срезы в вертикальном положении 18 часов при температуре 60-80^oС. При необходимости готовые срезы хранят при 4^oС.

Далее выдерживают срезы при температуре 60-80^oС 5-15 мин и проводят депарафинирование:
- Ксилол 10 мин
- Ксилол 2 мин
- 100% спирт 1 мин
- 100% спирт 1 мин
- 96% спирт 1 мин
- 70% спирт 1 мин
- 50% спирт 1 мин
- Дистилированная вода 1 мин.

Затем при комнатной температуре дегидратируют срезы по следующей схеме:
- Н₂O дистилированная - 1 мин
- 50% спирт - 1 мин
- 70% спирт - 1 мин
- 96% спирт - 1 мин
и высушивают срезы при температуре 37^oС 5-10 мин. При необходимости подготовленные срезы можно хранить при 4^oС до 1 недели.

Окрашивание срезов.

Проводят тепловую обработку материала по стандартной гистохимической методике, используя скороварку или автоклав. Для обработки используют раствор, восстанавливающий структуру антигена. Рабочий раствор, восстанавливающий структуру антигена, готовят разведением в 10 раз входящего в набор ( 1) 10x-концентрата. Наносят на образцы по 100 мкл раствора перекиси водорода ( 5) и инкубируют 5 мин.

Промывают образцы промывочным раствором ( 13). Наносят раствор первичных антител ( 2) и инкубируют 10 мин. Промывают образцы промывочным раствором ( 13). Наносят раствор вторичных антител ( 3) и инкубируют 10 мин. Промывают образцы промывочным раствором ( 13).

Далее следует использовать один из двух вариантов методики в зависимости от выбранного фермента. Вариант 1. Окрашивание срезов с использованием пероксидазы.

1. Наносят раствор Стрептавидин-Пероксидаза: ( 4) и инкубируют 10 мин.

2. Промывают образцы промывочным раствором ( 13).

3. Готовят раствор субстрата, для чего 20 мкл раствора 7 добавляют к 1 мл буфера 6 и тщательно перемешивают. Наносят раствор субстрата на образцы и инкубируют 5 мин.

4. Промывают образцы промывочным раствором ( 13) и дистиллированной водой.

Вариант 2. Окрашивание срезов с использованием щелочной фосфатазы.

1. Наносят на срезы реагент - детектор по 100 мкл и инкубируют во влажной камере при 37^oС 30 мин.

Для приготовления реагента-детектора в буфер-детектор ( 8) добавляют раствор стрептавидина ( 9), 1:5 по объему и раствор биотинированной щелочной фосфатазы ( 10), 1:10 по объему, осторожно перемешивают и выдерживают при 37^oС 30 мин.

После этого готовый реагент-детектор можно наносить на срезы.

2. Промывают срезы 3 раза промывочным раствором ( 13) по 1 мин.

3. Наносят на срезы раствор NBT/BCIP реагента по 100 мкл на срез и инкубируют во влажной камере в темноте! при 37^oС 30 мин.

Для приготовление NBT/BCIP реагента
Готовят 2% NBT/BCIP реагент в реакционном буфере ( 12), приготовленный раствор необходимо беречь от прямых солнечных лучей.

4. Промывают срезы 3 раза промывочным раствором ( 13) по 1 мин.

5. Промывают срезы дистилированной водой 1 мин.

Срезы, окрашенные с помощью пероксидазы или щелочной фосфатазы, дегидратируют
- 96% спирт 1 мин
- 100% спирт 1 мин
- 100% спирт безводный 1 мин
- ксилол 1 мин
и заключают в канадский бальзам (или другую среду) под покровное стекло. Препарат готов к исследованию под световым микроскопом.

Изобретение относится к медицине. Предложены два варианта набора для обнаружения рецепторов к эстрогенам в биопсийных гистологических препаратах. В наборе использованы моноклональные антитела к бета-цепи ЭР, специально полученные для иммунохимического окрашивания (IgG, Sigma AER311), и стандартные моноклональные антитела против IgG, конъюгированные с биотипом, производства компании Sigma, также предназначенные для иммунохимического окрашивания. Использована в качестве фермента, дающего окрашенный продукт, регистрируемый методом световой микроскопии, не только пероксидаза, но и щелочная фосфатаза. Использован комплекс щелочная фосфатаза - стрептавидин. Набор обеспечивает эффективную диагностику при возможности окрашивания различных тканей с разными свойствами. 2 с.п. ф-лы, 1 табл.

1. Набор для обнаружения рецепторов к эстрогенам (ЭР) в биопсийных гистологических препаратах, характеризующийся тем, что он содержит раствор, восстанавливающий структуру антигена, 10х-концентрат; первичные антитела, представляющие собой раствор мышиных моноклональных антител к ЭР в 0,05М Трис-HCl буфере, рН 7,6, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия; вторичные антитела, представляющие собой раствор мышиных моноклональных биотин-меченных антител к иммуноглобулину мыши в 0,05М Трис-HCl буфере, рН 7,6, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия; стрептавидин-пероксидазу, представляющую собой стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена в PBS, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия; 3% раствор перекиси водорода; имндазол-НС1-буфер, рН 7,5, содержащий перекись водорода и 15 mM азид натрия; DAB-хромогенный субстрат, 3,3'-диаминобензидин в растворе хромогена; промывочный раствор, содержащий смесь солей на 1 л Трис-НС1 50 mM, рН 8,0; NaCl 150 mM. 2. Набор для обнаружения рецепторов к эстрогенам (ЭР) в биопсийных гистологических препаратах, характеризующийся тем, что он содержит раствор, восстанавливающий структуру антигена, 10х-концентрат; первичные антитела, представляющие собой раствор мышиных моноклональных антител к ЭР в 0,05М Трис-HCl буфере, рН 7,6, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия; вторичные антитела, представляющие собой раствор мышиных моноклональных биотин-меченных антител к иммуноглобулину мыши в 0,05М Трис-HCl буфере, рН 7,6, содержащем бычий сывороточный альбумин и 15 mM азид натрия; буфер-детектор, Сигма А4955; Стрептавидин, раствор 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе; биотинилированную щелочную фосфатазу, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе; NBT-BCIP - реагент, Сигма, В1911; реакционный буфер, включающий Трис-НС1 50 mM, рН 9,5; NaCl 100 mM, MgCl₂ l mM, NaN₃ 0,1%, левамизол 0,1 мМ; промывочный раствор, содержащий смесь солей на 1 л Трис-НС1 50 mM, рН 8,0; NaCl 150 mM.