КОНЦЕНТРАТ ПОБЕГОВ ЧЕРНИКИ И КОМПОЗИЦИИ НА ЕГО ОСНОВЕ, ОБЛАДАЮЩИЕ ГЕРОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2005 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в пищевых или фармацевтических композициях с комплексным геропротекторным действием, а именно обладающих антиоксидантной, нейропротекторной активностями и способностью регулировать кальциевый гомеостаз в клетке.

Согласно современным представлениям старение человека является результатом целого комплекса изменений в биохимическом статусе организма человека. Особое значение при этом придается процессам свободно-радикального окисления и дисрегуляции кальциевого гомеостаза в клетках, инициирующим развитие дегенеративных процессов, которые протекают в стареющем организме на фоне резкого ослабления естественных защитных систем, снижение уровня ростовых факторов и гормонов [Increasing healthy life span: convential measures and slowing the innate aging. Ann. N Y Acad. Sci. 2002, v. 959]. В настоящее время в мире ведется активная работа по поиску и внедрению в практику новых фармакологических препаратов, биологически активных веществ и просто пищевых добавок, действие которых направлено на компенсацию возникающего с возрастом дефицита эндогенных протекторных факторов. На мировом рынке существует огромный спрос на подобные препараты. Так, например, рынок препаратов для лечения и предупреждения старческих деменций (в т.ч болезни Альцгеймера) оценивается в 10 млр. долларов [National Institute on Aging, National Institutes Of Health. Progress Report on Alzheimer's Disease: Taking the Next Steps, Alzheimer's Disease. Education and Referral Center, Silver Spring, Maryland, 2002]. В последние годы особое значение и спрос приобретают геропротекторные препараты на основе растительных компонентов, обладающих более мягким действием на организм по сравнению с синтетическими препаратами. В частности, экстракты из растения Ginkgo biloba активно используются в качестве активного компонента лекарственных средств и многочисленных пищевых добавок, рекомендуемых для улучшения когнитивных функций и сопротивляемости организма в условиях нормального старения [McKenna DJ, Jones К, Hughes К. Efficacy, safety, and use of ginkgo biloba in clinical and preclinical applications. Altern Ther Health Med. 2001;7:70-86]. По общему объему продаж растительных препаратов в США в 1998 г. препараты Ginkgo занимали первое место [Agriculture Business Profile, Jun. 2001 (web.site:http//www.agric.gov.ab.ca/agdex/200/263_830-2.html)].

Однако достаточно высокая стоимость подобных импортных препаратов резко ограничивают возможности широкого их использования в отечественной профилактической и лечебной практике.

Известно, что в растениях имеются биологически активные вещества, т.н. фитоэстрогены, которые взаимодействуют с рецепторами эстрогенов человека. К ним относятся различные флавоноиды, например кверцитин, апигенин и кемпферол. Как установлено в последнее время, именно эти компоненты определяют спектр положительных эффектов экстрактов из Ginkgo biloba [Karyn M. Maclennan, Cynthia L. Darlington, Paul F. Smith. The CNS effects of Ginkgo biloba extracts and ginkgolide B. Progress in Neurobiology 67 (2002) 235-257; Krish Chandrasekaran, Zara Mehrabian, Brigitte Spinnewyn, Katy Drieu, Gary Fiskum. Neuroprotective effects of bilobalide, a component of the Ginkgo biloba extract (EGb 761), in gerbil global brain ischemia. Brain Research 922 (2001)282-292].

Однако это растение не произрастает на территории России и является продуктом импорта, а получение эффективного экстракта из листьев Ginkgo biloba представляет собой сложный, высокотехнологический и дорогой процесс.

Известно применение биологически активной пищевой добавки «Глутапирон» на основе динатриевой соли 2-(2,6-диметил-3,5-диэтоксикарбонил-1,4-дигидропиридин-4-карбоксамидо)глутаровой кислоты, обладающей антиканцерогенным и геропротекторным действием (RU, №2112512, С1, кл. А 61 К 31/44, 10.06.98, бюл. №16). Однако наиболее выражено оно проявляется при ликвидации радиационного воздействия на организм.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала средств, которые могут быть использованы в качестве биологически активных добавок в пищевых и фармацевтических композициях, обладающих широким биологическим действием, в частности геропротекторным.

