СПОСОБ БИОСИНТЕЗА ЛИПАЗЫ Российский патент 2010 года по МПК C12N9/20 C12R1/845 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве ферментов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ культивирования продуцента липазы гриба Rh. oryzae на питательной среде, содержащей глюкозу (10 г/л), в качестве источника азота и солей - обезжиренный рыбный белковый гидролизат (24 г/л). Активность полученной липазы составляет 394 ед. на 1 см³ культуральной жидкости (Ghorbel Sofiane. Preparation and testing of Sardinella protein hydrolysates as nitrogen source for extracellular lipase production by Rhizopus oryzae [Text] / Ghorbel Sofiane, Souissi Nabil, Triki-Ellouz Yosra, Dufosse Laurent, Guerard Fabienne, Nasri Moncef// World J. Microbiol. and Biotechnol. - 2005. - V. 21, №1. - P.33-38).

Недостатком известного способа является низкая активность липазы.

Техническая задача изобретения - биосинтез липазы с высокой активностью.

Техническая задача достигается тем, что в способе биосинтеза липазы, включающем подготовку питательной среды, инокуляцию ее водно-споровой суспензией продуцента липазы, его глубинное культивирование, фильтрацию культуральной жидкости, новым является то, что в качестве продуцента липазы используют Rhizopus oryzae 1403, а при подготовке питательной среды в нее вносят, мас.%: рыбную муку - 3,0-3,5, подсолнечное масло - 0,2-0,3; кукурузный экстракт - 0,8-0,9 и гидрофосфат аммония - 0,4-0,5, вода - остальное; культивирование осуществляют при аэрации и температуре 30-32°С в течение 48 ч, после чего в культуральную среду вносят тритон Х-305 в количестве 0,008-0,010 мас.% и продолжают культивирование еще 24 ч.

Технический результат изобретения выражается в повышении активности липазы.

Способ реализуется следующим образом.

В способе используется продуцент липазы Rhizopus oryzae BKM F-1403 (Каталог культур микроорганизмов, Пущино - Москва, 1992, с.154).

Чистую культуру продуцета липазы Rhizopus oryzae 1403 выращивают на агаризированном сусле с содержанием сухих веществ 4% в течение 3-4 сут при температуре (30±1)°С.

Готовят питательную среду для продуцента липазы. Для этого в воде растворяют гидрофосфат аммония в количестве 0,4-0,5 мас.%, добавляют (мас.%): кукурузный экстракт - 0,8-0,9; рыбную муку - 3,0-3,5; подсолнечное масло - 0,2-0,3. Среду стерилизуют 1 ч при 0,1 МПа, а потом охлаждают.

Подготовленную питательную среду, содержащую рыбную муку, подсолнечное масло, кукурузный экстракт, гидрофосфат аммония и воду, инокулируют спорами продуцента липазы Rhizopus oryzae 1403 и культивируют при температуре 30-32°С и аэрации в течение 48 ч. Затем в культуральную среду добавляют тритон Х-305 в количестве 0,008-0,010 мас.% и продолжают культивирование еще 24 ч.

После окончания культивирования культуральную жидкость отделяют от биомассы фильтрованием.

В предлагаемом изобретении активность липазы оценивают титриметрическим методом (Таrо Ogiso. Studies on Bile-sensitive Lipase. Purification and Properties of Lipase from Mucor javanicus / Taro Ogiso, Mamori Sugiura // Chem. Pharm.Bull. - 1969. - V. 17, №5. - P.1025-1033).

В качестве субстрата используют 0,1 М эмульсию оливкового масла в 2% растворе поливинилового спирта. Реакционная смесь содержит 2,5 см³ эмульсии, 2 см³ 0,05 М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5 и 0,5 см³ культуральной жидкости. Время инкубации составляет 30 мин. После этого для прекращения реакции добавляют 15 см³ смеси этанол-ацетон (1:1 об./об.) и 10 см³ 0,05 М гидроксида натрия. Титрование образовавшихся свободных жирных кислот (СЖК) проводят 0,05 М соляной кислоты. Контрольный опыт осуществляют так же, но титрование проводят сразу после добавления культуральной жидкости в реакционную смесь.

За единицу ферментативной активности липазы принимают такое количество фермента, которое освобождает 1 µмоль жирной кислоты за 1 мин.

Состав питательной среды для культивирования продуцента и внесение тритона Х-305 после 48 ч культивирования обеспечивают биосинтез липазы продуцентом Rhizopus oryzae 1403 с высокой активностью.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава (мас.%):

Рыбная мука - 3,0

Масло подсолнечное - 0,2

Кукурузный экстракт - 0,8

Гидрофосфат аммония - 0,4

Вода - остальное.

Для инокуляции среды готовят водно-споровую суспензию продуцента липазы Rhizopus oryzae 1403. Для этого скос 4-суточной культуры в пробирках 18×180 мм заливают 10 см³ стерильной воды и смывают споры. В колбы Эрленмейера емкостью 750 см³ вносят по 100 см³ питательной среды, которую инокулируют водно-споровой суспензией в количестве 1% к объему среды. Культивирование продуцента проводят на качалке при скорости 1,7-1,8 с^-1 (то есть при аэрации), температуре 30-32°С в течение 48 ч. Затем в культуральную среду добавляют тритон Х-305 в количестве 0,008 мас.% и продолжают культивирование еще 24 ч. По окончании культивирования мицелий и взвешенные частицы отделяют от культуральной жидкости фильтрованием.

Активность липазы в культуральной жидкости составляет 806 ед./см³.

Пример 2. Готовят питательную среду следующего состава (мас.%):

Рыбная мука - 3,5

Масло подсолнечное - 0,3

Кукурузный экстракт - 0,9

Гидрофосфат аммония - 0,5

Вода - остальное.

Для культивирования продуцента липазы Rhizopus oryzae 1403 готовят споровую суспензию, инокулируют питательную среду и проводят процесс культивирования 48 ч аналогично примеру 1. Затем в культуральную среду добавляют тритон Х-305 в количестве 0,010 мас.% и продолжают культивирование еще 24 ч. Затем мицелий и взвешенные частицы отделяют от культуральной жидкости фильтрованием.

Активность липазы в культуральной жидкости составляет 867 ед./см³.

Как видно из примеров, при культивировании продуцента липазы Rhizopus oryzae 1403 при аэрации и температуре 30-32°С на питательной среде состава (мас.%): рыбная мука - 3,0-3,5; масло подсолнечное - 0,2-0,3; кукурузный экстракт - 0,8-0,9; гидрофосфат аммония - 0,4-0,5, остальное вода, внесение после 48 ч культивирования тритона Х-305 в количестве 0,008-0,010% и дальнейшее культивирование еще 24 часа дают повышение активности липазы в культуральной жидкости в 2,0-2,2 раза по сравнению с известным способом.

Уменьшение или увеличение количества компонентов среды приводит к снижению активности липазы на 10-13%. Без внесения тритона Х-305 активность составляет 251 ед./см³.

Если тритон Х-305 вносится в начале культивирования, то активность липазы составляет 467 ед./см³, если он вносится после 24 ч - 655 ед./см³.

Предложенный способ культивирования продуцента липазы позволяет повысить активность липазы по сравнению с известным способом.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к культивированию продуцента липазы. Способ предусматривает подготовку питательной среды, содержащей рыбную муку, подсолнечное масло, кукурузный экстракт, гидрофосфат аммония и воду в заданном соотношении. Подготовленную питательную среду инокулируют водно-споровой суспензией продуцента липазы, в качестве которого используют Rhizopus oryzae BKM F-1403 и культивируют при аэрации и температуре 30-32°С в течение 48 ч. После чего в культуральную среду вносят тритон Х-305 в заданном количестве и снова культивируют еще 24 ч. По окончании культивирования мицелий и взвешанные частицы отделяют фильтрованием. Изобретение позволяет повысить активность липазы.

Способ биосинтеза липазы, включающий подготовку питательной среды, инокуляцию ее водно-споровой суспензией продуцента липазы, его глубинное культивирование, фильтрацию культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве продуцента липазы используют Rhizopus oryzae 1403, а при подготовке питательной среды в нее вносят, мас.%: рыбную муку 3,0-3,5; подсолнечное масло 0,2-0,3; кукурузный экстракт 0,8-0,9; гидрофосфат аммония 0,4-0,5; вода остальное, культивирование осуществляют при аэрации и температуре 30-32°С в течение 48 ч, после чего в культуральную среду вносят тритон Х-305 в количестве 0,008-0,010 мас.% и продолжают культивирование еще 24 ч.