ИММУНОМОДУЛЯТОР Российский патент 2004 года по МПК A61K31/205 A61P37/02 

Изобретение относится к новым биологически активным веществам из класса алканкарбоновых кислот и может быть использовано в медицине и биологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов
Известен ряд препаратов, модулирующих иммунные реакции. К иммуномодуляторам относятся вещества, специфически воздействующие на клеточную и гуморальную систему иммунитета, избирательно подавляя или стимулируя иммунный ответ.

Гетероциклический иммуномодулятор левамизол (М.Д.Машковский, лекарственные средства, М., Медицина,1986, т.2, стр.169-170) может выполнять функции иммуномодулятора, способного усилить слабую реакцию клеточного иммунитета, ослабить сильную и не действовать на нормальную. Левамизол проявляет дозозависимое воздействие на иммунитет и применять его, например, в качестве иммуностимулятора нужно с осторожностью, так как при превышении доз возможно не иммуностимулирующее, а иммунодепрессивное действие, причем в некоторых случаях от малых доз левамизола. Применение левамизола может вызвать различные побочные явления. Клинические испытания показали, что у 30-40% больных, получающих левамизол, зарегистрированы разнообразные осложнения: головная боль, нарушение сна, аллергические реакции, агранулоцитоз, лейкопения. Современные знания о патогенезе многих заболеваний, связанных с нарушением межклональных взаимоотношений за счет расстройства Тh1/Th2 регуляторных влияний и баланса соответствующих цитокинов выдвигают требования к поиску новых иммуноактивных препаратов. В связи этим представляют интерес препараты, проявляющие при первичном скрининге in vivo на интактных животных, разнонаправленное влияние на интегральные показатели-антителообразование и ГЗТ, оказывающие влияние либо только на гуморальный, либо только на клеточный иммунитет и не оказывающие токсического воздействия на организм.

С целью расширения арсенала синтетических средств, обладающих иммуномодулирующими свойствами, предлагается использовать трис-(2-гидроксиэтил)аммониевую соль 2-метилфенилтиоуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора.

Трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 2-метилфенилтиоуксусной кислоты обладает антиоксидантными свойствами ("Клиническая эффективность и безопасность цефалоспориновых антибиотиков производства OOO "АБОЛмед" сб. трудов НИИКИ, АГМУ и МКБ, Новосибирск, 2002, стр.179).

Сущность изобретения заключается в том, что были исследованы иммуномодулирующие свойства трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 2-метилфенилтиоуксусной кислоты по способности данного соединения влиять на количество ядросодержащих клеток крови у мышей (миелоактивные свойства), на реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)-клеточный иммунитет, на спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию спленоцитов у мышей in vitro (антипролиферативные свойства), а также на пролиферацию клеток опухолевой линии (цитостатические свойства).

В работе использовали здоровых половозрелых животных мышей - гибридов (CBA•C57BL/6)F1 (CBF1) обоего пола, 8-10 недельного возраста, массой тела 18-20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные животные одного возраста и получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром).

Данные обрабатывались по непараметрическому критерию U Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1. Определение миелоактивных свойств.

Опытной группе животных соединение вводили в дозе 1/10 LD₅₀ внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл ежедневно в течение 7 дней, через 24 часа после последнего введения определяли количество ядросодержащих клеток в периферической крови. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель (воду). Критерием оценки миелоактивных свойств является изменение в лейкоцитарной формуле ±20%. Результаты выражали в количестве лейкоцитов в одном мл крови и в процентах к соответствующему контролю.

Как видно и данных табл.1 соединение достоверно обладает миелостимулирующими свойствами, т.е. существенно более, чем на 20% вызывает увеличение количества лейкоцитов (на 55%).

Пример 2. Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo.

Опытной группе животных соединение вводили в дозе 1/10 LD₅₀) внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 дней в объеме 0,5 мл. В день последнего введения соединения мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл; на 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапы (50% ЭБ в объеме 50 мкл). В контрлатеральную лапу вводили растворитель в том же объеме. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединения (воду). Реакцию ГЗТ оценивали по методике локальной ГЗТ (Crowle, 1975). Учет реакции производили через 24 часа после введения разрешающей дозы ЭБ, величину отека оценивали штангенциркулем. Результаты выражали в процентах или абсолютных значениях.

Как видно из данных табл.2, трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 2-метилфенилтиоуксусной кислоты достоверно подавляет ГЗТ.

Пример 3. Спонтанная, Con А- и PWM-индуцированная пролиферация клеток селезенки.

Клетки селезенки мышей культивировали в круглодонных планшетах для иммунологических реакций ("Linbro") при +37^oС в атмосфере 5% СО₂ и 95% воздуха. Абсолютное количество клеток, вносимых в лунку, составляло 200000. Клетки стимулировали митогенами - конканавалиномА (Con A, Sigma) или митогеном лаконоса (PWM, Sigma). Концентрации митогенов подбирались предварительным титрованием и использовались в оптимальной дозе, что составило для Con A 2 мкг/мл, а для PWM-1 мкг/мл. Соединение в трех дозах вносили в лунки одновременно с митогенами. Пролиферативную активность клеток оценивали по включению Н³-тимидина в ДНК делящихся клеток. Метку вносили за 16 час до конца культивирования по 1 мкКи в каждую лунку планшета. Для этого основной раствор Н³-тимидина сначала растворяли в среде RPMI-1640 до концентрации 100 мкКи/мл, а затем по 10 мкл раствора добавляли в каждую лунку планшета. По окончании инкубации клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры ("Flow Lab") с помощью аппарата Harvester ("Titertek"). Фильтры высушивали и помещали во флаконы для сцинтилляционного счета и радиоактивность подсчитывали в толуольном сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола, 0,1 г дифенилоксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике "Delta" (США). Результаты выражали в имп/мин включенного тимидина на 2•10⁵ клеток, представлены средние данные по триплету.

Как видно из данных, табл.3, соединение проявляет выраженные дозозависимые ингибирующие свойства на митоген-стимулированную пролиферацию интактных клеток селезенки мышей.

Пример 4. Оценка противоопухолевой активности.

Проводилась скрининговым методом in vitro на клетках мастоцитомы Р 815. Клетки засевали в концентрации 10•10³/лунку, инкубировали с соединениями в течение 24 часов, за 6 часов до конца инкубации вносили 1 мкКи Н³-тимидина. По окончании инкубации клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры ("Flow Lab") с помощью аппарата Harvester ("Titertek). Результаты выражали в имп./мин. Включенного тимидина на 10•10³ клеток, представлены средние данные по триплету.

Как видно из данных табл.4 трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 2-метилфенилтиоуксусной кислоты проявляет достоверный антипролиферативный эффект.

Оценивая в целом результаты можно отметить, что по свойствам стимулировать лейкопоэз трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 2-метилфенилтиоуксусной кислоты может быть отнесена к иммуностимуляторам. А по свойствам подавлять клеточный иммунный ответ, спонтанную и стимулированную пролиферацию клеток in vitro, пролиферацию клеток опухолевой линии in vitro - к иммунодепрессантам.

Приведенные примеры иллюстрируют наличие у трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 2-метилфенилтиоуксусной кислоты иммуномодулирующих свойств, что позволит в будущем создавать на ее основе лекарственные средства для лечения различных иммунокомпрометированных состояний.

Предложено: применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 2-метилфенилтиоуксусной кислоты, ранее известной как антигемолитическое и антиагрегационное средство, в качестве иммуномодулятора. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения. 4 табл.

Применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 2-метилфенилтиоуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора.