СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ И ОНКОГЕННЫХ ВИРУСОВ, ИНТЕГРИРОВАННЫХ В ХРОМОСОМЫ ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК Российский патент 2002 года по МПК G01N33/48 G01N33/68 G01N1/28 

Описание патента на изобретение RU2178173C1

Изобретение относится к области медицины и, в частности, касается обнаружения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток. Такое обнаружение производится в биопсийных гистологических препаратах.

Среди вирусов, инфекционных для человека и животных, существует большое количество таких, которые в ходе инфекционного цикла включают свой генетический материал (т. е. молекулу ДНК) в состав хромосомы инфицированной клетки, после чего генетическая информация вируса передается потомству данной инфицированной клетки. По этой схеме построен инфекционный цикл вирусов папилломы (вызывает инфекционную папиллому, кандилому и ряд злокачественных опухолей) и полиомы человека, вируса иммунодефицита человека (вызывает СПИД), интеграция часто наблюдается при инфекции вирусами герпеса различных типов, в т. ч. т. н. вирусом Эпштейна-Барр или герпес-4 (вызывает инфекционный мононуклеоз и ряд злокачественных опухолей)) и др. Эти группы вирусов в высшей степени важны, поскольку вызываемые ими заболевания широко распространены и представляют существенную опасность, а их диагностика и клинический прогноз в настоящее время несовершенны.

Основной метод определения вирусной ДНК, используемый в настоящее время, - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Его принципиальный недостаток - невозможность определить, в каких именно клетках или тканях больного присутствует вирус (т. е. можно определить только сам факт наличия вируса в крови больного или биопсийном материале).

Принцип способа и набора для определения инфекционных и онкогенных вирусов основан на
- денатурации ДНК в клеточных ядрах (на микроскопических срезах) и последующей ренатурации со специфическим олигонуклеотидным зондом - такая ренатурация происходит только при наличии в данной клетке вирусной ДНК;
- присоединении к специфическому олигонуклеотидному зонду, модифицированному биотином, комплекса стрептавидина и щелочной фосфатазы;
- получении окрашенного продукта щелочной фосфатазы и его регистрация при помощи светового микроскопа.

Принцип специфической денатурации-ренатурации является фундаментальным принципом физико-химии нуклеиновых кислот. В общем он описан во многих руководствах по нуклеиновым кислотам, например "Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот", под ред. А. С. Спирина, 1990. В применении к вирусу папилломы человека (ВПЧ) он описан:
Boshart M. et. al. A new type of papillomavims DNA, its presence in genital cancer biopsies. . . EMBO J. 1984, 3, 1151-1157.

Lorincz A. T. et. al. A new type of papillomavims associated with cancer. . . Virology 1987, 159, 187-190.

Принцип использования биотиновой модификации с последующим присоединением фермента и получением окрашенного продукта также является общепринятым; в применении к ВПЧ он описан:
Brigati D. J. et. al. Detection of viral genomes in cultured cells and paraffin-embedded tissue. . . Virology 1983, 126, 32-50.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа и набора, которые способны решить проблему специфического определения вирусов в инфицированных клетках.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Способ определения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток, проводят на гистологических срезах. Последние обрабатывают раствором протеиназы К и инкубируют во влажной камере при 37oС 15 минут, далее раствор протеиназы сливают, а срезы промывают дистиллированной водой и дегидратируют спиртом, повышая концентрацию спирта при каждой последующей обработке, затем срезы высушивают и наносят олигонуклеотидный зонд, выбранный из группы:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд
объединенные в наборы
ВПЧ универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18-зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онко-зонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онко-зонды 3,4,6
и инкубируют во влажной камере при 37oС 90-120 мин, далее срезы промывают раствором, содержащим формамид 50% SSC 0,5х, рН 7,0 и раствором, содержащим трис-HCL рН 8,0 и NaCl, наносят буфер-детектор, содержащий стрептавидин и щелочную фосфатазу в соотношении 10: 2: 1, инкубируют при 37oС в течение 30 мин, неоднократно промывают раствором солей Трис-НСl и NaCl, наносят раствор реагента, включающего Трис-НСl рН 9,5, NaCl, MgCl, NAN3 и левамизол, инкубируют во влажной камере в темноте при 37oС 30 мин, неоднократно промывают раствором, содержащим Трис-НСl и NaCl, затем дистиллированной водой, дегидратируют спиртом и ксилолом, срезы заключают в канадский бальзам и исследуют под световым микроскопом.

