ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ДЕРМАТОФИТОЗОВ В ВЕТЕРИНАРИИ И МЕДИЦИНЕ Российский патент 2005 года по МПК A61K35/70 A61K39/00 A61P17/00 

Настоящее изобретение относится к новой вакцине, содержащей вакцинационные штаммы дерматофитов, и касается ее применения для иммунопрофилактики и лечения дерматофитозов, а также методов ее изготовления. Вакцины согласно изобретению могут использоваться как в ветеринарии, так и в медицине.

В настоящее время в ветеринарии в профилактических и терапевтических целях применяют ряд вакцин против дерматофитозов. При этом речь идет как о живых, так и об убитых вакцинах. Они описаны, в частности, в CS 160324, PI 156844, SU 1734762, GB 2025222, SU 955570, SU 955571, SU 548947, SU 835446, RU 2013444, RU 2013445, ЕР 393371, DE 9218921 U1, Pl 100958, US 4229434, US 5277904, US 5284652, CS 201481, CS 246791, CS 261460, CZ 279278 и CZ 279982. Общим для всех описанных в этих публикациях вакцин является их парентеральное применение; большей частью вакцины вводят внутримышечно, реже - подкожно. То обстоятельство, что парентеральное применение потенциально несет с собой опасность возникновения анафилактических и анафилактоидных реакций в вакцинированном организме (Гаддинг Р. и Нэсс, Американский журнал ветеринарных исследований /Amer. J. Vet. Res./ 47, 1986, 2415-2417, "Вакцинация скота против кольчатого червя, вызванного вирусами Trichophyton verrucosum"), исключает, разумеется, медицинское применение произведенных до сего времени вакцин, в связи с чем возникла безотлагательная необходимость в создании, прежде всего, такой вакцины, которую можно было бы использовать также и в медицине.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение касается прежде всего новой вакцины, содержащей вакцинационные штаммы дерматофитов, ее применения для иммунопрофилактики и лечения дерматофитозов.

Предложенные в соответствии с изобретением вакцины найдут применение как в медицине, так и в ветеринарии. К теплотворным животным, подлежащим лечению согласно изобретению, в ветеринарии относятся, в частности, домашние и пользовательские животные.

Согласно изобретению под дерматофитозом понимается вызванное дерматофитами заболевание кожи и прилегающих к ней образований. Изобретение касается вакцины, содержащей по меньшей мере один вакцинационный штамм дерматофитов.

При этом к дерматофитам причисляют, в частности, грибки видов трихофитон, микроспорум, эпидермофитон, артродерма и нанницция. Особенно предпочтительные вакцинационные штаммы относятся к виду трихофитон, в частности предпочтительными являются штаммы Trichophyton verrucosum CCM F-765 (a1), Trichophyton verrucosum CCM 8166 (a2), Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 (a3) и Trichophyton rubrum CCM 8291 (a4). Культуры вышеназванных штаммов Trichophyton verrucosum CCM F-765 (al) и Trichophyton verrucosum CCM 8166 (a2) были поданы заявителями в Seach Collection of Microorganism (CCM) /Исследовательская коллекция микроорганизмов/, Masaryk Universitat, Tvrdeho 14. 602 00 Brno 5 ноября 1984 года и, соответственно, 23 февраля 1993 года под регистрационными номерами ССМ F-765 и ССМ 8166, причем эти заявки 14 декабря 1992 года и, соответственно, 22 июля 2002 года были преобразованы в заявки по Будапештскому договору. Культуры вышеназванных штаммов Trichophyton mentagrophytes ССМ 8290 (аЗ) und Trichophyton rubrum ССМ 8291 (а4) были заявлены там же 23 июля 2001 года согласно Будапештскому договору под регистрационными номерами ССМ 8290 и, соответственно, ССМ 8291.

Другим предпочтительным вариантом осуществления является вакцина, которая содержит сочетание по меньшей мере двух из перечисленных выше вакцинационных штаммов вида Trichophyton, особенно же предпочтительно сочетание трех из четырех вышеуказанных вакцинационных штаммов.

При этом соотношение отдельных вакцинационных штаммов а1:а2:а3:а4, равное 0, или 2-10:0, или 1-5:0, или 5-30:0, или 2-10; или же 0, или 1-10:0, или 1-2:0, или 3-30:0, или 1-3, или же 0, или 1-10:0, или 1-5:0, или 3-30:0, или 1-10, является в конечном продукте особенно предпочтительным.

Наиболее предпочтительными для ветеринарного применения являются при этом варианты осуществления с соотношением а1:а2:а3, равным 2:1:5, или же 10:1:30, или же исключительное применение a1 (Trichophyton verrucosum ССМ F-765).

Наиболее предпочтительными для медицинского применения являются при этом варианты осуществления с соотношением a1:а2:а3:а4, равным 4:2:10:3 или же 10:1:30:2, а также с соотношениями a1:а3:а4, равными 1:3:1, и а2:а4, равными 1:2, или же исключительное применение а4 (Trichophyton rubrum ССМ 8291).

Предпочтительно далее, чтобы общее число вегетативных форм вакцинационных штаммов в конечном продукте составляло не менее 1 млн на 1 мл. Особенно предпочтительным является общее число не менее 5 млн на 1 мл, наиболее предпочтительным - не менее 10 млн на 1 мл.

Область значений рН конечного продукта находится в пределах примерно от рН 3,0 до 10,0. Для этого применяются подходящие буферные системы, которые для специалиста являются общеизвестными, например ацетатные или карбонатные буферные системы или фармацевтически переносимые органические или неорганические кислоты, такие, как лимонная, уксусная или соляная кислота.

Предпочтительная область значений рН лежит в пределах примерно от рН 6,0 до 8,0. Для этого применяются фосфатные буферные системы различного состава, хорошо известные специалисту.

Для медицинских целей общее содержание формальдегида составляет около 0,02% или меньше, а для ветеринарных целей - около 0,05% или меньше. Такое количество, остающееся после инактивирования, в физиологическом плане не вызывает сомнений и разрешается законом. Кроме того, оно выполняет дезинфицирующую функцию и функцию поддержания профилактического и терапевтического действия. При необходимости формальдегид может быть дополнен или замещен другими веществами. Наряду с особенно подходящим формальдегидом также могут быть применены химические либо физические приемы, такие, например, как бета-пропионолактон, бинарный этиленимин и уксусная кислота.

Наиболее предпочтительным является общее содержание формальдегида менее 0,02% и, соответственно, менее 0,05%.

Вакцины согласно изобретению могут вводиться парентерально, например внутримышечно или подкожно, а также накожно. При этом для медицинских целей особенно предпочтительным является накожное применение, то есть нанесение и распределение на коже.

В частности, вакцину предпочтительно применяют накожно в области между пальцами стопы, которая представляет собой основной источник дерматомикозов других частей тела человека. Как уже упоминалось выше, накожное применение позволяет минимизировать опасность возникновения анафилактических и анафилактоидных реакций, порой опасных для жизни.

Метод накожного применения дает к тому же дополнительные преимущества, так как отпадает необходимость в инъекции, как это имеет место при обычном парентеральном введении вакцин. Так, благодаря отсутствию болей или может быть некоторой боязни, связанной с ожиданием инъекции, улучшается степень податливости пациента, что, естественно, относится и к ветеринарии, поскольку там лицу, проводящему лечение, не нужно остерегаться опасной реакции животных, вызываемой страхом и болью.

Следующий аспект изобретения заключается в разработке описанного ниже метода изготовления предложенной согласно изобретению вакцины против дерматофитозов.

Вакцинационные штаммы размножают в отдельности на агаровых питательных средах подходящего состава, содержащих связанный сахаридом и органически связанный азот, в случае необходимости после промежуточного установления заданного значения рН, при температуре от 25 до 29°С в стерильных условиях в течение 10-30 суток до оптимального образования вегетативных форм. Затем штаммы гомогенизируют в водном 0,1-процентном растворе формальдегида и инактивируют образовавшиеся суспензии при температуре от 18 до 26°С в течение не менее 24-36 часов. Гомогенизацию осуществляют таким образом, чтобы преобладающая часть спор отделялась от мицелия, не разрушая при этом структуры своей поверхности.

После определения числа вегетативных форм отдельные штаммы в случае необходимости смешивают между собой и дополняют буферированным посредством, например, фосфата физиологическим раствором поваренной соли так, чтобы общее число вегетативных форм всех вакцинационных штаммов составляло по меньшей мере 1 млн на 1 мл, предпочтительно не менее 5 млн. на 1 мл вакцины, чтобы значение рН находилось в пределах от рН 3 до рН 10, предпочтительно в пределах 6,0-0,8, и остающееся после инактивирования содержание формальдегида составляло при медицинском применении 0,02% и меньше, а при ветеринарном применении - 0,05% и меньше.

При этом предпочтительно, чтобы смесь штаммов а1:а2:а3:а4 соответствовала соотношению в конечном продукте, равному 0, или 2-10:0, или 1-5:0, или 5-30:0, или 2-10, при этом вышеуказанные соотношения компонентов смеси и отдельные штаммы являются особенно предпочтительными.

Антигенный состав вакцины, предложенной согласно изобретению, настолько широк, что позволил обнаружить также иммунные реакции против гомологичных видов и перекрестные реакции против других видов дерматофитов, таких, например, как Microsporum canis или Trichophyton equinum.

Ниже описаны особенно предпочтительные варианты осуществления изобретения. Они служат лишь для иллюстрации изобретения, но не ограничивают его.

Примеры изготовления и применения

Пример 1: Изготовление ветеринарной вакцины и ее применение

Для выращивания/размножения вакцинационных штаммов вида Trichophyton использовали питательную среду, содержащую 1,2% агара, 5,0% сахаридов и 0,3% органически связанного азота.

Питательную среду стерилизовали в паровом автоклаве в течение 20-30 мин при избыточном давлении от 80 до 100 кПа. После установления заданного значения рН величиной 6,0-7,0 дно стеклянной колбы покрывали питательной средой и повторяли стерилизацию при указанных выше условиях. После затвердевания агара и проверки на стерильность производили инокуляцию питательной среды в колбах в отдельности суспензиями вакцинационных штаммов. Для инокуляции применяли либо лиофилизаты, либо свежеподготовленные инокуляты вакцинационных штаммов (ССМ F-765, ССМ 8166 и ССМ 8290). Каждый инокулят содержал по меньшей мере 0,5 млн КОЕ (колониеобразующих единиц) на 1 мл. Инокуляты вакцинационных штаммов распределяли по поверхности питательной среды. Культивирование проводилось при температуре от 25 до 29°С в течение 10-30 суток для достижения оптимального образования вегетативных форм. На стадии высокой продуктивности грибкового антигена выращенные культуры снимали с поверхности питательной среды и гомогенизировали в водном 0,1-процентном растворе формальдегида. Гомогенизация производилась с помощью гомогенизатора так, чтобы преобладающая часть спор отделялась от мицелия, не разрушая при этом структуры своей поверхности. Полученную таким образом однородную суспензию распределяли по отдельным сборникам и выдерживали при температуре от 18 до 26°С в течение 24 часов для инактивирования вакцинационных штаммов. Затем в счетной камере по Бюркеру определяли число вегетативных форм для отдельных вакцинационных штаммов. Это число составляло в целом 41 млн. в 1 мл вакцины. Отдельные вакцинационные штаммы смешивали так, чтобы в готовом вакцинальном препарате соотношение Trichophyton verrucosum CCM F-765: Trichophyton verrucosum CCM 8166:

Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 равнялось 2:1:5.

Содержание формальдегида составляло 0,05%.

За счет добавки буферированного фосфатом физиологического раствора поваренной соли устанавливали значение рН препарата, равное рН 6,0.

Изготовленную таким образом вакцину проверяли на стерильность и число вегетативных форм и применяли для вакцинации крупного рогатого скота, зараженного трихофитозом. В результате двухразовой внутримышечной прививки дозами по 5 мл заболевший скот из двух племенных стад излечивали в течение 14 суток после повторной вакцинации.

Такой успех, если иметь в виду результаты, полученные с помощью применяемых до сего времени иммунобиологических препаратов, где терапия длится, как правило, 1-3 месяца, является весьма неожиданным.

Пример 2: Изготовление медицинской вакцины и ее применение

Для выращивания вакцинационного штамма использовали питательную среду с долей агара 1,3%, содержанием сахарида 10,0% и содержанием органически связанного азота 0,5%. Стерилизацию проводили в паровом автоклаве дважды по 30 минут при избыточном давлении 120 кПа. Значение рН питательной среды составляло 6,6. Последнюю инокулировали суспензией штамма Trichophyton verrucosum CCM F-765, температуру культивирования выдерживали равной 25-26°С. Гомогенизацию выращенной культуры в 0,1-процентном растворе формальдегида осуществляли через 15 суток культивирования. После инактивации, которая продолжалась 36 часов при температуре 22°С, добавляли буферированный фосфатом физиологический раствор поваренной соли. Содержание формальдегида в готовом растворе вакцины составило 0,04%, значение рН равнялось 7,3 и число вегетативных форм вакцинационного штамма - 22 млн в 1 мл.

Раствор вакцины был испытан на крупном рогатом скоте и показал хорошее защитное действие.

Пример 3: Изготовление ветеринарной вакцины и ее применение

При изготовлении вакцины проводились действия, аналогичные действиям по примеру 1, штаммы Т. verrucosum CCM F-765, Т. verrucosum CCM 816 и Т. mentagrophytes CCM 8290 находились в соотношении 10:1:30. Содержание формальдегида составляло 0,04%, значение рН было установлено равным 8,0, общее число вегетативных форм всех вакцинационных штаммов составляло 80,0 млн в 1 мл вакцины.

Раствор вакцины испытывали на переносимость на телятах в возрасте 1 месяца. 10 мл раствора вакцины внутримышечно вводили пяти телятам в мускулатуру ягодиц. За 24 часа до вакцинации, во время вакцинации и спустя четыре часа после вакцинации, а также в последующие 4 дня телятам ректально измеряли температуру. Вакцина была переносимой, температура тела оставались у всех животных в пределах физиологических значений. У вакцинированных телят не было обнаружено никаких нежелательных локальных или иных реакций последействия.

Пример 4: Изготовление медицинской вакцины и ее применение

Вакцинационные штаммы размножали в питательной среде, содержащей 1,5% агара, 15,0% сахаридов и 1,0% органически связанного азота. Стерилизацию питательной среды проводили в паровом автоклаве дважды по 25 минут при избыточном давлении от 80 до 100 кПа. Инокуляцию, культивирование вакцинационных штаммов, гомогенизацию, инактивирование и определение количества вегетативных форм осуществляли таким же образом, как описано выше в примере 1. Вакцинационные штаммы Trichophyton verrucosum CCM F-765: Trichophyton rubrum CCM 8291: Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 смешивали в соотношении 1:1:3.

Полученную суспензию разбавляли необходимым количеством буферированного фосфатом физиологического раствора поваренной соли, в результате чего содержание остаточного формальдегида составило 0,02%, а общее число содержащихся в конечном продукте вегетативных форм - 10 млн. При этом значение рН в зависимости от состава буферного раствора устанавливалось в пределах от 6,0 до 8,0.

После определения числа вегетативных форм, содержания формальдегида и соответствующего значения рН вакцину проверяли на стерильность и на добровольных пробандах испытывали на безвредность для человека. Для этого вакцину в количестве 10 мл три раза в неделю втирали в область между пальцами нижних конечностей. Вредных побочных действий на человека установлено не было.

Кроме того, вакцину дважды применяли накожно на животных, экспериментально инфицированных трихофитозом. По сравнению с невакцинированными животными успех лечения наступал примерно на неделю раньше, что доказывает терапевтическую эффективность изготовленной указанным образом вакцины согласно изобретению.

Пример 5: Изготовление вакцины для медицинского применения

Вакцинационный штамм Trichophyton rubrum CCM 8291 культивировали в течение 18 суток при температуре от 26 до 28°С в питательной среде, имеющей состав согласно примеру 2. Инактивирование гомогенизированной культуры в 0,1-процентном растворе формальдегида при температуре 26°С продолжалось в течение 24 часов. После перемешивания инактивированной суспензии с физиологическим раствором поваренной соли, буферированным фосфатом, значение рН составило 6,8, содержание формальдегида - 0,015% и число вегетативных форм вакцинационного штамма - 11 млн в 1 мл.

Раствором вакцины на телятах проводили тест на контрольное заражение. Дважды накожно вакцинированные телята в противоположность невакцинированным контрольным животным были в достаточной мере защищены от экспериментальной инфекции трихофитии.

Пример 6: Изготовление вакцины для медицинского применения

Растворы вакцины изготавливали из разных количеств двух штаммов дерматофитов Trichophyton verrucosum CCM А-765 и Trichophyton mentagrophytes CCM 8290. Для их выращивания применяли питательную среду, содержащую 1,5 % агара, 0,8% сахаридов и 0,8% пептона. Стерилизацию осуществляли дважды по 30 минут в паровом стерилизаторе при избыточном давлении 120 кПа. Инокуляцию питательных сред производили в отдельности суспензиями указанных вакцинационных штаммов с содержанием 1,0 млн на 1 мл инокулята. Через 10 суток инкубации при 25-27°С культуры гомогенизировали в 0,1-процентном растворе формальдегида при числе оборотов 10000 об/мин в течение 2-3 минут. Затем суспензии выдерживали в темноте в течение 72 часов при температуре 18°С для инактивирования вакцинационных штаммов. Для определения инактивации применяли инкубационной тест на питательных средах. Инактивированную суспензию разбавляли посредством буферированного фосфатом физиологического раствора поваренной соли так, чтобы содержание формальдегида составило 0,018%, значение рН было равно 7,17, а число вегетативных форм вакцинационных штаммов составило 15,8 млн в 1 мл.

Вакцину проверяли на безвредность на кроликах. После внутримышечной инъекции 3 мл раствора вакцины в тазовую мускулатуру ни у одного из десяти кроликов не было зафиксировано нежелательных локальных реакций или изменений общего состояния.

Пример 7: Изготовление вакцины для медицинского применения

Вакцинационные штаммы Т. verrucosum CCM 8166 и Т. rubrum CCM 8291 выращивали в среде для культивирования с составом: 1,2% агара, 10,0% сахарида и 0,5% пептона. Эти субстанции в автоклаве подвергали стерилизации в воде при таких же условиях как в примере 6. Культивирование при 28-29°С прекращали через 30 суток, полученные культуры гомогенизировали в 0,1-процентном растворе формальдегида и инактивировали в течение 24 часов при 24°С. Соотношение представленных в вакцине штаммов Т. verrucosum CCM 8166 и Т. rubrum CCM 8291 составляло 1:6.

Путем добавления буферированных фосфатом физиологических растворов поваренной соли с различной долей гидрофосфата натрия устанавливали величину рН в пределах от 6,0 до 8,0.

Число вегетативных форм составило 5 млн в 1 мл раствора вакцины.

Раствор вакцины наносили на поверхность площадью 10×10 см стриженой и скарифицированой кожи трех телят в количестве 5 мл на каждое животное в течение трех суток подряд. У животных не было отмечено ни локальных, ни иных поствакцинальных реакций.

Пример 8: Изготовление медицинской вакцины и ее применение

Питательную среду готовили соответственно примеру 2. Инокуляцию, культивирование и гомогенизацию выращенных культур производили аналогично примеру 1. Для изготовления вакцины применяли 4 вакцинационных штамма в следующем их соотношении между собой: Т. verrucosum CCM F -765:Т. verrucosum CCM 8166:Т. mentagrophytes CCM 8290:Т. rubrum CCM 8291=4:2:10:3.

Общее число вегетативных форм вакцинационных штаммов составляло 75 млн в 1 мл, содержание формальдегида - 0,015%.

Путем добавления буферированных фосфатом физиологических растворов поваренной соли с различной долей гидрофосфата натрия устанавливали величину рН в пределах от 6,0 до 8,0.

Раствор вакцины испытывали на двух добровольных пробандах, нанося его накожно в область между пальцами стопы в течение трех суток подряд. Вакцина оказалась безвредной и не вызывала никаких нежелательных клинических изменений - ни локальных, ни касающихся общего состояния.

Пример 9: Изготовление медицинской вакцины и ее применение

Раствор вакцины получали таким же образом, как и в примере 8, с той лишь разницей, что взаимное соотношение штаммов a₁:а₂:а₃:а₄=10:1:30:2, а значение рН раствора составляло 6,9.

Раствор вакцины в терапевтических целях наносили на пораженные места в области между пальцами стопы, а также на большой палец левой стопы с клиническими изменениями, вызывавшими подозрение на микоз; при этом выделить возбудитель не удалось. Благодаря втиранию раствора вакцины в инфицированную кожу один раз в день в количестве 2 мл в течение трех суток подряд излечение изменений на коже констатировали через 7 дней после третьей аппликации.

Таким образом, как это без сомнения следует из вышеизложенного и примеров применения, согласно данному изобретению создана высокоэффективная и при этом простая в применении вакцина для иммунопрофилактики и лечения дерматофитозов в ветеринарии и медицине. Предложенная вакцина может использоваться в ветеринарии как парентерально, например внутримышечно и подкожно, так и накожно. Далее, вакцину согласно изобретению особенно предпочтительно можно использовать в медицине накожно путем соответствующего нанесения ее на кожу человека, например посредством опрыскивания с помощью стерильных напыляющих ампул.

Таким образом, впервые выработана вакцина для накожной аппликации против дерматофитозов, предназначенная для применения в медицине. Благодаря накожной аппликации исключается риск возникновения порой опасной для жизни анафилактической или анафилактоидной реакции.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и касается вакцины для профилактики и лечения дерматофитозов. Сущность изобретения заключается в разработке вакцины, содержащей от одного до 4-х вакцинных штаммов дерматофитов, которая может быть использована для иммунопрофилактики и лечения дерматофитозов, а также способа изготовления этой вакцины. Преимущество изобретения заключается в накожной аппликации вакцины, благодаря чему исключается риск возникновения анафилактических реакций. 3 с. и 19 з.п. ф-лы.

1. Вакцина для профилактики и лечения дерматофитозов в ветеринарии и медицине, содержащая по меньшей мере один из нижеследующих вакцинных штаммов:

a1) Trichophyton verrucosum CCM F - 765;

а2) Trichophyton verrucosum CCM 8166;

a3) Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 и

a4) Trichophyton rubrum CCM 8291,

при этом общее число вегетативных форм вакцинных штаммов составляет не менее 1 млн в 1 мл готового препарата.

a1) Trichophyton verrucosum CCM F - 765;

а2) Trichophyton verrucosum CCM 8166;

a3) Trichophyton mentagrophytes CCM 8290 и

a4) Trichophyton rubrum CCM 8291,

для изготовления вакцины для иммунопрофилактики или лечения дерматофитозов у человека или животного.

а) раздельное выращивание комбинируемых вакцинных штаммов на агаровых питательных средах подходящего состава, содержащих связанный сахарид и органически связанный кислород, в случае необходимости после промежуточного установления значения рН при температурах в диапазоне от 25 до 29°С в стерильных условиях в течение 10-30 суток до оптимального образования вегетативных форм,

б) последующую гомогенизацию в водном 0,1-процентном растворе формальдегида, при этом преобладающая часть спор отделяется от мицелия, не разрушая при этом структуры своей поверхности,

в) а также инактивирование штаммов в полученных суспензиях при температуре от 18 до 26°С в течении по меньшей мере 24-36 ч,

г) смешивание вакцинных штаммов в определенном соотношении,

д) с содержанием вегетативных форм для каждого штамма не менее 1 млн в 1 мл готового препарата,

е) установление значения рН а пределах от 3,0 до 10,0 и

ж) с остаточным содержанием формальдегида, в случае необходимости с последующим замещением формальдегида.