Техническим результатом, который может быть получен при осуществлении изобретения, является расширенный спектр биологического действия на организм заявляемых нами веществ, а именно профилактика и защита организма человека от преждевременного старения и повышение его устойчивости к развитию нейродегенеративных заболеваний старческого возраста, в основе которых лежит комплексное нейропротекторное действие, а также антиоксидантной активности и способности регулировать кальциевый гомеостаз клетки.

Кроме того, надо отметить относительную дешевизну получаемых препаратов благодаря широкому распространению в нашей климатической зоне растений, составляющих их основу.

Согласно изобретению заявляются концентрат побегов черники и композиции на его основе, содержащие от 10 до 90 вес.% концентратов побегов черники с содержанием флавоноидных компонентов не менее 5%.

Черника издавна применялась в народной медицине как вяжущее, желудочно-кишечное средство в виде настоя или отвара ее плодов (Машковский М.Д., М.: «Медицина», 1977, т.1, стр.385. Большая энциклопедия народной медицины, М.: «Издательский дом АНС», 2003, стр.1075, Лекарственные средства, применяемые в медицинской практике. Под ред. М.А. Клюева, М.: Медицина, 1989, стр.460). Широко используются препараты на основе плодов черники в офтальмологии. Это такие препараты как Миртилене форте, Стрикс, Миртикам. В частности, антоцианозиды плодов черники способствуют регенерации родопсина, светочувствительного пигмента сетчатки, повышая таким образом чувствительность сетчатки к изменениям интенсивности света (Миронова Э.М., Ставицкая Т.В., Шормаз И.Н. КОФ, том 4, №2, 2003).

Использование концентратов побегов черники нами не обнаружено.

При создании настоящего изобретения было установлено, что концентраты побегов черники и композиции на его основе с содержанием флавоноидных компонентов не менее 5% обладают широким спектром активного биологического действия на организм и могут быть использованы в качестве средств с геропротекторной и нейропротекторной активностью в виде биологически активных добавок в пищевых и фармацевтических композициях, благодаря обнаруженным нами воздействию на процессы свободно-радикального окисления, способность стабилизировать кальциевый гомеостаз в клетках и нормализовать функционирование клеточных протекторных систем с действием на рецепторы эстрогенов, функциональная активность которых снижается с возрастом.

Понятие «концентрат», используемое в данной заявке, подразумевает (от латинского con... (cum) - вместе и centrum - средоточие, центр) продукт с высоким содержанием необходимых (в зависимости от его назначения) веществ (Украинский Советский Энциклопедический словарь в 3 т./ Редкол.: А.В.Кудринский и др., К., Глав. ред. УСЭ, 1988, т.2, стр.127). Понятие «экстракт», используемое в данной заявке, подразумевает (от латинского extractum - извлечение) сгущенную вытяжку из растительного материала (Украинский Советский Энциклопедический словарь в 3 т./ Редкол.: А.В.Кудринский и др., К., Глав. ред. УСЭ, 1988, т.3, стр.703). Получают с помощью растворителей (экстрагентов) - водных, спиртовых и т.д. Различают сухие экстракты (остаточная влажность не выше 5%, сгущенные экстракты - остаточная влажность 25% (Большая медицинская энцклопедия, гл. ред. А.Н.Бакулев, М.: «Советская энциклопедия», 1964, том 35, стр.60).

Концентраты указанных в заявке растений могут быть в жидкой форме или в твердой форме, например, гранулированной или порошкообразной.

Пригодные растительные концентраты получают, например, сушкой или сушкой вымораживанием свежесрезанных растений с последующим размалыванием и/или грануляцией высушенного материала, или путем отжима свежесрезанных растений и сбора жидкой фракции.

Пригодным методом получения концентратов заявляемых растений являются различные известные в данной области способы экстракции, например, экстрагированием свежесрезанных или высушенных растений водой либо одним или несколькими растворителями с пригодной для включения в пищу чистотой, или смесью воды с одним или несколькими растворителями с пригодной для включения в пищу чистотой. К пригодным растворителям с пригодной для включения в пищу чистотой относятся пропан, бутан, бутилацетат, этилацетат, этанол, диоксид углерода, ацетон, закись азота и пропан-2-ол или их смеси. Предпочтительными из них являются вода, этанол, диоксид углерода или их смеси. После стадии экстракции жидкую фазу необязательно концентрируют или сушат упариванием, или сушат вымораживанием. Кроме того, концентраты могут быть получены введением свежесрезанного или высушенного материала перечисленных растений в воду и отгонкой этой смеси водяным паром. Дистиллят собирают и предпочтительно концентрируют упариванием досуха. Для получения концентрата с заявляемыми характеристиками - содержанием флавоноидных компонентов не менее 5 вес.% - может быть объединено две или более стадии концентрации.

