ИММУНОМОДУЛЯТОР Российский патент 2005 года по МПК A61K31/205 A61P37/00 

Изобретение относится к новым биологически активным веществам из класса алканкарбоновых кислот и может быть использовано в медицине и биологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов.

В последние годы со стороны фармакологии и клинической иммунологии уделяется большое внимание к разработке новых иммуномодулирующих лекарственных средств, стимулирующих или подавляющих гуморальные и клеточные иммунные реакции организма. Существующие в настоящее время препараты не обладают достаточной избирательностью действия на отдельные звенья иммунной системы, а также вызывают возникновение нежелательных побочных реакций.

Одним из самых известных клиницистам иммуномодуляторов является препарат левамизол, который в зависимости от используемой дозы может оказывать как стимулирующее, так и супрессивное действие на иммунную систему, что определяет показания к его использованию: аутоиммунные состояния (ревматоидный артрит, системная красная волчанка, болезнь Рейтера и другие, требующие подавления выраженности иммунных реакций организма), либо иммунодефицита, требующие стимуляции клеток иммунной системы (Регистр лекарственных средств России. - Выпуск 9. - стр.466-467). Однако следует отметить, что применение левамизола может вызвать различные побочные явления (головная боль, нарушение сна, аллергические реакции, агранулоцитоз, лейкопения, генерализованные судороги, поражение печени и почек и др.), что существенно ограничивает его широкое клиническое применение.

С целью расширения арсенала эффективных и малотоксичных синтетических средств, обладающих иммуномодулирующими свойствами, предлагается использовать трис-(2-гидроксиэтил) аммониевую соль 2-гидроксифеноксиуксусной кислоты.

Производные арилгетероалканкарбоновых кислот отличаются самьми разнообразными биологическими эффектами. Трис-(2-гидроксиэтил) аммониевая соль 2-гидроксифеноксиуксусной кислоты является стабилизатором клеточных мембран. (“Клиническая эффективность и безопасность цефалоспориновых антибиотиков производства ООО “АБОЛмед”, сб. трудов НИИКИ, АГМУ и МКБ. Новосибирск, 2002, стр.179).

Сущность изобретения заключается в том, что было изучено влияние трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 2-гидроксифеноксиуксусной кислоты на количество антителообразующих клеток селезенки у мышей (первичный и вторичный гуморальный ответ) и на гиперчувствительность замедленного типа (клеточный иммунный ответ).

В работе использовали здоровых половозрелых животных мышей - гибридов (CBAxC57BL/6)F1 (CBF1) обоего пола, 8-10 недельного возраста, массой тела 18-20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные животные одного возраста и получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром).

Данные обрабатывались по непараметрическому критерию U Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1. Определение количества IgM антителообразующих клеток in vivo.

Соединение в дозе 1/10 LD₅₀ и в дозе 1/100 LD₅₀ (в объеме 0,5 мл) вводили внутрибрюшинно мышам один раз в сутки ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединения (воду). В день последнего введения соединения животных иммунизировали внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 0,5×10⁷/мышь. Количество IgM AOK в селезенке мышей оценивали на 4-е сутки после иммунизации по количеству зон локального гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом Cunningham (1968).

Результаты выражали в абсолютном количестве IgM AOK в селезенке.

Таблица 1Абсолютное количество IgM AOK в селезенке интактных мышей CBF1 под влиянием курсового введения трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 2-гидроксифеноксиуксусной кислотыГруппыДоза 1/10 LD₅₀ (мг/кг)IgM AOK/ селез.Доза 1/100 LD₅₀ (мг/кг)IgM AOK/ селез.Контроль (n=10) 1839 1839Соединение (n=10)30019881*30773** достоверно, Р<0,05; n - число животных.

Как видно из таблицы 1, трис-(2-гидроксиэтил) аммониевая соль 2-гидроксифеноксиуксусной кислоты достоверно стимулирует первичный гуморальный ответ в дозе 1/10 LD₅₀ и подавляет в дозе 1/100 LD₅₀

Пример 2. Определение количества Ig G антителообразующих клеток in vivo.