Кроме того, предложен тест-набор для осуществления способа, названный заявителем "Микро-вирус", который содержит
а) олигонуклеотидные зонды для обнаружения ВПЧ
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд
объединенные в наборы
ВПЧ универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онко-зонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онко-зонды 3,4,6
раствор:
SSC 2х (рН 7,0)
формамид 50%
декстрансульфат 5%
б) раствор промывочный для гибридизации:
формамида 50%
SSC 0,5x, рН 7,0
в) буфер-детектор. Сигма, А 4955.

г) стрептавидин, раствор 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе ( 3).

д) биотинилированная щелочная фосфатаза, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе ( 3).

е) NBT-BCIP - реагент, 200 мкл. Сигма, В1911.

ж) протеиназа К, 5 мг, лиофилизированная.

з) реакционный буфер:
Трис-НСl 50 mM, рН 9,5, NaCl 100 mМ, MgCl2 1 mM, NaN3 0,1%
левамизол 0,1 мМ.

и) смесь солей для промывочного раствора - на 1 л:
Трис-НСl 50 mM, рН 8,0, NaCl 150 mM.

Тест-набор "Микро-вирус" предназначен для обнаружения интегрированного вируса и определения типа этого вируса в инфицированных клетках.

Вирус папилломы человека (ВПЧ). Тест-наборы "Микро-вирус" ВПЧ-универсал для определения ВПЧ любого типа, "Микро-вирус" ВПЧ-6/11 для определения ВПЧ типов 6 и 11, "Микро-вирус" ВПЧ-16/18 для определения ВПЧ типов 16 и 18 предназначены для определения перечисленных типов ВПЧ.

При анализе и лечении папилломы человека необходимо знать, какой тип вируса вызвал данную папиллому. Во-первых, в зависимости от типа вируса используются разные протоколы лечения. Во-вторых, вирусы типов 6 и 11 являются высокоонкогенными для папилломы и при их обнаружении необходима антиопухолевая терапия. Эти вирусы выявляются набором ВПЧ-6/11, а если папиллома вызвана другим, менее опасным типом ВПЧ, он выявляется набором ВПЧ-универсал.

При кандиломе высокоонкогенными являются типы 16 и 18, а тип 6 - среднеонкогенным. Таким образом, необходимую информацию для прогноза и лечения также можно получить, используя набор "Микро-вирус".

Помимо этого при начале опухолевого процесса, вызванного вирусом папилломы, в человеческих хромосомах остаются только два гена ВПЧ, т. н. вирусные онкогены Е6 и Е7. Набор ВПЧ-универсал позволяет зарегистрировать этот факт (в наборе есть соответствующий олигонуклеотидный зонд на ген Е6) и сделать вывод о переходе инфекционного процесса в опухолевый, что необходимо для правильного лечения такого заболевания.

При использовании тест-набора "Микро-вирус" инфицированная клетка непосредственно видна под микроскопом, что дает возможность прямо определить тип ткани, локализацию в пораженном органе, морфологические изменения инфицированной клетки и т. д. Эта информация, необходимая для определения диагноза, прогноза развития заболевания, оптимального пути лечения, не может быть получена ни методом ПЦР, ни каким-либо другим путем.

Единственный существующий в настоящее время метод определения ВПЧ, основанный на аналогичном принципе, используется в наборе PathoGene фирмы Enzo.

