ОЧИЩЕННАЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗА ИЗ THERMOCOCCUS GORGONARIUS, ЕЕ ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2004 года по МПК C12N15/54 C12N9/12 C12N1/21 C12Q1/68 

Текст описания в факсимильном виде (см. графический материал)

Изобретение относится к области энзимологии и генной инженерии и обеспечивает получение нативной или рекомбинантной формы термостабильной ДНК-полимеразы, применяемой в диагностических и других исследованиях, основанных на ПЦР-амплификации нуклеиновых кислот. Из архебактерии Thermococcus gorgonarius выделена и очищена термостабильная ДНК-полимераза, характеризующаяся способностью практически полностью сохранять активность в течение 2 ч инкубации при t=95^oС в присутствии стабилизатора и отличающаяся высокой точностью репликации. Выделена и охарактеризована последовательность ДНК, кодирующая новую ДНК-полимеразу. В результате экспрессии этой нуклеотидной последовательности в Е.coli получена рекомбинантная форма фермента. Показана возможность использования новой ДНК-полимеразы из Thermococcus gorgonarius в методах амплификации и/или секвенирования ДНК, при котором обеспечивается точность копирования, более чем вдвое превышающая этот показатель для любой из известных ДНК-полимераз. 8 с. и 3 з.п.ф-лы, 10 ил., 1 табл.

1. Очищенная термостабильная ДНК-полимераза, получаемая из Тhermococcus gorgonarius, которая катализирует матрично-направленную полимеризацию ДНК, обладает 3’-5’-экзонуклеазной (корректорной) активностью, сохраняет около 90% своей активности после инкубации в течение двух часов при температуре около 95°С в присутствии стабилизатора, имеет кажущуюся молекулярную массу около 92000-96000 дальтон и характеризуется, по крайней мере, в два раза более высокой точностью репликации, нежели ДНК-полимераза, получаемая из Pyrococcus furiosus.2. ДНК-полимераза по п.1, отличающаяся тем, что указанным стабилизатором является неионный детергент.3. ДНК-полимераза по п.1 или 2, отличающаяся тем, что стабилизатором является Thesit и/или Nonident P40.4. Выделенная последовательность ДНК, кодирующая полимеразу, охарактеризованную в любом из пп.1-3, которая имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:6 и нуклеотидной последовательности, генетически выраженной по отношению к SEQ ID NO: 6.5. Выделенная последовательность ДНК по п.4, отличающаяся тем, что имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6.6. Вектор для экспрессии термостабильной ДНК-полимеразы Thermococcus gcrgonarius, представляющий собой плазмиду рВТас2, в которую встроена последовательность ДНК по п.4.7. Рекомбинантный штамм Е. coli (LE392 pUBS520/pBtac2Tgo, депонированный под номером DSM №11328) - продуцент термсотабильной ДНК-полимеразы Thermococcus gorgonarius.8. Способ получения термостабильной ДНК-полимеразы, охарактеризованной в любом из пп.1-3, включающий стадии культивирования природного штамма-продуцента, суспендирования и разрушения клеток, выделения и очистки фермента при помощи многостадийной хроматографической обработки надосадочной жидкости, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм Thermococcus gorgonarius, а хроматографическую обработку осуществляют путем пропускания надосадочной жидкости через колонку с гепарин-сефарозой С1 6В (Pharmacia) с последующим снятием фермента с колонки и дальнейшей его очистки путем последовательного пропускания через колонку с ДЭАЭ-сефацелем (Pharmacia) и колонку с фосфоцеллюлозой (Whatman).9. Способ получения термостабильной ДНК-полимеразы, охарактеризованной в любом из пп.1-3, включающий культивирование рекомбинантного штамма по п.7, и очистку его ДНК-полимеразы.10. Способ амплификации ДНК, предусматривающий добавление термостабильной ДНК-полимеразы к подлежащей амплификации матричной ДНК в присутствии двух специфичных к последовательности олигонуклеотидов и дНТФ, отличающийся тем, что указанная ДНК-полимераза представляет собой ДНК-полимеразу, охарактеризованную в любом из пп.1-3.11. Способ секвенирования ДНК, характеризующийся тем, что термостабильную ДНК-полимеразу добавляют к подлежащей cеквенированию матричной ДНК в присутствии дезоксинуклеотидов и дидезоксинуклеотидов и, по крайней мере, одного специфичного к последовательности олигонуклеотида, причем или дНТФ, или ддНТФ, или специфичный к последовательности олигонуклеотид является меченым, отличающийся тем, что указанная ДНК-полимераза представляет собой ДНК-полимеразу, охарактеризованную в любом из пп.1-3.

Приоритет по пунктам: 03.10.96 по пп.1-11.