СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 A61K39/04 A61K47/30 C12N1/02 

Данное изобретение относится к области медицины, разделу «бактериология», а именно к лабораторным методам диагностики туберкулеза.

Для повышения информативности бактериологических методов исследования для обнаружения микобактерий туберкулеза (МБТ) разрабатываются методы, повышающие чувствительность данных методов. Для повышения частоты выявления МБТ при люминесцентной микроскопии применяют ферромагнитные и иммуномагнитные сорбенты (Владимирский М.А., 1994). Для повышения результативности метода посева используют посев мокроты методом флотации (Pottenger, 1931), электрофоретическую концентрацию микобактерий в диагностическом материале (Оттен Т.Ф., Вишневский Б.И., 1986), используют посев осадока диагностического материала (Ященко Т.Н., Мечева И.С., 1973).

Таким образом, поиски способов, повышающих чувствительность методов посева для выявления МБТ в диагностическом материале в условиях практических лабораторий, сохраняют свою актуальность и имеют предпосылки для их дальнейших разработок.

Известен способ выращивания МБТ путем посева осадка диагностического материала, обработанного хлоргексидин биглюконата (В.Ф.Балан «Универсальный консервант и детергент в бактериологической диагностике туберкулеза» // Социально-эпидемиологические проблемы туберкулеза в территориях Крайнего Севера - Якутск. - 1992. - С.93). Диагностический материал заливают равным количеством (1:1) 0,1% раствором хлоргексидин биглюконата (ХБГ). Материал центрифугируют при 1500-2000 об\мин в течение 10 мин, сливают надосадочную жидкость, оставляя 2,0 мл для последующего посева на питательные среды.

Однако при таком способе выращивания микобактерий туберкулеза высеваемость МБТ при посеве осадка диагностического материала на яичные питательные среды из мокроты составляет по данным микробиологической лаборатории ЯНИИТ - 17,0%. Кроме того, в 3,0-4,0% случаев из-за скудного роста культур МБТ не происходит накопления достаточной бактериальной массы для дальнейшей работы с выделенной культурой, возникает необходимость получения субкультур и, таким образом, удлиняются сроки выдачи результатов идентификации и определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам.

Для увеличения выхода биомассы культур МБТ при посеве диагностического материала на яичные питательные среды нами предложен водный раствор энтеросорбента - гидрогели метилкремниевой кислоты (торговое название препарата - энтеросгель) - для предварительной обработки биоматериала, способствующего концентрации микобактерий туберкулеза в образцах диагностического материала для последующего посева на плотные питательные среды. При этом материал (мокрота) подвергается первичной обработке с целью подавления сопутствующей микрофлоры, что предупреждает загрязнение посевов. Диагностический материал заливается равным объемом (1:1) 0,05% раствора ХГБ. Тщательно гомогенизируется. Оставляют на 10-12 часов при комнатной температуре. На следующий день материал помещают в центрифужные пробирки по 8 мл, добавляя по 2,0 мл свежеприготовленного водного раствора гидрогели метилкремниевой кислоты (энтеросгеля), встряхивают на шейкере, затем центрифугируют 15 мин, 3 тыс. оборотов\мин. Надосадочную жидкость сливают, оставляя в пробирке осадок, к осадку добавляют по 1 мл жидкой среды Школьниковой и засевают на плотные яичные среды Финн-2 и Левенштейна-Иенсена.

Приготовление водного раствора гидрогели метилкремниевой кислоты (энтеросгеля): 15 г гидрогели метилкремниевой кислоты (энтеросгеля) растирают в стерильной ступке с 30 мл дистилиророванной стерильной водой до однородной консистенции, после чего объем доводят до 200,0 мл. Используется свежеприготовленный раствор. Готовится в стерильном боксе, с соблюдением правил антисептики.

Проведены опыты по изучению воздействия водного раствора гидрогели метилкремниевой кислоты (энтеросгеля) на скорость появления первичного роста и накопления биомассы культуры микобактерий туберкулеза на традиционных питательных средах Финн-2 (Ф-2) и Левенштейна-Иенсена (ЛИ).

В первой серии опытов проводили испытания для доказательства сорбционной способности предлагаемого вещества. Для чего использовалась небациллярная мокрота больных. Мокроту предварительно обрабатывали 0,1% раствором ХГБ в соотношении 1:1, в течение 18 часов при комнатной температуре для разжижения и контаминации вторичной микрофлоры. Обработанный материал по 4 мл стерильными пипетками вносили в центрифужные пробирки, после чего в каждую из них добавляли по 1 мл соответствующего разведения дикого штамма МБТ - 5 стандарт, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 и 10^-5 степени. В опытные пробирки добавляли по 2 мл водного раствора водного раствора гидрогели метилкремниевой кислоты (энтеросгеля). Встряхивали на шейкере, затем центрифугировали 15 мин, 3 тыс. оборотов\мин. Надосадочную жидкость сливали, оставляя в пробирке осадок, к осадку добавляли по 1 мл жидкой среды Школьниковой. Стерильной пипеткой переносили по 0,4 мл в пробирки с плотной яичной средой Финн-2 и Левенштейна-Иенсена. Инкубировали при 37°С, просматривали посевы ежедневно. Учитывали появление начального роста и массивность или интенсивность роста МБТ. Результаты посева представлены в таблицах 1 и 2.

Как видно из таблицы 1, на среде Ф-2 при посеве бактериальной эмульсии МБТ 5 стандарта, разведения 10_-1, как в опытных, так и в контрольных посевах, начальный рост колоний был зафиксирован на 10 день наблюдения. Начальный рост МБТ из разведении 10^-2 и 10^-3 в опытных посевах отмечался на 10 день, в контроле на 13 день; начальный рост из разведении 10^-4 и 10^-5 в опытных посевах отмечен на 13 день, в контроле на 17.

В опытных посевах на питательной среде ЛИ при посеве бактериальной эмульсии МБТ 5 стандарта и разведении 10^-1, 10^-2, 10^-3 начальный рост регистрировался на 10 день наблюдения, разведении 10^-4 и 10^-5 на 21 день. В контроле также зарегистрировано запаздывание появления начального роста: 5 стандарт и 10^-1 на 13 день, 10^-2 и 10^-3 на 17 и 10^-4 и 10^-5 на 24 день наблюдения.

Таким образом, отмечено, что при использовании сорбента - водного раствора гидрогели метилкремниевой кислоты (энтеросгеля) появление начального роста МБТ особенно при малой концентрации возбудителя на 3-4 дня раньше, чем в контрольных посевах.

Показатели массивности или интенсивности роста МБТ на питательных средах приведены в таблице 2.

При посеве на питательные среды Ф-2 и ЛИ МБТ 5 стандарта и его разведении (10^-1, 10^-2, 10^-3) интенсивность роста в контроле и опытных посевах не отличалась. Но при посеве разведении 10^-4 и 10^-5 в опыте на обеих используемых средах количество колоний было больше и во всех случаях зарегистрированы более крупные по размеру колонии. Т.е. происходило накопление и увеличение выхода биомассы МБТ.

Проведено испытание водного раствора гидрогели метилкремниевой кислоты (энтеросгеля) на диагностическом материале от 172 больных. Из 172 опытных посевов положительных посевов (МБТ+) 53 (30,8%), в контроле положительных (МБТ+) 45 (26,0%), т.е. отмечается увеличение высеваемости МБТ на 4,8%.

Начальный рост МБТ в опытных посевах в среднем регистрируется на 20+2 день, интенсивный на 27+1,8 день. В контрольных посевах начальный рост зафиксирован на 26+1,5, и интенсивный на 32 день.

При сравнении массивности роста МБТ в контроле и опыте - на средах с применением водного раствора гидрогели метилкремниевой кислоты (энтеросгеля) отмечается большее накопление биомассы МБТ.

Полученные результаты свидетельствуют, что применение сорбента - водного раствора гидрогели метилкремниевой кислоты (энтеросгеля) является эффективным способом выращивания МБТ на плотных питательных средах, способствует оптимальному накоплению бактериальной массы, что имеет принципиальное значение для дифференциальной диагностики колоний МБТ и дальнейшей работе с выросшими культурами.

Табл.1
Регистрация первичного роста МБТ на среде Ф-2 и ЛИ (дни)Разведения\дни5 ст.10^-110^-210^-310^-410^-5Ф-2ЛИФ-2ЛИФ-2ЛИФ-2ЛИФ-2ЛИФ-2ЛИОпытные101010101010101013211321Контрол.101310131317131717241724

Табл.2
Регистрация массивности (интенсивности) роста МБТРазведения\дни5 ст.10^-110^-210^-310^-410^-5Ф-2ЛИФ-2ЛИФ-2ЛИФ-2ЛИФ-2ЛИФ-2ЛИОпытные>100>100>100>100>100>100До 100До 10037305040Контрол.>100>100>100>100>100>100До 100До 10030203020

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам диагностики туберкулеза. В диагностический материал, после обработки детергентом - хлоргексидин биглюконатом (ХГБ) перед посевом на плотные питательные среды дополнительно добавляют свежеприготовленный водный раствор гидрогели метилкремниевой кислоты, в соответствии 2:1, встряхивают, центрифугируют, к осадку добавляют по 1 мл среды Школьниковой, затем переносят на плотную питательную среду. Способ обеспечивает ускорение роста микобактерий туберкулеза и накопления бактериальной массы, что важно для дифференциальной диагностики туберкулеза. 2 табл.

Способ выращивания микобактерий туберкулеза (МБТ) путем обработки мокроты пациента раствором хлоргексидин биглюконата (ХГБ), посева диагностического материала на плотные яичные питательные среды, отличающийся тем, что после обработки ХГБ к материалу добавляют свежеприготовленный водный раствор гидрогели метилкремниевой кислоты в соответствии 2:1, встряхивают, затем центрифугируют 15 мин, к осадку добавляют по 1 мл жидкой среды Школьниковой, затем переносят на плотную питательную среду.