Содержание флавоноидных компонентов контролируется с помощью методики количественного определения суммы флавоноидов, применяемой в фармацевтической промышленности (Химический анализ лекарственных растений, под ред. Н.И.Гринкевич, Л.Н.Сафронич. М.: Высшая школа, 1983, стр.91-92). Количество используемого по изобретению концентрата и содержащих его композиций может изменятся в широких пределах в зависимости от подлежащего лечению пациента и его потребностей.

Понятие «геропротекторная активность», используемое в данной заявке, подразумевает биологически активное действие, замедляющее старение и продлевающее жизнь путем профилактики дегенеративных процессов, сопровождающих преждевременное старение, и улучшение качества жизни путем снижения количества и степени интенсивности патологий, совместимых с жизнью, характерных для пожилого и старческого возраста.

Понятие «композиция» подразумевает использование любой лекарственной или пищевой формы, содержащей концентрат побегов черники или композиций на его основе, которая могла бы найти профилактическое или лечебное применение в медицине в качестве средства с геропротекторной активностью для профилактики и предупреждения дегенеративных процессов, сопровождающих преждевременное старение.

Для получения композиций, отвечающих изобретению, предлагаемый концентрат побегов черники смешивается как активный ингредиент с фармацевтическим носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

В изобретении также заявляются композиции дополнительно содержащие концентрат по крайней мере одного из ряда растений: поручейник - Sium latifolium, щавель - Rumex acetosa, кровохлебка - Sanguisorba officinalis, репешок - Agrimonia asiatica, таволга вязолистная - Filipendula ulmaria, фаллопия - Fallopia convolvulus и/или их смеси, причем содержание этих компонентов составляет от 10 до 90 вес.%, а суммарное содержание флавоноидных компонентов составляет не менее 5%.

Композиция может дополнительно включать пригодные для включения в пищу компоненты, выбранные из группы, включающей витамины, минеральные компоненты, микроэлементы, клетчатку (в том числе и микрокристаллическую целлюлозу), корригенты, консерванты, красители, эмульгаторы, крахмал, карбонат кальция (мел), подслащивающие вещества (в том числе лактоза, сахароза, фруктоза) при сохранении эффективной дозы композиции.

Понятие «эффективная доза композиции», используемое в данной заявке, подразумевает использование того количества концентрата побегов черники или композиций на его основе, которое в соединении с его показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Любая композиция из вышеперечисленных может быть в жидкой форме или твердой форме, в частности в форме пилюль, таблеток, капсул и гранулятов.

На фиг.1 и 2 представлены данные о влиянии концентрата побегов черники на нейроны, где фиг.1 - влияние предварительной и последующей инкубации с веществами на токсичность глутамата (100 мкм) для нейронов мозжечка; фиг.2 - влияние предварительной и последующей инкубации с веществами на токсичность глутамата (100 мкм) в культуре нейронов коры мозга.

Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения и получением технического результата подтверждается, но не исчерпывается следующими примерами.

Пример 1. Получение концентрата побегов черники.

Получение экстрактов побегов черники проводилось на емкостном аппарате (объемом 5 л) с лопастной мешалкой, теплообменной рубашкой и встроенным фильтром. В емкостных аппаратах экстракция растительного сырья проводилась по методу мацерации. Соотношение твердой и жидкой фаз на всех стадиях экстракции равнялась 1:10, количество используемого экстрагента составило 3 л на каждую стадию экстракции. В качестве экстрагента брали воду или 40% раствор этилового спирта в количестве 3 л, который заливали в емкость экстрактора. В аппарат засыпали 300 г предварительно измельченного на роторно-ножевой мельнице растительного сырья 0,63-3 мм фракций, насыпной вес 316 кг/м³, закрывали крышкой и включали подачу теплоносителя, циркулирующего через рубашку аппарата, который подавался из предварительно разогретого до 75°С. Процесс экстракции осуществлялся при температуре 50±5°С. Далее экстракционную массу выдерживают 0,5 часа. В аппарат подают давление до 0,05 МПа и идет процесс фильтрования, при этом экстракт попадает в приемную емкость. Твердая фаза (сырье) остается на фильтрующей перегородке аппарата. Описанный процесс повторяется три раза. При проведении второй и третьей экстракций в аппарат загружается по 3 л дистиллированной воды. После третьей экстракции шрот (отработанное сырье) выгружается из аппарата.

Полученный экстракт объединялся, фильтровался и далее подвергался концентрированию под вакуумом. Экстракт из емкости последовательно порциями подается в испаритель вакуум-выпарной установки. Концентрированно экстрактов вели под вакуумом при температуре 45±2°С и при остаточном давлении 76-38 мм рт. ст. примерно до 1/13 первоначального объема. По окончании упарки получают водный концентрированный экстракт с плотностью 1,106 г/см³ и отгон воды. Отгон воды используется в дальнейшем на стадии экстракции, транспортируется из сборника конденсата на стадию экстракции насосом. Концентрированный экстракт направляют в мерник и далее на сепарацию и сушку.

Выход экстрактивных веществ составляет А) водная экстракция 18%, Б) экстракция 40% водно-спиртовым раствором 22,2%.

Определение суммы флавоноидов проводили согласно методике, применяемой в фармацевтической промышленности (Химический анализ лекарственных растений, под ред. Н.И.Гринкевич, Л.Н.Сафронич. М.: Высшая школа, 1983, стр.91-92).

1 г исследуемого экстракта помещают в пакетик из фильтровальной бумаги и экстрагируют в аппарате Сокслета (вместимостью 100 мл) хлороформом в течение 3 ч. Хлороформное извлечение отбрасывают, а пакетик с навеской высушивают и экстрагируют в круглодонной колбе с обратным холодильником на водяной бане 30 мл метилового спирта в течение 3 ч, периодически перемешивая. Берут 20 мл извлечения и метиловый спирт отгоняют досуха. Сухой остаток растворяют в 20 мл дистиллированной воды, количественно переносят в делительную воронку вместимостью 50 мл и очищают дважды по 15 мл четыреххлористым углеродом. Очищенный водный экстракт пятикратно обрабатывают 20 мл этилацетата, дожидаясь каждый раз полного расслоения фаз. Объединенный этилацетатный экстракт упаривают в вакууме досуха и сушат остаток в течение 1 ч в сушильном шкафу при t=65°С. Высушенный остаток растворяют в небольшом объеме этилового спирта и переносят количественно в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем до метки этиловым спиртом (раствор А), 0,5 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и объем доводят этиловым спиртом до метки (раствор Б).

Определяют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при λ=330 нм.

Процентное содержание суммы флавоноидов Х вычисляют по формуле

где D - оптическая плотность испытуемого раствора; 25 - объем раствора А, мл; К - коэффициент разведения раствора А, равный 100; - удельный показатель поглощения, равный 560,8; m - навеска сырья в расчете на взятый аликвот, г; w - потеря в массе сырья при высушивании (в %); L - толщина слоя, см.

Содержание флавоноидных компонентов составляло 23% и 21% соответственно.

Пример 2. Получение концентрата побегов черники.

Получение концентрата аналогично примеру 1, но применяется гидроимпульсный аппарат для экстракции. Выход экстрактивных веществ: А) водная экстракция - 19%; Б) экстракция 40% водно-спиртовым раствором - 23,3%. Время экстракции 1 час. Гидромодуль 1: 7. Амплитуда пульсации - 10 мм. Частота пульсации - 0,4 Гц. Процесс экстракции осуществлялся при температуре 50±5°С.

Содержание флавоноидных компонентов составляло 25% и 23% соответственно.

Пример 3. Получение концентрата побегов черники.

Получение концентрата аналогично примеру 1, но концентрирование проводится путем лиофилизации в лиофильной сушке.

Содержание флавоноидных компонентов составляло 23% и 21% соответственно.

Пример 4. Получение концентрата побегов черники.

Получение концентрата аналогично примеру 2, но концентрирование проводится путем лиофилизации в лиофильной сушке.

Содержание флавоноидных компонентов составляло 25% и 23% соответственно.

Пример 5. Получение концентрата побегов черники.

Получение концентрата аналогично примеру 1, но в качестве экстрагента применяется ацетон, этилацетат или пропан-2-ол. Выход экстрактивных веществ: А) экстракция ацетоном - 17,4%; Б) экстракция этилацетатом - 19,3%, С) экстракция пропанолом - 16,8%.

Пример 6. Получение концентрата побегов черники.

Получение концентрата аналогично примеру 1, но в качестве экстрагента применяется ацетон, этилацетат или пропан-2-ол и применяется гидроимпульсный аппарат для экстракции. Выход экстрактивных веществ: А) экстракция ацетоном - 19,4%; Б) экстракция этилацетатом - 20,3%, С) экстракция пропанолом - 18,6%. Время экстракции 1 час. Гидромодуль 1:7. Амплитуда пульсации - 10 мм. Частота пульсации - 0,4 Гц. Процесс экстракции осуществлялся при температуре 50±5°С.

Пример 7. Антиоксидантная активность концентрата побегов черники.

Исследование первичной антиоксидантной активности проводили с использованием так называемого FRAP assay, основанного на восстановлении ионов железа Fe³⁺ в Fe²⁺. В качестве стандарта использовали тимол. Измерения проводили при 505 нм. Для калибровки использовали водный раствор 1000 мкм/л Fe₂SO₄×7H₂O.

Таблица 1.
Антиоксидантная активность концентрата побегов черники.№Название концентрата% развития окраски1Водный концентрат черники - Vaccinium myrtillus, содержание флавоноидов - 25 вес.%32,12Водный концентрат черники - Vaccinium myrtillus, содержание флавоноидов - 5 об.%50,13Водный концентрат черники - Vaccinium myrtillus, содержание флавоноидов - 4 об.%59,34Водно-спиртовой концентрат черники Vaccinium myrtillus, содержание флавоноидов - 23 вес.%42,45Водно-спиртовой концентрат черники Vaccinium myrtillus, содержание флавоноидов - 5 вес.%52,36Водно-спиртовой концентрат черники Vaccinium myrtillus, содержание флавоноидов - 4 вес.%62,17Ацетоновый концентрат черники - Vaccinium myrtillus, содержание флавоноидов - 19 вес.%43,48Этилацетатный концентрат черники Vaccinium myrtillus, содержание флавоноидов - 20 вес.%41,89Пропаноловый концентрат черники Vaccinium myrtillus, содержание флавоноидов -18вес.%48,810Тимол56,8

Как видно из приведенной таблицы, исследуемые концентраты обладают выраженной антиоксидантной активностью, превосходящей активность стандарта - тимола. Причем при суммарном содержание флавоноидных компонентов менее 5% антиоксидантная активность ниже активности стандарта.

Влияние концентрата побегов черники на перекисное окисление липидов в митохондриях.

Ведущая роль в процессе запуска клеточной гибели принадлежит митохондриям и специфическому процессу изменения проницаемости внутренней мембраны митохондрий в результате открытия особых митохондриальных пор (ОМП). Старение организма сопровождается многочисленными нарушениями в функционировании митохондрий. В частности, с возрастом увеличивается чувствительность митохондрий как к факторам, вызывающим перекисное окисление липидов в митохондриях, так и к индукторам открытия ОМП.

Опыты проводились на препаратах изолированных митохондрий печени крыс в соответствии с методами, описанными в статье: «Шевцова Е.Ф., Киреева Е.Г., Бачурин С.О. Влияние фрагмента β-амилоидного пептида 25-35 на неселективную проницаемость митохондрий. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2001, т. 132 (12), стр.652-656».

Таблица 2.
Влияние концентрата черники на перекисное окисление липидов в митохондриях.№Название растенияIC50, мкг/мл1Черника Vaccinium myrtillus, содержание12 флавоноидных компонентов - 25 вес.% 2Черника Vaccinium myrtillus, содержание флавоноидных компонентов - 5,7 вес.%163Черника Vaccinium myrtillus, содержание флавоноидных компонентов - 4,1 вес.%224Кверцитин175Ginkgo biloba15

Достоверно показано, что концентрат побегов черники снижает образование веществ, взаимодействующих с тиобарбитуровой кислотой (что является показателем перекисного окисления липидов) в митохондриях печени крыс при инкубации их в стандартных условиях энергизации независимо от используемых субстратов дыхания (сукцинат/ротенон или глутумат/малат) как без индукторов открытия ОМП и перекисного окисления липидов (спонтанная активность или "старение митохондрий in vitro"), так и в присутствии трет-бутилгидроксипероксида, кальция и неорганического фосфата. Причем действие концентрата побегов черники более выражено и проявляется при меньшей действующей концентрации, чем у стандартного экстракта Ginkgo biloba.

