ИММУНОМОДУЛЯТОР Российский патент 2005 года по МПК A61K31/205 A61P37/02 

Изобретение относится к новым биологически активным веществам из класса арилгетероалканкарбоновых кислот и может быть использовано в медицине и биологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов.

Разработка и изучение синтетических химических соединений, стимулирующих или подавляющих иммунные реакции организма, является одной из актуальных проблем современной фармакологии и клинической иммунологии. Существующие в настоящее время иммунотропные препараты не обладают достаточной направленностью и избирательностью действия, а их применение может сопровождаться выраженными побочными явлениями.

Синтетический иммуномодулятор левамизол (М.Д.Машковский. Лекарственные средства. - Москва, 2001 г. - Т.2. - Стр.194-195) может выполнять функции иммуномодулятора - усиливать слабые, ослаблять сильные и не действовать на нормальные реакции иммунитета. Левамизол проявляет дозозависимое действие - при использовании высоких доз возможно не иммуностимулирующее, а иммунодепрессивное действие. Применение левамизола может вызвать различные побочные явления. Клинические испытания показали, что у больных, получающих левамизол, отмечаются разнообразные осложнения: головная боль, нарушение сна, аллергические реакции, агранулоцитоз, лейкопения и др.

Учитывая то, что современные знания о патогенезе многих иммунопатологических состояний, подчеркивают важность разноплановых нарушений межклональных взаимоотношений клеток иммунной системы, поиск новых химических соединений, проявляющих при первичном скрининге in vivo на интактных животных оппозитное влияние на интегральные показатели иммунитета (процесс антителообразования и реакция ГЗТ), является важным направлением современной экспериментальной и клинической фармакологии.

С целью расширения арсенала синтетических средств, обладающих иммуномодулирующими свойствами, предлагается использовать трис-(2-оксиэтил)аммониевую соль 2-Вr-феноксиуксусной кислоты.

Трис-(2-оксиэтил)аммониевая соль 2-Вг-феноксиуксусной кислоты и ее аналоги обладают антиоксидантными свойствами (Клиническая эффективность и безопасность цефалоспориновых антибиотиков производства 000 “АБОЛмед”. Сб. трудов НИИКИ, АГМУ и МКБ. - Новосибирск, 2002. Стр.179; www.abolmed.ru/pages/article33.htm).

Сущность изобретения заключается в том, что были исследованы иммуномодулирующие свойства трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-Вr-феноксиуксусной кислоты по способности данного соединения влиять на количество ядросодержащих клеток крови у мышей (миелоактивные свойства), на количество антителообразующих клеток (IgM AOK) in vivo (первичный гуморальный иммунный ответ), на гиперчувствительность замедленного типа у мышей (клеточный иммунный ответ), на спонтанную и митогенстимулированную пролиферацию спленоцитов у мышей in vitro (антипролиферативные свойства).

В работе использовали здоровых половозрелых животных: мышей - гибридов (CBA×C57BL/6)F1 (CBF1) обоего пола, 8-10-недельного возраста массой тела 18-20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные животные одного возраста и получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром).

Полученные данные обрабатывались по непараметрическому критерию U Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1. Определение миелоактивных свойств.

Опытной группе животных соединение вводили в дозе 1/10 LD₅₀ внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл растворителя ежедневно в течение 7 дней. Через 24 часа после последнего введения определяли количество ядросодержащих клеток в периферической крови. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель (воду). Критерием оценки миелоактивных свойств является изменение в лейкоцитарной формуле ±20%. Результаты выражали в количестве лейкоцитов в одном мл крови и в процентах к соответствующему контролю.

Таблица 1.
Влияние трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-Вr-феноксиуксусной кислоты на количество ядросодержащих клеток крови у интактных мышей CBF1.ГруппаДоза 1/10 LD₅₀ (мг/кг)Кол-во ядросодержащих клеток% к контролюКонтроль (n=14) 9,87×10⁶/мл Соединение (n=14)20012,0×10⁶/мл*+21* достоверно, Р<0,05; n -количество животных

Как видно из табл.1, соединение в дозе 200 мг/кг достоверно обладает миелостимулирующими свойствами.

Пример 2. Оценка влияния соединения на первичный гуморальный ответ.

Соединение в дозе 1/10 LD₅₀ и 1/100 LD₅₀ в объеме 0,5 мл воды вводили опытным мышам внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 7 дней. Контрольным животньм в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединения (воду). В день последнего введения соединения животных иммунизировали внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 0,5×10⁷/мышь. Количество IgM AOK в селезенке мышей оценивали на 4-е сутки после иммунизации по количеству зон локального гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом Cunningham (1968). Результаты выражали в абсолютном количестве IgM AOK в селезенке.

Как видно из данных таблицы 2, исследуемое соединение в дозе 200 мг/кг проявляет достоверный стимулирующий эффект на первичный гуморальный ответ.

Пример 3. Оценка влияния соединения на клеточный иммунный ответ.

Соединение в дозе 1/10 LD₅₀ и 1/100 LD₅₀ в объеме 0,5 мл воды вводили внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединений (воду). В день последнего введения соединений мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл, на 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапы (50% ЭБ в объеме 50 мкл) В контрлатеральную лапу вводили растворитель в том же объеме. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединений (воду). Реакцию ГЗТ оценивали по методике локальной ГЗТ (Crowle, 1975). Учет реакции производили через 24 часа после введения разрешающей дозы ЭБ, величину отека оценивали штангенциркулем. Результаты выражали в процентах.

Таблица 3.
Влияние трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-Вг-феноксиуксусной кислоты на гиперчувствительность замедленного типа у интактных мышей CBF1.ГруппыДоза 1/10 LD₅₀ (мг/кг)ГЗТ(%)Доза 1/100 LD₅₀ (мг/кг)ГЗТ(%)Контроль (n=15) 47,5 47,5Соединение (n=16)20029,4*2039,7* Р<0,05; n - количество животных

Как видно из таблицы 3, исследуемое соединение в дозе 200 мг/кг (1/10 LD₅₀) достоверно подавляет клеточный иммунитет (ГЗТ).

Пример 4. Оценка антипролиферативных свойств соединения.

Клетки селезенки мышей культивировали в круглодонных планшетах для иммунологических реакций ("Linbro") при +37°С в атмосфере 5% СО₂ и 95% воздуха. Абсолютное количество клеток, вносимых в лунку, составляло 200 000. Клетки стимулировали митогенами - конканавалином А (Con A, Sigma) или митогеном лаконоса (PWM, Sigma). Концентрации митогенов подбирались предварительным титрованием и использовались в оптимальной дозе, что составило для Con A 2 мкг/мл, а для PWM - 1 мкг/мл. Соединение в трех дозах вносили в лунки одновременно с митогенами. Пролиферативную активность клеток оценивали по включению H³-тимидина в ДНК делящихся клеток. Метку вносили за 16 час до конца культивирования по 1 мкКи в каждую лунку планшета. Для этого основной раствор H³-тимидина сначала растворяли в среде RPMI-1640 до концентрации 100 мкКи/мл, а затем по 10 мкл раствора добавляли в каждую лунку планшета. По окончании инкубации клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры ("Flow Lab") с помощью аппарата Harvester ("Titertek"). Фильтры высушивали и помещали во флаконы для сцинтилляционного счета и радиоактивность подсчитывали в толуольном сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола, 0,1 г дифенил-оксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике "Delta" (США). Результаты выражали в имп/мин включенного тимидина на 2×10⁵ клеток, представлены средние данные по триплету.

Таблица 4.
Влияние трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-Вr-феноксиуксусной кислоты на спонтанную и митогенстимулированную пролиферацию клеток селезенки интактных мышей in vitro (имп/мин).Доза соединения (мкг/мл)Спонтанная пролиферацияCon А-индуцированная пролиферация (2 мкг/мл)PWM-индуцированная пролиферация (1 мкг/мл)Контроль334615072722623372152185874*202711129495584*2002005*135964552** достоверно соответствующего контроля, Р<0,05

Как видно из табл.4, соединение в дозе 200 мг/кг (1/10 LD₅₀) достоверно подавляет спонтанную пролиферацию клеток селезенки. Соединение также во всех использованных дозах от 2 до 200 мг/кг достоверно подавляет пролиферацию клеток селезенки, стимулированную митогеном лаконоса (PWM митоген).

Оценивая результаты в целом, можно отметить, что исследуемое соединение оказывает избирательное воздействие на иммунные реакции организма: стимулирующее на миелоактивность и первичный гуморальный ответ, депрессивное на клеточный иммунный ответ и митогенстимулированную пролиферацию клеток селезенки. Это позволяет констатировать наличие у трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-Вr-феноксиуксусной кислоты иммуномодулирующих свойств, что говорит о возможности создания на ее основе новых препаратов для лечения различных иммунокомпрометированных состояний.

Предложено применение трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-Br-феноксиуксусной кислоты, ранее известной как антиоксидант, в качестве иммуномодулятора. Выявлено стимулирующее действие соединения на миелоактивность и первичный гуморальный ответ (оценивали по количеству IgM антителообразующих клеток) и депрессивное действие на клеточный иммунный ответ пролиферацию клеток селезенки. Наличие у трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-Br-феноксиуксусной кислоты иммуномодулирующих свойств позволит в будущем создавать на ее основе лекарственные средства для лечения различных иммунопатологических состояний. 4 табл.

Применение трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 2-Вr-феноксиуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора.