НАБОР "МИКРОВИРУС" ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ВИЧ, ИНТЕГРИРОВАННОЙ В ХРОМОСОМЫ ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК Российский патент 2002 года по МПК G01N33/53 G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины и, в частности, касается обнаружения инфекционных и онкогонных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток. Такое обнаружение производится в биопсийных гистологических препаратах.

Среди вирусов, инфекционных для человека и животных, существует большое количество таких, которые в ходе инфекционного цикла включают свой генетический материал (т.е. молекулу ДНК) в состав хромосомы инфицированной клетки, после чего генетическая информация вируса передается потомству данной инфицированной клетки. По этой схеме построен инфекционный цикл вируса иммунодефицита человека (вызывает СПИД), вирусов папилломы (вызывает инфекционную папиллому, кандилому и ряд злокачественных опухолей) и полиомы человека, интеграция часто наблюдается при инфекции вирусами герпеса различных типов, в т. ч. т.н. вирусом Эпштейна-Барр или герпес-4 (вызывает инфекционный мононуклеоз и ряд злокачественных опухолей) и др. Эти группы вирусов в высшей степени важны, поскольку вызываемые ими заболевания широко распространены и представляют существенную опасность, а их диагностика и клинический прогноз в настоящее время несовершенны; предлагаемый автором тест-набор способен в значительной степени решить эту проблему путем специфического определения вирусов в инфицированных клетках.

Основной метод определения вирусной ДНК, используемый в настоящее время - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Его принципиальный недостаток - невозможность определить, в каких именно клетках или тканях больного присутствует вирус (т.е. можно определить только сам факт наличия вируса в крови больного или биопсийном материале).

Задачей настоящего изобретения является создание набора, позволяющего не только обнаружить интегрированный вирус, но и определить тип этого вируса в инфицированных клетках.

Для решения поставленной задачи предложен набор, включающий:
специфические олигонуклеотидные зонды, соответствующие определенному типу вируса
ВИЧ-1:
1) aaattgggcctgaaaatccatacaatactc
2) олигонуклеотидные зонды, характеризуемые следующими параметрами:
длина - 25-50 нуклеотидов,
локализация - гомология с участком генома ВИЧ prt-pol,
Г-Ц состав - 30-70% ГЦ пар.

ВИЧ-2:
олигонуклеотидные зонды, характеризуемые следующими параметрами:
длина - 25-50 нуклеотидов,
локализация - гомология с участком генома ВИЧ prt-pol,
Г-Ц состав - 30-70% ГЦ пар.

Раствор промывочный для гибридизации, 1 флакон, 10 мл.

Реагент-детектор, 1 флакон, 10 мл.

Стрептавидин, 2 мл, 1 флакон.

Щелочная фосфатаза, 1 мл, 1 флакон.

NBT-BCIP - реагент, 200 мкл, 1 темная пробирка Эппендорф.

Протеиназа К, 5 мг, лиофилизированная, 1 флакон.

Реакционный буфер, 1 флакон 10 мл.

Смесь солей для промывочного раствора - на 1 л, упаковка в полиэтилене.

Контрольные препараты (3 шт.).

Данный тест-набор предназначен для обнаружения инфекционных и онкогенных вирусов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток; такое обнаружение производится в биопсийных гистологических препаратах. Способ обнаружения специфическая гибридизация элементов вирусного генома с олигонуклеотидными зондами, модифицированными биотином, с последующим присоединением к зондам комплекса стрептавидина и щелочной фосфатазы. В результате этого при наличии вируса образуется окрашенный продукт щелочной фосфатазы, который регистрируется с помощью светового микроскопа.

Тест-набор "МИКРОВИРУС" имеет универсальные компоненты для определения различных типов вирусов и специфические олигонуклеотидные зонды для каждого конкретного вируса. Таким образом, набор "МИКРОВИРУС" существует в разных вариантах для разных вирусов; например - "МИКРОВИРУС" ВИЧ-универсал для определения обоих типов вирусов иммунодефицита человека, "МИКРОВИРУС" ВИЧ-1 и "МИКРОВИРУС" ВИЧ-2 - для вирусов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 соответственно.

При паталогоанатомическом исследовании больных, скончавшихся в результате различных инфекционных заболеваний, существует необходимость ответа на вопрос о том, были ли эти больные инфицированы ВИЧ и не являлась ли инфекция, бывшая непосредственной причиной смерти, лишь вторичной, т. е. не развивалась ли она на фоне первичной инфекции ВИЧ. Для такого исследования непригодны обычные методы, т. к. все они основаны на анализе спектров антител, вирусных белков или вирусной ДНК(РНК) в сыворотке крови. Предлагаемый способ основан на микроскопическом обнаружении интегрированной ДНК в клеточных ядрах непосредственно в тканях, а именно в мозге и лимфатических узлах. Наличие вируса в этих тканях общеизвестно, этот факт опубликован:
Torres-Munoz J. , Stockton P., Tacoronte N., Roberts B., Maronpot R.R., Petito C.K. Detection of HIV-1 gene sequences in hippocampal neurons isolated from postmortem AIDS brains by laser capture microdissection. J. Neuropathol Exp Neurol. 2001 Sep; 60(9): 885-92.

Li Y, Kappes J.C., Conway J.A., Price R.W., Shaw G.M., Hahn B.H.. Molecular characterization of human immunodeficiency virus type 1 cloned directly from uncultured human brain tissue: identification of replication-competent and -defective viral genomes. J. Virol. 1991 Aug; 65(8):3973-85.

Принцип действия предлагаемого набора основан на следующем:
- денатурации ДНК в клеточных ядрах (на микроскопических срезах) и последующей ренатурации со специфическим олигонуклеотидным зондом - такая ренатурация происходит только при наличии в данной клетке вирусной ДНК;
- присоединении к специфическому олигонуклеотидному зонду, модифицированному биотином, комплекса стрептавидина и щелочной фосфатазы;
- получение окрашенного продукта щелочной фосфатазы и его регистрация при помощи светового микроскопа.

Принцип специфической денатурации-ренатурации является фундаментальным принципом физико-химии нуклеиновых кислот. В общем он описан во всех руководствах по нуклеиновым кислотам, например, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот, под ред. А. С. Спирина, 1990. В применении к вирусу иммунодефицита использование этого метода не описано, наиболее близким является его описание по отношению к вирусу папилломы человека (ВПЧ):
Boshart M. et al. A new type ofpapillomavims DNA, its presence in genital cancer biopsies... EMBO J. 1984, 3, 1151-1157.

Lorincz A.T. et al. A new type of papillomavirus associated with cancer. .. Virology 1987, 159, 187-190.

Принцип использования биотиновой модификации с последующим присоединением фермента и получением окрашенного продукта также является общепринятым; в применении к вирусу иммунодефицита использование этого метода также не описано, наиболее близким является его описание также по отношению к вирусу папилломы человека (ВПЧ):
Brigati D. J. et al. Detection of viral genomes in cultured cells and paraffin-embedded tissue... Virology 1983, 126, 32-50.

Отличия набора МИКРОВИРУС:
- стрептавидин и щелочная фосфатаза включены в состав набора МИКРОВИРУС раздельно, это дает возможность менять их соотношение для оптимизации определения вируса;
- использование коротких олигонуклеотидных зондов (длина - 30 нуклеотидов) дает возможность использовать одну отмывку раствором для гибридизации, что ускоряет определение;
- набор МИКРОВИРУС позволяет не проводить дополнительное окрашивание клеток, что создает оптимальное соотношение сигнала и фона и предохраняет от маскировки специфического сигнала дополнительным клеточным красителем;
- используемые для набора МИКРОВИРУС химические синтез и модификация специфических зондов выгодно отличаются от энзиматических, поскольку позволяют достичь более высокой регулярности модификации зондов, т.е. более высокой специфичности и воспроизводимости результатов; модификация производится по стандартной методике с использованием коммерческого препарата "Biotin-x-x-NHS" производства компании "Сигма";
- набор МИКРОВИРУС предназначен для диагностических целей.

Кроме того, в состав наборов МИКРОВИРУС для ВИЧ входят новые олигонуклеотидные зонды, имеющие оригинальную нуклеотидную последовательность.

Конкретный пример 1.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАБОРА.

Готовят парафиновые срезы гистологического материала толщиной 4-6 мкм. Необходимо использовать высокоадгезивные стекла, предварительно обработанные раствором полилизина или силана. Срезы высушивают в вертикальном положении 18 часов при температуре 60-80^oС. При необходимости готовые срезы хранить при 4^oС. Перед депарафинированием срезы выдерживают при температуре 60-80^oС 5-15 мин и проводят депарафинирование обработкой:
- Ксилол 10 мин *
- Ксилол 2 мин *
- 100% спирт 1 мин
- 100% спирт 1 мин
- 96% спирт 1 мин
- 70% спирт 1 мин
- 50% спирт 1 мин
- Дистиллированная вода 1 мин
*Внимание: ксилол необходимо менять после каждых 10 стекол.

Затем высушивают стекла 5-10 мин при температуре 37^oС, наносят на каждый срез по 100 мкл раствора протеиназы К в рабочем разведении и инкубируют при 37^oС 15 мин во влажной камере.

Для приготовления концентрата раствора протеиназы К растворяют 5 мг лиофилизированной протеиназы К в 2 мл промывочного раствора. Полученный раствор является концентратом 10x, его следует разделить на аликвоты 100-300 мкл и хранить замороженным при -20^oС. Срок хранения замороженного раствора 1 год, повторное замораживание не допускается. Для приготовления раствора протеиназы К в рабочем разведении необходимо разморозить концентрат 10х и развести в 10 раз промывочным раствором. При комнатной температуре рабочий раствор стабилен 1 час, хранение рабочего раствора не допускается.

Далее при комнатной температуре сливают со срезов раствор протеиназы К, промывают дистиллированной водой и дегидратируют по следующей схеме:
- Н₂О дистиллированная - 1 мин
- 50% спирт - 1 мин
- 70% спирт - 1 мин
- 96% спирт - 1 мин
Высушивают срезы при температуре 37^oС 5-10 мин. При необходимости подготовленные срезы можно хранить при 4^oС до 1 недели.

Для гибридизации и детекции наносят на срез 50 мкл раствора ДНК зонда и аккуратно без пузырей накрывают покровным стеклом. Стекла инкубируют при температуре 95±3^oС 10 мин. Затем срезы (не снимая покровных стекол) помещают во влажную камеру для инкубации при 37^oС на 90-120 мин. После инкубации осторожно удаляют со срезов покровные стекла, наносят на срезы 100 мкл промывочного раствора для гибридизации и инкубируют 2 мин. Сливают со стекол раствор, еще раз наносят на срез промывочный раствор для гибридизации и инкубируют во влажной камере при 37^oС 10 мин.

Далее пмывают срезы 3 раза промывочным раствором по 1 мин при комнатной температуре, наносят на срезы реагент-детектор по 100 мкл и инкубируют во влажной камере при 37^oС 30 мин. Для приготовления реагента-детектора в буфер-детектор добавляют раствор стрептавидина, 1:5 по объему и раствор щелочной фосфатазы, 1:10 по объему, осторожно перемешивают и выдерживают при 37^oС 30 мин. После этого готовый реагент-детектор можно наносить на срезы.

Срезы промывают 3 раза промывочным раствором по 1 мин, наносят раствор NBT-BCIP-реагента по 100 мкл на срез и инкубируют во влажной камере в темноте при 37^oС 30 мин.

Для приготовления NBT-BCIP-реагента готовят 2% раствор NBT-BCIP в реакционном буфере (приготовленный раствор беречь от прямых солнечных лучей).

Далее срезы промывают 3 раза промывочным раствором по 1 мин. и дистиллированной водой 1 мин Затем срезы дегидратируют:
96% спирт 1 мин
100% спирт 1 мин
100% спирт безводный 1 мин
ксилол 1 мин
Срезы заключают в канадский бальзам (или другую среду) под покровное стекло. Препарат готов к исследованию под световым микроскопом.

Конкретный пример 2.

СОСТАВ НАБОРА.

а) Пробы олигонуклеотидные для обнаружения ВИЧ, универсальная и тип-специфические, растворы по 1 мл, пробирки Эппендорф, 2-5 шт.

Раствор: формамида 50%
SSC 0,5х, рН 7,0;
б) Раствор промывочный для гибридизации, 1 флакон, 10 мл.

в) Реагент-детектор, 1 флакон, 10 мл. Сигма, А4955
г) Стрептавидин, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе, 2 мл, 1 флакон.

д) Щелочная фосфатаза, 1 мг/мл, раствор в буфере-детекторе, 1 мл, 1 флакон.

е) NBT-BCIP - реагент, 200 мкл, Сигма В 1911, 1 темная пробирка Эппендорф.

ж) Протеиназа К, 5 мг, лиофилизированная, 1 флакон.

з) Реакционный буфер, 1 флакон 10 мл.

и) Смесь солей для промывочного раствора - на 1 л, упаковка в полиэтилене.

к) Контрольные препараты (3 шт.)п

Изобретение относится к медицине. Изобретение характеризуется тем, что набор "МИКРОВИРУС" для обнаружения ДНК ВИЧ, интегрированной в хромосомы инфицированных клеток, включает олигонуклеотидные зонды для обнаружения ВИЧ-1 и ВИЧ-2, раствор промывочный для гибридизации, буфер-детектор, стрептавидин, щелочную фосфатазу, NBT-BCIP-реагент, протеиназу К, реакционный буфер, смесь солей для промывочного раствора. Способ позволяет не только определить наличие вирусов ВИЧ, но и дифференцировать ВИЧ-1 или ВИЧ-2. 1 з. п.ф-лы.

1. Набор для индикации ДНК ВИЧ, интегрированной в хромосомы инфицированных клеток, характеризующийся тем, что он содержит олигонуклеотидные зонды, соответствующие вирусу типа ВИЧ-1, включающий зонд aaattgggcctgaaaatccatacaatactc и олигонуклеотидные зонды со следующими параметрами: длина - 25-50 нуклеотидов, локализация - гомология с участками генома ВИЧ-1 prt-pol, Г-Ц состав - 30-70% Г-Ц пар; ВИЧ-2, включающий олигонуклеотидные зонды со следующими параметрами: длина - 25-50 нуклеотидов, локализация - гомология с участками генома ВИЧ-2 prt-pol, Г-Ц состав - 30-70% Г-Ц пар; раствор промывочный для гибридизации, 10 мл формамида 50% SSC 0,5х, рН 7,0; реагент-детектор, Сигма, А-4955, 10 мл; стрептавидин, 2 мл; щелочная фосфатаза, 1 мл; NBT-BCIP-реагент, Сигма, В1911, 200 мкл; протеиназа К лиофилизированная, 5 мг; реакционный буфер, 10 мл: трис-НСl 50 мМ, рН 9,5, NaCl, 100 мМ, MgCl₂, 1 мМ, NaN₃, 0,1%, левамизол, 0,1 мМ; смесь солей для промывочного раствора на 1 л: трис-НС1 50 мМ, рН 8,0, NaCl, 150 мМ. 2. Набор по п. 1, отличающийся тем, что он предназначен для определения вирусов ВИЧ-1 и ВИЧ-2.