Однако набор "Микро-вирус" отличается от него:
- стрептавидин и щелочная фосфатаза включены в состав набора "Микро-вирус" раздельно, это дает возможность менять их соотношение для оптимизации определения вируса;
- использование коротких олигонуклеотидных зондов (длина 30 нуклеотидов) дает возможность использовать одну отмывку раствором для гибридизации вместо трех, что ускоряет определение;
- набор "Микро-вирус" позволяет не проводить дополнительное окрашивание клеток, что создает оптимальное соотношение сигнала и фона и предохраняет от маскировки специфического сигнала дополнительным клеточным красителем;
- используемый для набора "Микро-вирус" химические синтез и модификация специфических зондов выгодно отличаются от энзиматических, применяемых в PathoGene, поскольку позволяют достичь более высокой регулярности модификации зондов, т. е. более высокой специфичности и воспроизводимости результатов;
- модификация производится по стандартной методике с использованием препарата "Biotin-x-x-NHS" производства компании "Сигма";
- наличие в наборе "Микро-вирус" специфического зонда для определения вирусного онкогена Е6 позволяет использовать его для диагностики вирус-зависимой злокачественной опухоли.

В отличие от набора PathoGene "Микро-вирус" предназначен для диагностических целей.

Кроме того, в состав набора "Микро-вирус" для ВПЧ входят новые олигонуклеотидные зонды, имеющие оригинальную нуклеотидную последовательность.

Специфические олигонуклеотидные зонды
В каждый из этих тест-наборов включены специфические олигонуклеотидные зонды, соответствующие определяемому типу вируса:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд (37-46 по L1)
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд (48-77 по L1)
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд (95-124 по L1)
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд (30-59 по L1)
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд (138-167 по Е6)
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд (45-74 по Е7)
примечание: в скобках приведены названия генов и цифрами указаны порядковые номера нуклеотидов в этих генах, которые соответствуют нуклеотидным последовательностям зондов. Зонды для набора "Микро-вирус" ВПЧ (всего 7 вариантов набора):
ВПЧ-универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онко-зонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онко-зонды 3,4,6
Конкретный пример осуществления способа 1.

Готовят парафиновые срезы гистологического материала толщиной 4-6 мкм. При этом используют высокоадгезивные стекла, предварительно обработанные раствором полилизина или силана.

Срезы высушивают в вертикальном положении 18 часов при температуре 60-80oС. При необходимости готовые срезы хранят при 4oС.

Далее срезы выдерживают при температуре 60-80oС 5-15 мин и проводят депарафинирование обработкой:
Ксилол - 10 мин
Ксилол - 2 мин
100% спирт - 1 мин
100% спирт - 1 мин
96% спирт - 1 мин
70% спирт - 1 мин
5-% спирт - 1 мин и
дистиллированной водой - 1 мин.

Стекла высушивают 5-10 мин при температуре 37oС и на каждый срез наносят по 100 мкл раствора протеиназы К в рабочем разведении и инкубируют при 37oС 15 мин во влажной камере.

Для приготовления раствора протеиназы К в рабочем разведении растворяют 5 мг лиофилизированной протеиназы К в 2 мл промывочного раствора. Полученный раствор является концентратом 10х, его разделяют на аликвоты 100-300 мкл и хранят замороженным при -20oС. Срок хранения замороженного раствора - 1 год, повторное замораживание не допускается.

Для приготовления раствора протеиназы К в рабочем разведении размораживают концентрат 10х и разводят в 10 раз промывочным раствором. При комнатной температуре рабочий раствор стабилен 1 час, хранение рабочего раствора не допускается.

При комнатной температуре сливают со срезов раствор протеиназы К, промывают дистиллированной водой и дегидратируют по следующей схеме:
Н2О дистиллированная - 1 мин
50% спирт - 1 мин
70% спирт - 1 мин
96% спирт - 1 мин.

Срезы высушивают при температуре 37oС 5-10 мин. При необходимости подготовленные срезы можно хранить при 4oС до 1 недели.

Затем наносят на срез 50 мкл ВПЧ ДНК зонда. Аккуратно без пузырей накрывают покровным стеклом и стекла инкубируют при температуре 95oС 3-10 мин, далее срезы, не снимая покровных стекол, помещают во влажную камеру для инкубации при 37oС на 90-120 мин, осторожно удаляют со срезов покровные стекла и наносят на срезы 100 мкл промывочного раствора для гибридизации и инкубируют 2 мин.

Осторожно сливают со стекол раствор и еще раз наносят на срез промывочный раствор для гибридизации и инкубируют во влажной камере при 37oС 10 мин. Срезы промывают 3 раза промывочным раствором по 1 мин при комнатной температуре. На срезы наносят реагент-детектор по 100 мкл и инкубируют во влажной камере при 37oС 30 мин.

Приготовление реагента-детектора:
В буфер-детектор добавляют раствор стрептавидина 1: 5 по объему и раствор биотинированной щелочной фосфатазы 1: 10 по объему, осторожно перемешивают и выдерживают при 37oС 30 мин. После этого готовый реагент-детектор можно наносить на срезы.

Срезы промывают 3 раза промывочным раствором по 1 мин. На срезы наносят раствор NBT/BCIP реагента по 100 мкл на срез и инкубируют во влажной камере в темноте! при 37oС 30 мин.

Приготовление NBT/BCIP реагента:
Готовят 2% NBT/BCIP реагент в реакционном буфере, приготовленный раствор берегут от прямых солнечных лучей. Срезы промывают 3 раза промывочным раствором по 1 мин, затем дистиллированной водой 1 мин, дегидратируют:
96% спирт - 1 мин
100% спирт - мин
100% спирт - 1 мин
Ксилол - 1 мин
и заключают в канадский бальзам (или другую среду) под покровное стекло. Препарат исследуют под световым микроскопом.

Конкретный пример 2.

СОСТАВ НАБОРА.

а) Пробы олигонуклеотидные для обнаружения ВПЧ, универсальная и тип-специфические, растворы по 1 мл, 10 о. е. /мл;
Раствор:
SSC 2х (рН 7,0)
формамид 50%
декстрансульфат 5%
б) Раствор промывочный для гибридизации, 10 мл.

Формамида 50%
SSC 0,5x, рН 7,0
в) Буфер-детектор, 10 мл. Сигма, А 4955.

г) Стрептавидин, раствор 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе, 2 мл.

д) Биотинилированная щелочная фосфатаза, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе, 1 мл.

е) NBT/BCIP - реагент, 200 мкл. Сигма, В 1911.

ж) Протеиназа К, 5 мг, лиофилизированная.

з) Реакционный буфер, 10 мл:
Трис-НСl 50 mM, рН 9,5; NaCl 100 mМ, MgCl2 1 mM, NaN3 0,1%
Левамизол 0,1 мМ.

и) Смесь солей для промывочного раствора - на 1 л:
Трис-НСl 50 mM, рН 8,0; NaCl 150 mM.

к) Контрольные препараты (3 шт. )

Похожие патенты RU2178173C1

название год авторы номер документа
НАБОР "МИКРОВИРУС" ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ВИЧ, ИНТЕГРИРОВАННОЙ В ХРОМОСОМЫ ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК 2001
  • Иткес А.В.
  • Завалишина Л.Э.
RU2192011C1
НАБОР ЭСТРОГЕН-РЕЦЕПТОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РЕЦЕПТОРОВ К ЭСТРОГЕНАМ В БИОПСИЙНЫХ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ (ВАРИАНТЫ) 2002
  • Иткес А.В.
  • Завалишина Л.Э.
  • Щербо С.Н.
RU2209634C1
ПОЛИПЕПТИЛ Р102, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА, ФРАГМЕНТ ДНК НР 102, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД Р102, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РН А102, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД Р102, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА Р102 1992
  • Зайцев И.З.
  • Суханова Л.Л.
  • Алаторцева Г.И.
  • Гольцов В.А.
  • Гринев А.А.
  • Алаторцев В.Е.
  • Зверев В.В.
  • Полетаева Н.Н.
  • Блинов В.М.
  • Носкова О.В.
  • Лобанова А.Л.
  • Покровский В.В.
  • Суворова З.К.
  • Буравцова Е.В.
  • Красных В.Н.
RU2071502C1
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА БОЛЕЗНИ АУЕСКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ 2000
  • Глотов А.Г.
  • Орешкова С.Ф.
  • Кувшинов В.Н.
  • Ильичев А.А.
RU2180115C2
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ IN SITU (FISH) 2023
  • Стаффорд Виктория Васильевна
  • Комина Алина Константиновна
  • Стрельцова Яна Борисовна
  • Новичкова Елена Михайловна
  • Степанова Татьяна Валерьевна
  • Дроздова Елена Ивановна
  • Гулюкин Алексей Михайлович
RU2806252C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОГО РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ IN-SITU (FISH) 2023
  • Стаффорд Виктория Васильевна
  • Комина Алина Константиновна
  • Стрельцова Яна Борисовна
  • Новичкова Елена Михайловна
  • Южаков Антон Геннадиевич
  • Красников Никита Юрьевич
  • Степанова Татьяна Валерьевна
  • Лопунов Сергей Витальевич
RU2823531C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЦИРКОВИРУСНОЙ БОЛЕЗНИ СВИНЕЙ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ IN-SITU (FISH) 2023
  • Стаффорд Виктория Васильевна
  • Комина Алина Константиновна
  • Стрельцова Яна Борисовна
  • Новичкова Елена Михайловна
  • Гулюкин Алексей Михайлович
RU2823532C1
СУБСТРАТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИНТЕГРАЗЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 2002
  • Семенова Е.А.
  • Покровский А.Г.
RU2234535C2
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК ИЗ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ 2000
  • Данилевич В.Н.
  • Гришин Е.В.
RU2185440C2
НАБОР РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЛАЗМИДНЫХ ДНК РYAI 11-19, РYAI 2-45, РYS 37 И РYAI 7-29 ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИСХОЖДЕНИЯ ДОБАВОЧНЫХ ИЛИ МАРКЕРНЫХ (МИНИ-) ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА 2002
  • Юров Ю.Б.
  • Соловьев И.В.
  • Ворсанова С.Г.
  • Александров И.А.
  • Демидова И.А.
RU2200761C1

Реферат патента 2002 года СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ И ОНКОГЕННЫХ ВИРУСОВ, ИНТЕГРИРОВАННЫХ В ХРОМОСОМЫ ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК

Изобретение относится к области медицины и, в частности, касается обнаружения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток. Обнаружение производится в биопсийных гистологических срезах, которые обрабатывают раствором протеиназы К, инкубируют, дегидратируют спиртом и наносят специфический олигонуклеотидный зонд, далее инкубируют с буфером-детектором, срезы заключают в канадский бальзам и исследуют под световым микроскопом. Кроме того, предложен тест-набор для осуществления способа, названный "Микро-вирус". Изобретение позволяет повысить специфичность определения вирусов в инфицированных клетках. 2 с. п. ф-лы.

