СПОСОБ ОЦЕНКИ НЕПРЯМОГО АНТИГЕНОСПЕЦИФИЧЕСКОГО РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ АСТРАХАНСКОЙ ЛИХОРАДКЕ И ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ В Российский патент 2004 года по МПК G01N33/536 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии инфекционных болезней, и может быть использовано для определения доли специфичности в естественной резистентности организма, построения прогноза болезни и коррекции при ее нарушениях.

Из практики медицины в настоящее время известны способы определения спонтанных розеткообразующих нейтрофилов (см., например, авт. св. №1758556, Бюл. №32, 1992, с.162 "Способ определения розеткообразующей реакции нейтрофилов", авторов И.В. Нестеровой, Г.А. Чудиловой, Г.Г. Рожковой).

Кроме этого имеются способы определения антигеноспецифических лимфоцитов с использованием лейкоцитарной массы, позволяющие определить активность туберкулезного процесса, а также служащие для лабораторной диагностики инфекций (см., например, журнал "Лабораторное дело", 1978, №10, с.591-601 "Иммунные розеткообразующие лимфоциты в оценке активности туберкулезного процесса", авторов М.М. Авербаха, Г.А. Вахидова, В.И. Литвинова и др.; журнал "ЖМЭИ", 1987, №7, с.41-44 "Использование теста специфического розеткообразования при клещевом энцефалите с целью лабораторной диагностики", авторов В.М. Минаевой, Л.П. Быковой, Т.Г. Пархоменко и др.; журнал "Лабораторное дело", 1983, №11, с.22-24 "Непрямое антигеноспецифическое розеткообразование при вирусном гепатите В", автора В.М. Титова; журнал "ЖМЭИ", 1993, №4, с.25-30 "Диагностика стафилококковой инфекции по определению антигеносвязывающих лимфоцитов", авторов П.Н. Дерябина, Б.В. Каральника, Л.А. Прасоловой и др.). А также имеется способ ранней иммунодиагностики инфекций путем определения в мазках адгезивной способности лимфоцитов и нейтрофилов с оценкой диагностического результата по проценту лейкоцитов, образующих розетки с эритроцитами из специфического и неспецифического эритроцитарного диагностикумов (см., например, авт. св. №2136000, Бюл. №24, ч. 3, 1999, с.523 "Способ иммунодиагностики инфекций" авторов В.Н. Каплина, С.В. Фольмера, А.Х. Мамунца, Л.Г. Казанцевой).

Выше названные способы близки к предлагаемому изобретению. Недостатком большинства из них является невозможность определения антигеноспецифических нейтрофилов.

Так, способ "Непрямого антигеноспецифического розеткообразования при вирусном гепатите В" автора В.М. Титова, позволяющий определять частоту специфической сенсибилизации к HBSag в 92% случаев и строить прогноз исходов ВГВ, имеет недостатки:

- используется вся лейкоцитарная масса для определения только лимфоцитов;

- оценка результатов исследования ведется только по частоте обнаружения специфической сенсибилизации по двукратному увеличению специфического розеткообразования над спонтанным, без расчета относительного и абсолютного ее содержания.

"Способ иммунодиагностики инфекций" авторов В.Н. Каплина и др., позволяет рано диагносцировать инфекцию путем адгезивной способности лимфоцитов и нейтрофилов с оценкой диагностического результата по проценту лейкоцитов и вычисления индекса специфической адгезии, имеет недостаток: не определяется доля специфичности естественной резистентности в динамике болезни.

Целью предлагаемого изобретения является определение уровня естественной резистентности путем выявления и расчета относительного и абсолютного содержания антигеноспецифических нейтрофилов в динамике болезни.

Поставленная цель в изобретении достигается тем, что из всей массы крови выделяют нейтрофилы с последующей их агглютинацией с эритроцитами, сенсибилизированными специфическими антигенами, и определяют их относительное и абсолютное содержание.

Известно, что нейтрофилы играют важную роль в естественной резистентности организма при многих заболеваниях и особенно при инфекционных. Функция нейтрофилов многогранна, не ограничивается только фагоцитозом. Так, они способны к образованию и выделению лизосомальных энзимов в окружающую среду, благодаря чему проявляется их бактерицидная активность. Вообще к антимикробной системе нейтрофилов можно отнести дегидрогеназы лизосом, лизоцим, лакроферрин, катионные белки и др. Гидролитические энзимы лизосом оказывают не только бактериостатическое действие, но также могут участвовать в разрушении поврежденных при воспалении клеток и тканей организма. Одновременно с гидролитическими энзимами освобождаются лизоцим, молочная кислота и разнообразные белки, обладающие бактериостатическими и бактерицидными свойствами. Кроме того, в нейтрофилах идентифицирован ряд факторов, относящихся к процессам гемостаза. Таким образом, нейтрофилы имеют немаловажное значение в патогенезе заболеваний. Поэтому выяснение закономерностей естественной резистентности организма, а именно ее нейтрофильного звена, очень важно, и особенно актуальным является определение доли антигеноспецифичных нейтрофилов в их общем количестве.

Выделение и сенсибилизацию клеток крови проводили следующим образом:

а) выделение лейкоцитов и нейтрофилов - по общеизвестным методам:

- лейкоцитарную массу - из гепаринизированной крови, отстаивая венозную кровь 40 мин, затем ее осторожно отсасывали пипеткой и отмывали 2-3 раза в 5-кратном объеме среды 199. Центрифугировали при 800-1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в среде 199 до конечной концентрации 4×10⁶ в 1 мл среды.

Прежде чем выделить нейтрофилы, получали лимфоциты (Jondal M. et al 1972).

- нейтрофилы - к оставшемуся осадку после сбора лимфоцитов добавляли 1 мл ранее убранной плазмы и 0,4 мл 4,5% декстрана-500, перемешивали, с поверхности удаляли пену и пузырьки. Затем пробирки помещали на 40 мин в холодильник при +4°С. После чего надосадок собирали в селиконированные пробирки, трижды отмывали средой 199 до конечной концентрации 3×10⁶ в 1 мл (Лопаткин Н.А., Дзержинская И.И., 1984);

б) в реакции сенсибилизации использовали эритроциты доноров 0(1) группы крови, Rh-. Эритроциты отмывали трехкратно средой 199 в течение 10 мин при 1000 об/мин, доводили до первоначального объема. Из этого объема в две пробирки брали по 0,2 мл эритроцитарной взвеси и добавляли - в одну 0,2 мл видоспецифического корпускулярного антигена из астраханского штамма риккетсий, в другую - 0,2 мл очищенного HBSag (положительный контрольный образец для РИА), затем в каждую пробирку вносили по 0,2 мл 1% хлорида хрома (Титов В.М., 1983). Тщательно, осторожно встряхивали в течение 10 мин, затем дважды отмывали в 10-кратном объеме среды 199 путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин. Из осадка готовили 0,5% взвесь сенсибилизированных разными антигенами эритроцитов. Затем в 2 пробирки брали по 0,5 мл лейкоцитарной массы в среде 199, добавляли по 0,5 мл 0,5% взвеси эритроцитов, сенсибилизированных соответствующими антигенами. Инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин. После чего клетки осаждали центрифугированием при 800 об/мин в течение 5 мин. Из осадка готовили мазки, предварительно фиксируя 0,6% раствором глютарового альдегида (0,05 мл на 0,1 мл осадка). Мазки окрашивали методом сафранин-бриллиантовым зеленым (Фильчанов Ф.В. с соавт., 1985) и просматривали на обычном световом микроскопе (увеличение 100х12) под иммерсией. Аналогочным образом обрабатывали по 0,5 нейтрофильной взвеси.

в) затем определяли процент розеткообразующих клеток (лимфоцитов и нейтрофилов) на 500 свободных иммуноцитов. За розетку принимали иммуноцит, фиксирующий не менее трех эритроцитов.

Для исключения спонтанной неспецифической агглютинации эритроцитов параллельно с опытными определяли процент розеток в препаратах с ненагруженными (несенсибилизированными) эритроцитами. Специфическое и спонтанное розеткообразование определяли в дубле, рассчитывали среднюю величину. Окончательным результатом считали разницу между специфическими и спонтанными розетками.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в клинико-иммунологической лаборатории клинического отдела Научно-исследовательского института краевой инфекционной патологии Астраханской государственной медицинской академии (НИИКИП АГМА) в течение 1999-2001 гг.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1

Используя способ непрямого антигеноспецифического розеткообразования обследовали 16 больных острым вирусным гепатитом В (клинич., эпидемиологич., серологич. в ИФА HBSag +), из крови которых выделяли лейкоциты и нейтрофилы и определяли специфическую агглютинацию с эритроцитами, сенсибилизированными очищенным HBSag (положительный контрольный образец для РИА). Результаты исследования представлены в таблицах 1 и 2.

Из таблицы 1 следует, что обнаружение антигеноспецифических розеткообразующих клеток высокая на второй неделе болезни (6-8 дни желтухи - сроки поступления в стационар) - у лимфоцитов в 87,5% (прототип), у нейтрофилов - в 100% случаев. В последующие сроки частота выявления антигеноспецифических лимфоцитов увеличивалась до 100%, у нейтрофилов оставалась в пределах 100%. Среднесуммарная частота обнаружения антигеноспецифических розеткообразующих нейтрофилов составляла 100%, а лимфоцитов (прототип) - 93,8±6,06%.

Из таблицы 2 следует, что относительное содержание антигеноспецифических нейтрофилов было наибольшим на третьей неделе болезни ОВГВ, а наименьшее в течение первых двух недель заболевания. Среднесуммарное относительное содержание антигеноспецифических розеткообразующих нейтрофилов составляло 14,26±2,83%.

В прототипе (лейкоциты) относительное содержание антигеноспецифических лимфоцитов на протяжении всей болезни было примерно одинаковым. Их среднесуммарное содержание составляло 7,91±2,51%.

Зная лейкоцитарную формулу каждого больного и относительное содержание антигеноспецифических нейтрофилов, можно рассчитать их абсолютное количество.

Например: у больного Н-ва О-В., 28 лет, и/б №194/4217, диагноз - острый вирусный гепатит В, средней тяжести (клинич., эпидемиологич., серологич. в РПГА HBSag 1:20480) на 9 день болезни количество лейкоцитов 5,65×10⁹/л, лейкоцитарная формула - нейтрофилов: n - 4%, с - 54%, л - 42%. Абсолютное количество нейтрофилов 3,28×10⁹/л (т.е. 4+54=58% от 5,65×10⁹/л). Относительное содержание антигеноспецифических розеткообразующих нейтрофилов 14,2%, а абсолютное - 0,466×10⁹/л (т.е. 14,2% от 3,28 10⁹/л).

Пример 2

Используя способ непрямого антигеноспецифического розеткообразования, было обследовано 36 больных астраханской лихорадкой (АЛ), средней тяжести (клинич., серологич. в РНИФ 1:40-1:160), из крови которых выделяли лейкоциты и нейтрофилы и определяли специфическую агглютинацию с эритроцитами, сенсибилизированными видоспецифическим корпускулярным антигеном из астраханского штамма риккетсий, приготовленного в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Результаты исследования представлены в таблицах 3 и 4.

Из таблицы 3 следует, что уже на первой неделе (5-6 дни) заболевания АЛ происходит обнаружение антигеноспецифических розеткообразующих нейтрофилов, при этом на протяжении трех недель болезни частота их выявления примерно одинакова - 70-75%, а на четвертой - 100%. Среднесуммарная частота выявления антигеноспецифических розеткообразующих нейтрофилов составляла 75,0±7,21%. В прототипе (лейкоциты) обнаружение антигеноспецифических розеткообразующих лимфоцитов на первой и четвертой неделях было примерно одинаковым, с некоторым снижением на второй и третьей неделях (53,8-75%). Среднесуммарная частота их выявления составляла 69,4±7,68%.

Из таблицы 4 следует, что относительное содержание антигеноспецифических нейтрофилов было достоверно наибольшим на первой неделе заболевания АЛ по сравнению с последующими сроками в 2,2-3,5 раза (р<0,05). Среднесуммарное относительное их содержание составляло 8,94±1,56%. В прототипе (лейкоциты) относительное содержание антигеноспецифических лимфоцитов на протяжении всего заболевания было примерно одинаковым, а среднесуммарное значение составляло 5,09±1,49%.

Расчет абсолютного содержания антигеноспецифических нейтрофилов производится, как в примере 1.

Таким образом, отличие предлагаемого изобретения по сравнению с прототипом состоит в возможности определять уровень естественной резистентности.

Предложенный способ может быть рекомендован НИИ и лечебным учреждениям для оценки уровня естественной резистентности, построения прогноза болезни и коррекции лечения при ее нарушениях.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии инфекционных болезней. Для оценки непрямого антигеноспецифического розеткообразования нейтрофилов при астраханской риккетсиозной лихорадке и вирусном гепатите В у больных одновременно определяют относительное количество розеткообразующих нейтрофилов в препаратах с нагруженными (сенсибилизированными) антигенами и ненагруженными эритроцитами в дубле, рассчитывают среднюю величину, окончательным результатом считают разницу между специфическими и спонтанными розетками и затем вычисляют абсолютное количество антигеноспецифических нейтрофилов. Способ позволяет оценить уровень естественной резистентности организма, построить прогноз болезни и корректировать лечение. 4 табл.

Способ оценки непрямого антигеноспецифического розеткообразования нейтрофилов при астраханской риккетсиозной лихорадке и вирусном гепатите В, заключающийся в том, что у больных одновременно определяют относительное количество розеткообразующих нейтрофилов в препаратах с нагруженными (сенсибилизированными) антигенами и ненагруженными эритроцитами в дубле, рассчитывают среднюю величину, окончательным результатом считают разницу между специфическими и спонтанными розетками, и затем вычисляют абсолютное количество антигеноспецифических нейтрофилов.