Соединение в дозе 1/10 LD₅₀ и 1/100 LD₅₀ в объеме 0,5 мл вводили внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединений (воду). В день последнего введения соединений проводили первичную иммунизацию 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл внутрибрюшинно. Через 30 дней после первичной иммунизации проводили вторичную иммунизацию ЭБ в дозе 0,5×10⁷/мышь внутривенно. Количество IgG АОК определяли в селезенке на пике иммунного ответа (на 5-е сутки после вторичной иммунизации) методом локального гемолиза (Cunningham,1968: Dresser, Wortis,1965). Клетки селезенки инкубировали 2 часа при 39°С в камерах с ЭБ, комплементом морской свинки и кроличьей антисыворотки против мышиного IgG (разведение в 2000 раз). Зоны гемолиза подсчитывали под увеличением х42. Результаты выражали в абсолютном количестве IgG АОК в селезенке.

Таблица 2Абсолютное количество IgG АОК в селезенке интактных мышей CBF1 под влиянием курсового введения трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 2-гидроксифеноксиуксусной кислоты в дозе 1/10 и 1/100LD₅₀.ГруппыДоза 1/10 LD₅₀ (мг/кг)IgG АОК/селез.Доза 1/100 LD₅₀ (мг/кг)IgG АОК/селез.Контроль (n=12) 71928 71928Соединение (n=12)300840273047188** достоверно, Р<0,05; n - число животных.

Как видно из таблицы 2, соединение в дозе 1/100LD₅₀, достоверно ингибирует процесс образования IgG АОК, в то время как в дозе 1/10 LD₅₀ - не влияет на число Ig АОК (отмечается тенденция к стимуляции).

Пример 3. Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo.

Опытной группе животных соединение вводили в дозе 1/10 LD₅₀ внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 дней в объеме 0,5 мл. В день последнего введения соединения мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл; на 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапы (50% ЭБ в объеме 50 мкл). В контрлатеральную лапу вводили растворитель в том же объеме. Контрольным животньм в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединения (воду). Реакцию ГЗТ оценивали по методике локальной ГЗТ (Crowie, 1975). Учет реакции производили через 24 часа после введения разрешающей дозы ЭБ, величину отека оценивали штангенциркулем. Результаты выражали в процентах или абсолютных значениях.

Таблица 3Влияние трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 2-гидроксифеноксиуксусной кислоты на гиперчувствительность замедленного типа.ГруппыГЗТ (%)1. Контроль (n=10)47,72. Соединение 30 мг/кг (n=10)42,53. Соединение в дозе 300 мг/кг (n=10)30,4** достоверно, Р<0,05; n - число животных.

Как видно из таблицы 3, соединение достоверно ингибирует клеточный иммунный ответ (ГЗТ) только в дозе 1/10 LD₅₀.

Оценивая полученные результаты в целом, можно отметить, что исследуемое соединение достоверно ингибирует в дозе 1/100LD₅₀ IgM и IgG ответ, не влияя при этом на ГЗТ, а в дозе 1/10 LD₅₀ достоверно стимулирует IgM ответ, но подавляет ГЗТ, т.е. обладает достаточной избирательностью действия на гуморальный и клеточный иммунный ответ в зависимости от применяемой дозы. Наличие этих свойств у трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 2-гидроксифеноксиуксусной кислоты позволит в будущем создавать на ее основе лекарственные средства для лечения различных иммунокомпрометированных состояний.

Предложено: применение трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 2-гидроксифеноксиуксусной кислоты, ранее известной как антиоксидант, в качестве иммуномодулятора. Наличие у трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой соли 2-гидроксифеноксиуксусной кислоты иммуномодулирующих свойств позволит в будущем создавать на ее основе лекарственные средства для лечения инфекционно-воспалительных, аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний благодаря избирательному действию средства на клеточный и гуморальный иммунитет. 3 табл.

Применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 2-гидроксифеноксиуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора.