СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКОГЕНА В ЭКСТРАКТЕ ИЗ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ ПЧЕЛ Российский патент 2005 года по МПК A01K67/00 G01N33/52 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности биохимии животных.

В ветеринарии определение содержания гликогена является одним из важных тестов в выявлении энергетического ресурса организма пчел.

Гликоген - полисахарид, или животный крахмал, синтезируется организмом и депонируется во всех его органах и тканях. Гликоген является легко мобилизируемой резервной формой глюкозы и представляет собой разветвленный полимер из остатков глюкозы крови.

Известно определение гликогена в крови цитохимически ШИК - реакцией, методом Шабадаша [см. Клиническая лабораторная аналитика под ред. В.В.Меньшикова. Том 2. - Частные аналитические технологии в клинической лаборатории. М. - “Лабинформ” - РАМЛД, 1999. С. 59-61], где осуществляют подготовку мазков крови, фиксацию в абсолютном спирте и обработку - инкубацию в растворе периодита и окрашивают реактивом Шиффа с последующим окрашиванием гемотоксилином и высушиванием, где гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый цвет на зеленом фоне препарата, и микроскопированием.

Также известно определение гликогена в крови [Horeysi J. Et al. Zaklady chemickeho vysetrovani v lekarstvi. Pppraha, 1957. Справочник Биохимические методы исследования в клинике. Под редакцией академика АМН СССР проф. А.А.Покровского. Медицина. М.: - 1969. Определение гликогена в крови колориметрическим методом с орцином (по Хорейши), стр. 230-231], где гликоген осаждают спиртом и гидролизуют в кислой среде до глюкозы и нагревают в серной кислоте, которая превращается в оксиметилфурфурол и конденсируется орцином, образуя окрашенное соединение. Все вышеуказанное осуществлялось путем кипячения исследуемого биологического субстрата в концентрированном растворе гидроксида натрия в центрифужной пробирке, с последующим добавлением спирта, охлаждением, центрифугированием, отбором надосадочной жидкости, растворением осадка в полунасыщенном растворе сернокислого натрия с последующим дополнительным охлаждением, центрифугированием и растворением осадка, одновременное добавление в центрифужную пробирку с исследуемым биологическим субстратом, в контрольную пробирку с водой и в пробирку со стандартным раствором глюкозы 13 мл серной кислоты и 1 мл 1% раствора орцина с последующим нагреванием, охлаждением, фотометрирование против контроля и определение гликогена по формуле

где Х - количество гликогена, мг%; Е_о - экстинция опытной пробы; Е_ст - экстинция стандартного раствора,

Недостатками известных методов является трудоемкий длительный процесс, не достаточно точное определение содержания гликогена в крови, а также отсутствие возможности определения содержания гликогена в тканях органов у пчел.

Техническим решением задачи является повышение точности диагностирования, уменьшение затрат времени, материальных затрат и использование более доступных химических реактивов и расширение технологических возможностей.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения содержания гликогена в экстракте из органов и тканей пчел, включающем кипячение исследуемого биологического субстрата в концентрированном растворе гидроксида натрия в ценрифужной пробирка с последующим добавлением спирта, охлаждением, центрифугированием, отбором надосадочной жидкости, растворением осадка в полунасыщенном растворе сернокислого натрия с последующим дополнительным охлаждением, центрифугированием и растворением осадка, одновременное добавление в центрифужную пробирку с исследуемым биологическим субстратом, в контрольную пробирку с водой и в пробирку со стандартным раствором глюкозы 13 мл серной кислоты и 1 мл 1% раствора конденсата с последующим нагреванием, охлаждением, фотометрирование против контроля и определение гликогена по формуле

где Г - количество гликогена, мг%; Е_о - экстинция опытной пробы; Е_ст - экстинция стандартного раствора,

в качестве биологического субстрата используют экстракт из органов и тканей пчел, а для кипячения - 30% гидроксид натрия, при этом охлаждение осуществляют в течение 15 минут, центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 15 минут, добавляют в пробирки 2 мл 1% конденсата, в качестве которого используют резерцин, и фотометрируют при длине волны λ=315 нм.

Новизна заявляемого способа обусловлена тем, что является наиболее доступным и точным, и дает возможность определения содержания гликогена в тканях органов у пчел по сравнению с известным методом определения содержания гликогена крови как с научной, так и с экономической стороны. Предложенный метод позволяет определить содержание гликогена в экстракте органов и тканей у пчел. Кроме того, заявляемое предложение является более экономичным, т.к. не требует применения особо дорогостоящих химических реактивов.

Пример конкретного осуществления способа определения содержания гликогена в экстракте из органов и тканей пчел

Подготовка экстракта из органов и тканей пчел.

Для этого у пчел удаляли наружный покров и кишечник при помощи пинцета и глазных ножниц. Ткани и органы, полученные от десяти пчел, помещали в фарфоровую ступку и растирали пестиком, затем к содержимому добавили физиологический раствор из расчета 1:1, настаивали в течение 1-1,5 часов в холодильнике при температуре 5°С и фильтровали через бумажный фильтр.

Приготовление растворов

Для приготовления 52% серной кислоты объемом 325 мл необходимо взять 225 мл концентрированной серной кислоты и, осторожно приливая, 100 мл дистиллированной воды.

Для приготовления 1% раствора резорцина необходимо взять 1 г резорцина и 99 мл 52% раствора серной кислоты.

Для приготовления 30% раствора гидроксида натрия необходимо взять 30 г гидроксида натрия и 70 мл дистиллированной воды.

Для приготовления стандартного раствора глюкозы берут 10 мг глюкозы и растворяют их в 300 мл дистиллированной воды.

Осаждение и гидролиз гликогена в экстракте из органов и тканей пчел

Отфильтрованный экстракт из органов и тканей пчел помещали в центрифужную пробирку в количестве 0,3 мл и туда же вносили 0,2 мл дистиллированной воды и 0,2 мл 30% раствора гидроксида натрия. Затем пробирку помещали в водяную баню на 1,5-2 часа, после охлаждения в пробирку вносили 1 мл 96 об.% этилового спирта, суспендировали и охлаждали на льду в течение 15 минут, затем раствор центрифугировали при 3 тыс. об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость осторожно убирали пастеровской пипеткой, а в осадок добавляли 1 мл 96 об.% этилового спирта и охлаждали на льду в течение 15 минут, затем вновь центрифугировали при 3 тыс. об/мин в течение 15 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно убирали пастеровской пипеткой, а осадок перемешали с 3 мл дистиллированной водой, 13 мл 52% раствора серной кислоты (перемешивали) и 2 мл 1% резорцина.

В контрольную (чистую пробирку) пробирку и со стандартным раствором глюкозы наливали по 3 мл дистиллированной воды, по 13 мл 52% раствора серной кислоты (перемешивали) и по 2 мл 1% резорцина.

Все пробирки помещали в водяную баню при температуре 80°С в течение 20 минут, затем охлаждали на льду в течение 15 минут. Пробирки с наличием глюкозы имели коричнево-желтое окрашивание.

Фотоколориметрирование проводили против контроля на КФК-3 при подборе длины волны λ=315 нм.

Расчет содержания гликогена в экстракте из мышц проводят по формуле

где Г - количество гликогена, мг%; Е_о - экстинция опытной пробы; Е_ст - экстинция стандартного раствора.

Пример: у пчел серой горной кавказской породы

Е_о - экстинция опытной пробы составила 0,566

Е_ст - экстинция стандартного раствора составила 0,253

Таким образом, подставляя в формулу, получим следующий результат:

Таблица
Содержание гликогена в экстракте из органов и тканей пчелПороды пчелКоличество гликогена, мг %Итало-карпатская помесь первого поколения111,5Карпатская порода225,0Приокская375,0Серая горная кавказская224,0

На основании данных, приведенных в таблице, можно сделать вывод, что порода пчел “Приокская” обладает наибольшим энергетическим ресурсом по сравнению с другими породами пчел. Эта порода пчел обладает устойчивостью к неблагоприятным погодным условиям и обладает возможностью воспроизводства потомства с повышенным иммунитетом.

Способ относится к области ветеринарной медицины, в частности биохимии. Способ заключается в кипячении экстракта, охлаждении, центрифугировании, растворении осадка, охлаждении, центрифугировании, растворении осадка, добавлении в пробирку серной кислоты и 1% раствора конденсата, нагревании, охлаждении, фотометрировании против контроля при длине волны 315 нм, а в качестве конденсата используют резорцин. Данный способ позволяет повысить точность определения и является более экономичным. 1 табл.

Способ определения содержания гликогена в экстракте из органов и тканей пчел, включающий кипячение исследуемого субстрата в концентрированном растворе гидроксида натрия, охлаждение, центрифугирование, растворение осадка в растворе сернокислого натрия, охлаждение, центрифугирование, растворение осадка, одновременное добавление в пробирку с исследуемым биологическим субстратом, в контрольную пробирку с водой и в пробирку со стандартным раствором глюкозы 13 мл серной кислоты и 1% раствора конденсата с последующим нагреванием, охлаждением, фотометрированием против контроля и определение гликогена по формуле: Г=Е_о·_{100/Ест мг%, где Г - количество гликогена в мг%; Ео - экстинция опытной пробы; Ест - экстинция стандартного раствора, при этом для кипячения субстрата используют 30%-ный гидроксид натрия, охлаждают - по 15 мин, центрифугируют при 3 тыс. об./мин по 15 мин, добавляют в пробирки 2 мл 1% раствора конденсата, в качестве которого используют резорцин, и фотометрируют при длине волны 315 нм.}