Формула изобретения RU 2 178 173 C1

1. Способ определения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток, характеризующийся тем, что гистологические срезы обрабатывают раствором протеиназы К и инкубируют во влажной камере при 37oС 15 мин, далее раствор протеиназы сливают, а срезы промывают дистиллированной водой и дегидратируют спиртом, повышая концентрацию спирта при каждой последующей обработке, затем срезы высушивают и наносят олигонуклеотидный зонд, выбранный из группы:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд;
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд;
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд;
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд;
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд;
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд;
объединенные в наборы
ВПЧ - универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онкозонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онкозонды 3,4,6;
и инкубируют во влажной камере при 37oС 90-120 мин, далее срезы промывают раствором, содержащим формамид 80% SSС 0,5х, рН 7,0, и раствором, содержащим трис-НСL рН 8,0 и NaCl, наносят буфер-детектор, содержащий стрептавидин и щелочную фосфатазу в соотношении 10: 2: 1, инкубируют при 37o в течение 30 мин, неоднократно промывают раствором солей Трис-НСl и NaCl, наносят раствор реагента, включающего Трис-НСl рН 9,5, NaCl, MgCl, NAN3 и левамизол, инкубируют во влажной камере в темноте при 37oС 30 мин, неоднократно промывают раствором, содержащим Трис-HCl и NaCl, затем дистиллированной водой, дегидратируют спиртом и ксилолом, срезы заключают в канадский бальзам и исследуют под световым микроскопом.
2. Набор для индикации инфекционных и онкогенных вирусов интегрированных в хромосомы инфицированных клеток, характеризующийся тем, что он содержит а) олигонуклеотидные зонды для обнаружения ВПЧ:
tcaactgttt gttactgtgg tagataccac - тип 6 зонд;
tgtatccaag gttgttgcca cggatgcgta - тип 11 зонд;
ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg - тип 18 зонд;
tgtctacttg cctcctgtcc cagtatctaa - тип 16 зонд;
catagaccag ttgtgcaaga cgtttaatct - тип 6/11 зонд;
ccacaggagc gacccagaaa gttaccacag - тип 16 зонд;
объединенные в наборы
ВПЧ - универсал смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 зонды 1,2;
ВПЧ-6/11 - универсал зонды 1,2 и смесь 1,2,3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4;
ВПЧ-16/18 - зонды 3,4 и смесь зондов 1,2,3,4;
ВПЧ-6/11 - онкозонды 1,2,5;
ВПЧ-16/18 - онкозонды 3,4,6;
Раствор: SSC2x (рН 7,0), формамид 50%, декстрансульфат 5%,
б) Раствор промывочный для гибридизации, 10 мл, формамида 50%, SSC 0,5х, рН 7,0.

в) Буфер-детектор. Сигма, А4955.

г) Стрептавидин, раствор 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе.

д) Биотинилированная щелочная фосфатаза, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе.

е) NBT|BCIP-реагент, 200 мкл. Сигма, В 1911.

ж) Протеиназа К, 5 мг, лиофилизированная.

з) Реакционный буфер: трис-НСl 50 mM, pH 9,5; NaCl 100 mM, MgCl2 1 mM, NaN3 0,1%, левамизол 0,1 мМ
и) Смесь солей для промывочного раствора - на 1 л: трис-HCl 50 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2002 года RU2178173C1

BRIGATI D.J
et al (Virology, 1983, 126, 32-50)
RU 2146149 C1, 10.03.2000
МУТАЦИИ ГЕНА МТS В ЗАРОДЫШЕВОЙ ЛИНИИ И СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМ ОПУХОЛЯМ В ГЕНЕ МТS 1995
  • Скольник Марк Х.
  • Кеннон-Элбрайт Лайза А.
  • Кэмб Александр
RU2161309C2
ГЕН MTS, МУТАЦИИ ДАННОГО ГЕНА И СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА MTS 1995
  • Кэмб Александр
RU2164419C2
СПОСОБЫ И НАБОРЫ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ГЕНАМПЛИФИКАЦИОННОЙ ДИАГНОСТИКИ МЕТОДАМИ ПЦР И РНК-ПЦР 2000
  • Федоров Н.А.
  • Елов А.А.
  • Суханов Ю.С.
RU2164532C1

RU 2 178 173 C1

Авторы

Иткес А.В.

Даты

2002-01-10Публикация

2001-03-30Подача