Способ приготовления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида @ @ продуцирующих глюкоамилазу Советский патент 1985 года по МПК C12N1/14 C12N9/34 C12R1/665 

вляют при аэрации с переменным рас- ды, а затем снижая до конца процесса ходом-воздуха, поддерживая его в те- поддерживая равным 30-45 сречение 24-48 ч равным 50-55 ере- . ды.

1089975

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ, ВИДА ASPERGILLUS AWAMORI, ПРОДУЦИРУЮЩИХ ГЛЮКОАМИЛАЗУ, предусматриваю1ций посев продуцента на увлажненную питательную среду, содержащую источник углерода в виде пшеничных отрубей, или муки кукуруз- ной, или ячменной, или рисовой, или ржаной, или соевой, или маниоки, солодовые ростки и минеральные соли, либо не питательную среду, содержащую растворимый крахмал, агар-агар и ячменное сусло, выращивание продуцента в две стадии при различном температурном режиме, который поддерживают на первой стадии в течение 5-6 сут.на уровне 29-31 0, а по достижении обильного спороношения, температуру снижают до 20-24 С и осуществляют вторую стадию в течение 56 сут, и последующее культивирование полученных конидий в несколько пассажей, используя в качестве производственной питательной среды высококонцентрированное по углероду зер-. .новое сусло с концентрацией 15-25 Б отличающийся тем, что с целью ускорения процесса культиви ровзния продуцента путем сокращения лаг-фазы, повышения активности глюкоамилазы и. получения препарата, содержащего наряду с глюкоамилазой протеазу и целдюлазу, перед культивированием на производственной, среде осуществляют выдержку конидий в течение 20-24.ч в растворе, содержащем следующие ингредиенты, мас.%: Натрий азотнокислый0,9-1,3 Аммоний фосфорнокислый двузамещен« ный0,2-0,28 Калий фосфорнокислый однозамещенный0,.2-0,25 Калий хлористый 0,1-0,15 Магний сернокислый 0,1-0,15 Железо сернокислое 0,005-0,015 Кобальт сернокислый 0,002-0,0400 Марганец сернокиссо со лый 0,005-0,01 Цинк сернокислый 0,001-0,0015 ч ел Медь сернокислая О,002-Ю,004 Вода Остальное или в растворе углеводов следзпощего состава, мас.%: 1-4 Глюкоза 1-4 Фруктоза 2-4 Мальтоза 2-4 Сахароза Остальное Вода или смеси указанных ингредиентов, а процесс культивирования на производственной питательной среде осущест

I

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам приготовления посевного материала для культивирования грибов вида Aspergillus awamori-, продуцирую щих глюкоамилазу.

Известен способ приготовления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида Aspergillus awamoriL, продуцирующих глюкоамилазу, предусматривающий посев продуцента на увлажненную питательную С1)еду, содержащую источник углерода в виде пшеничных отрубей (50-90%) илимуки (40-90) кукурузной, или ячменной, или рисовой, или ржаной, или соевой, или маниоки, солодовые ростки и минеральные соли, либо на питательную среду, содержащую растворимый крахмал (2-15%), агар-агар

(1-2%) и ячменное сусло (7-8), выращивание продуцента в две стадии при различном температурном режиме, который поддерживают на первой стадии в течение 5-6 сут. на уровне 29-31 С, а по достижении обильного спороношения температуру снижают до 20-24 0 .и осуществляют вторую стадию в течение 5-6 сут и последующее культивирование полученных конидий в несколько пассажей, используя в качестве Производственной питательной среды высококонцентрированные по углероду зерновое сусло с концентрацией 15-25 Б. При этом увлажнение питательных сред осуществляют раствором минеральных солей

Однако как по первому, так и по второму варианту, высокая активность глюкоамилазы, нехзбходимая для осахаривания крахмалсодержащего сырья, достигается лишь после 7 сут, культивирования, т.е. процесс длителен.

Целью изобретения является ускорение процесса культивирования продуцента путем сокращения лаг-фазы.

повышение активности глюкоамилазы и получение препарата, содержащего наряду с глюкоамИлазой протеазу и целлюлазу.

Поста;Вленная цель достигется тем что в способе приготовления посевного материала для культивирования плесневьпс грибов вида Aspergillus awamori, продуцирующих глюкоамилазу, предусматривающем посрв продуцента на увлажненную питательную среду, содержащую источник углерода в виде пшеничных отрубей или муки кукурузной, пли ячменной, или рисовой, или ржаной, или соевой или маниоки, солодовые ростки и минеральные соли, либо на питательную среду содержащую .растворимый крахмал, агаагар и ячменное сусло, выращивание продуцента в две стадии при различном температурном режиме, который поддерживают на первой стадии в течение 5-6 сут на уровне 29-31°С, а по достижении обильного спороношения температуру снижают до 20-24°С и осуществляют вторую стадию в течение 5-6 сут, и последующее культивирование полученных конидий в несколько пассажей, используя в качестве производственной питательной среды высококонцентрированное по углерду зерновое сусло с концентрацией 15-25°Б, согласно изобретению перед культивированием на прЬизводственной среде осуществляют выдержку конидий в течение 20-24 ч в растворе, содержащем следующие ингредиенты, мас.%:

Азотнокислый натрий (NaNOj)0,9-1,3

Двузамещенный фосфорнокислый аммоний (NH)2HP040,2-0,28 Однозамещенный фосфорнокислый калий

0,2-0,25

KHj РО

Хлористый калий 0,1-0,15 (КС«) Сернокислый Mariinii (,1-0,15 Сернокислое железо закисшее (FeSO) 0,005-0,015 Сернокислый мартанец (МпЗО) 0,005-0,01 Сернокислый кобальт (CoSO) 0,002-0,004 Сернокислый цинк (ZnSO) 0,001-0,0015 Сернокислая медь (CuS04) 0,002-0,004 Вода Остальное, или в растворе углеводов следующего состава, мас.%: глюкоза 1-4, фруктоза 1-4, мальтоза 2-4, сахароза 2-4, вода остальное, или в смеси указанных ингредиентов, а процесс культивирования на производственной питательной среде осуществляют при аэрации с переменным расходом воздуха, поддерживая его в течение 24-48 ч равным 50-55 м/м среды, а затем снижая и до конца процесса поддерживая равным 30-45 м/м среды. - Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Готовят концентрированную по крах малу твердую питательную среду, со держащую от 50-90% пшеничных отрубей с соответствующей добавкой солодовых ростков или от 40-90% маниок или ржаной, или ячменной, или рисовой, или кукурузной, или соевой муки с соответствующей добавкой солод вых ростков. Увлажняют твердую среду до 60% влажности или просто водо проводной водой или раствором солей следующего состава, мае. %: NaNOj 0,9 (NH4)2P04 8,2i KHjPO 0,22; KCl 0,11; Mg.SO 0,103-, FeSO 0,011,. MnS04 0,005i CaSO 0,004; ZnSO 0,001; CuSO 0,001. Культуру выращивают в течение 56 дней при температуре 25-31°С, а затем температуру снижают до 20-24° и осуществляют вторую стадию выращи вания также в течение 5-6 дней. Пос ле этого конидии выдерживают в течение 20-24 ч в солевом растворе сл дующего состава, мас.%: NaNOj 0,91,3; (NH4)2l0 0,2-0,28; 0,2 0,25; KCl 0,1-0,15; llgSO 0,1-0,15; FeSO 0,005-0,15; MnSO 0,005-0,01; CoS04 0,002-0,004; ZnSO 0,0010,0013; CuSO 0,002-0,004, или в уг водном .растворе следующего состава. ас.%: глюкоза 1-4; фруктоза 1-4; альтоза 2-4; сахароза 2-4, или в растворе, содержащем смесь вышепереисленных ингредиентов и далее культивируют на основной производственной реде (зерновом сусле). В дополнение к первому пересеву осуществляют селекцию культуры. Поучают t и И пассажи культуры. Готовые пассажи так же, как описано ыше, выдерживают в солевом или yi- еводном растворе или в растворе, одержащем смесь солей и углеводов, а затем заседают на зерновое сусло, содержащее 15-25°Б. Посев продуцента можно осуществять на среду, содержащую растворимый крахмал от 2 до 15%, агар агар 1-2% и ячменное сусло 7-8%. Готовый посевной материал перед основной ферментацией также выдерживают в солевом или углеводном растворах, или в растворе, содержащем смесь солей и углеводов, после чего засевают на зерновое сусло. Основную ферментацию осуществляют в течение 5,5-6 сут,при переменном расходе воздуха от 50-55 м/м среды в течение 1-2 сут. и до 30-45 м /мсреды в течение последующих суток. Активность глюкоамилазы в культуральной жидкости достигает на 5,5 сут. роста культуры от 250 до 450 ед/мя, т.е. для первого пересева 250300 ед/мл; 1 пассажа 300-350 ед/мл-, И пассажа 350-450 ед/мл. Активность глюкоамилазы в контроле на 5,5 сут., роста составляет для первого пересева 180-200 ед/мл; I пассажа . 190-210 ед/мл-, И пассажа 200-250 ед/мл-, на 7 сут. роста соответственно для первого пересева300-350 ед/мл-, 1 пассажа 4.00-450 ед/мл; И пассажа 500-600 ед/мл. Биосинтез глюкоамилазы р предлагаемом способе завершается на 6 сут, роста и составляет: для первого пересева330-385 ед/мл; 1 пассажа 440-460 .ед/мл; И пассажа 550-660 ед/мл, т.е. на 10% вьпве контроля. Пример 1. Питательную среду, состоящую из 50% пшеничных отрубей и 50% солодовых ростков, увлажняют до 60% водопроводной водой, засеваЭ10ют культурой гриба Aspergillus awamori 466, выращенной на агарированной среде следующего состава, мас.%: сахароза 2, азотнокислый натрий (NaNOj) 0,91i однозамещенный фосфорнокислый калий () 0,1- магний сернокислый () 0,05; хлористый калий (КСГ) 0,05; сернокислое железо (FeSO) 0,001-, агар-агар 2. (При температуре в течение 14 дией). Засевную культуру выращивают в течение 6 дней при t в термостате, а затем выращивают при t 20С, также в течение 6 дней. Полученный конидиальный посевной натериал замачивают в стерильном солевом растворе, содержащем, мас.%: NaN 0,01; (NH)2HP04 0,2; 0,2; КС1 0,1; 504 0,1; FeSO 0,05; MnSO 0,005; CoSO 0,002; ZnSO 0,001; CuSO 0,002 и вьщерживают в течение 24 ч в стационарных условиях при . Затем готовую культуру засевают в количестве 140 г на 10 м производственной питательной среды на кукурузное сусло. В течение первых 48 ч аэрацию осуществляют при расходе воздуха 50 м/м среды, а затем расход воздуха снижают и через 72 ч устававливают равным 30 среды, поддерживая его таким до конца процес.са. Процесс культивирования вели 132 ч (5,5 сут). После 5,5 сут культивирования получают культуру с активностью 270 ед/мп. Активность в контроле составляет 210 ед/мп. При осаждении 2 объемами этанола получают препарат глюкавйморин ГЮх с активностью 7000 ед/г, ех « 200 ед/г; ПС 100 ед/г. Пример 2. Питательную среду состоящую из 50% кукурузной муки и 50% солодовых ростков приготовляют. засевают культурой Aspergillus awamori 466, выращивают и рассевают на пассажи I, П л-ак же как в примере 1. Однако вьщержку Г и П пассажей перед засевом на производственную среду ос ществляют в углеводном растворе, содержащем 2% сахарозы, 1% фруктозы, 1% глюкозы, 2% мальтозы в течение 2А ч при . После 5,5 сут культивирования получают Культуральную жидкость с активностью глюкоамилазы I пассажа 56 350 ед/мл, И-450 ед/мл. Активность в контроле составляет 190-1-п ёд/мл, 200-П-п ед/мл. Культуральную жидкость охлаждают и осаждают 4 объемами этанола и получают препарат Глюкаваморин ПОх с активностью глюкоамилазы 10000 ед/г С;, 240 ед/г; Пр 140 ед/г. Пример 3. Приготавливают на косом агаре культуру Asp. awamori 466 на среде, содержащей Э, мас.%: Растворимый крахмал 10 Ячменное сусло8 Б Агар-агар2 Культуру выращивают при таких условиях температуры и времени, что в примере 1. Затем полученные конидии выдерживают в растворе содержащем., мас.%: NaNOj 1,3; (Ш4)2НР04 0,28; KHjPO 0,25; KCl 0,15; MgSO 0,15; FeSO 0,15; MnS04 0,01; CoSO 0,004; ZnSO 0,0015; CuSO 0,004; глюкоза 4 ипи фруктоза 4, или мальтоза 4, или сахароза 4., Полученную культуру засевают в количестве 90 тыс. на 1 мл питательной среды на 20° Бал кукурузном сусле. Аэрацию проводят в течение первых 2 сут при расходе воздуха -55 среды, а последующих 3,5 еут 45 м /м .. После 5,5 сут культивирования активность глюкоамилазы на 18 Кал кукурузном сусле составляет 350 ед/ьш, на 20°Бал кукурузном сусле - 300 ед/мя для 18 Бал кукурузного сусла. . П р и м. е р 4. Питательную среду, состоящую из 70% ячменной муки и 30.% солодовьк ростков, увлажняют до 60% солевым раствором состава, мас.%: NaNOj 0,9; (NH) НРО, 0,2; KHjPG 0,22; KCl 0,11; MgSO 0,103;. FeSO. 0,011; №1804 0,005; CoSO 0,004; ZuSO 0,001; CuSO. 0,004; вода ocтйльное. Селекцию, выдержку и выращивание осуществляют как в примере 2. Активность глюкоамилазы на 5,5 сут/ составляет: I пассаж 300 ед/мп, И пассаж - 450 ед/мл. Пример 5. Питательную среду, состоящую из 50% пшеничных отрубей и 50% солодовых ростков, засевают штаммом гриба Aspergillus awamori 224-21 и рассевают так же как в примере 2.

Выдержку перед рассевом оЬуществляют в углеводном растворе в течение 24 ч при 25 С. Раствор содержит 3% сахарозы или 2% фруктозы, или 3% мальтозы, или 4% сахарозы, s Аэрацию-осуществляют при расходе воздуха в первые двое сут,50 среды, а в последующие - 40 среды.

После 5,5 сут культивирования по- Ю лучают культуральную жидкость с активностью, ГлА для первого рассева 85 ед/мл, для 1 п 150, для Ип 210 ед/мл..

Активность препаратов Глюкаваморин15 Г10х составляет: 1 пересев 2000 ед/Г; 1 п - 4000 ед/г-, Пп - 6000 ед/г. Согласно изобретению уменьшение лагфазы на 8-10 ч ведет к сокращению срока культивирования процесса фер- 20 ментации на 1-1,5 сут. На5,5-6 сут ГлА по предлагаемому способу достигает таких же величин, как по известному на 7 сут. Это обеспечивается вьщержкой конидий и специально подоб-25 ранным режимом культивирования.

Пример 6. Питательную среду, состоящую из 50% пшеничных отрубей и 50% солодовых ростков, увлажняют до 60% водопроводной водой, засевают культурой гриба Aspergillus awamori 466, выращенной на агаризованной среде следующего состава, %: сахар 2 азотнокислый натрий (NaNOj). 0,91; однозамбщенный фосфорнокислый , 35 калий КН2Р04 0,1-, магний сернокислый iMgSO калий хлористый КС 0,05. железо сернокислое.FeSO 0,001; агарагар 2 (при температуре 22с в течение 14 дней). Засевную культуру 40 выращивают при температуре 30 С в течение 6 дней в термостате, а затем выращивают при температуре также в течение 6 дней. Полученный конидиальный посевной материал замачивают в стерильном углеводносолевом растворе, содержащем, мас.%: сахароза 2, мальтоза 2, глюкоза 1, фруктоза 1, NaNOj 0,91; (Ш4)2НР04 0,2; КН2Р04 0,2; КС1 0,1; MgSO 0,1; 50 FeSO 0,05; luiSO 0,005; CoSC 0,002; ZnSO 0,001; CuSO, 0,002 и выдерживают в течение 24 ч при температуре 25С в стационарных условиях. Затем готовую культуру засевают на 55 концентрированное кукурузное сусло 20 Бал и культивируют в течение 132 ч, т.е. 5,5 сут, активность ГлА

в культуральной жидкости составляет 296 едУмл. Активность в контроле составляет 190 ед/мл. При осаждении 2 объемами этанола получают Глюкаваморин ГЮх с активностью ГлА 9000 ед/п, Cf 230 ед/г и ПС 110 ед/г.

Пример 7. Питательную среду, состоящую из 50% пшеничных отрубей и 50% солодовых ростков, увлаж- няют до 60% водопроводной водой, засевают культурой гриба Асп.авамори 466 и выращивают так же как в примере 1. Затем споровый материал выдерживают в течение 24 ч при температуре 25°С в углеводном растворе, содержащем, мас.%: глюкоза 2, мальтоза 2, фруктоза 1, сахароза 2, в стационарных условиях. Затем готовую культуру засевают на концентрированное кукурузное сусло 20° Бал и культивируют в течение 132 ч, т.е« 5,5 сут; активность ГлА в культуральной жидкости составляет 250 -ед/м а активность в контроле 200 .ед/мл. При осаждении 2 объемами этанола получают Глюкаваморин ГЮх с активностью ГлА 6800 ед/г; С 200 ед/г; ПС 100 ед/г.

Пример 8. Питательную среду, состоящую из 50% пшеничных отрубей и 50% солодовых ростков, увлажняют до 60% водопроводной водой, зйсевают культурой гриба Асп.авамори466 и выращивают так же как в примере 1, затем споровый материал выдерживают в солевом растворе, содержащем, мас.%: NaNOj 1,3; (Ш,)Р040,28 KHjPO 0,25; КС1 0,15; MgSg 0,15; FeSO 0,15; MnS04 0,01; CoSO 0,004; ZnSO 0,0015; CuSO 0,004 при температуре 25°C в течение 24 ч, затем его засевают на концентрированное кукурузное сусло Бал и культивируют в течение 5,5 сут. Активность глюкоамилазы составляет 280 ед/мл, а активность в контроле 180 ед/мл. При осаждении этанолом получают Глюкаваморин ГЮх с активностью по ГлА 6800 ед/ri С 220 ед/г; ПС 95 ед/г.

Пример 9. Культивирование осуществляют аналогично примерам 1, 2, а вьщержку - в смеси следующих ингредиентов, мас.%: глюкоза 4, фруктоза 4, мальтоза 4, сахароза 4 и NaNO 1,2; (Ш4)2 НР04 0,25; КНгРОл 0,24: КС1 0,1; MgSO 0,15; FeSO