Пример 8. Влияние концентрата побегов черники на кальциевый гомеостаз клетки.

Исследовали влияние концентрата побегов черники и Ginkgo biloba Egb 761 в качестве стандарта на захват ⁴⁵Са⁺² в синаптосомы коры мозга новорожденных крысят (9-10 дней) при стимуляции захвата 200 мМ глутаминовой кислотой. Синаптосомы выделяли по стандартной методике Хайоша (Hajos F., Brain Res., 1975, 93, №3, 485-489). Для аккумуляции радиоактивной метки Р₂-фракцию синаптосом суспендировали в инкубационном буфере А (мМ): NaCl 132, KCl 5, HEPES 5, рН 7,4. Синаптосомы инкубировали с исследуемым веществом 5 минут (37°С), затем захват ⁴⁵Са⁺² останавливали фильтрованием через фильтры GF/B (Whatman, Англия), промывая три раза холодным буферным раствором Б (145 мМ KCl, 10 мМ трис, 54 мМ трилон Б), и подсчитывали количество радиоактивной метки на сцинтилляционном счетчике. Количество захваченного ⁴⁵Ca⁺² в синаптосомы определяли как разницу между содержанием метки в синаптосомах при стимуляции глутаматом и без стимуляции глутаматом и выражали в процентах от контроля (контроль принимали за 100%).

Таблица 3.
Влияние концентрата черники (содержание флавоноидов 25%) на захват ⁴⁵Са⁺² в синаптосомы коры мозга крыс при стимуляции глутаматом (в % Са от контроля).Концентрация, мкг/мл0,512,55102550100200Концентрат черники-100,276,764,544,765,975,884,987,5Экстракт Ginkgo biloba Egb 76189,379,3-65,760,052,474,8138,7215,0

Показано, что концентрат побегов черники в концентрациях 1-200 мкг/мл ингибирует захват ⁴⁵Са⁺² в синаптосомы коры мозга крыс (максимальное ингибирование захвата 55,3±7,1% при концентрации 10 мкг/мл). IC₅₀=9,1 мкгр/мл. Показательным является действие концентрата побегов черники на кальциевый гомеостаз клетки в более низких концентрациях, чем экстракт Ginkgo biloba, и с большей эффективностью.

Пример 9. Нейропротекторное действия концентрата побегов черники на нейроны в условиях повышенной концентрации глутамата в среде.

Глутамат является возбуждающим нейромедиатором в мозге, играющем важную роль в процессах обучения и памяти. Однако при избытке глутамат может проявлять нейротоксические свойства и вызывать дегенерацию нейронов. Предполагается, что нейротоксическое действие глутамата может играть определенную роль в возрастных изменениях мозга и в патогенезе нейродегенеративных заболеваний. В ряде исследований показано протекторное действие растительных экстрактов, особенно Ginkgo biloba, а также некоторых индивидуальных его компонентов (кверцетин) против глутаматной токсичности в модельных экспериментах на культуре клеток, в том числе и в единичных работах на культивируемых нейронах.

Нейроны клетки-зерна мозжечка (КЗМ) получали из мозга крыс 7-8 дневного возраста способом трипсинизации с последующим пипетированием [Schousboe A. et al., 1989; Лермонтова и др., 2001].

Нейроны коры получали из мозга 1-2-дневных крыс способом трипсинизации с последующим пипетированием и центрифугированием, основанном на ранее описанных методиках.

Суспендированные в культуральной среде клетки вносили по 1 мл в лунки 24-луночного планшета ("Corning"), предварительно покрытые полилизином. Концентрация клеток была 2,5×10⁶-5×10⁶ кл/мл. Культуральная среда состояла из смеси минимальной среды Игла и модифицированной по Хэму среды Дюльбекко F12 (1:1), дополненной 10% телячьей сыворотки, глютамином (2 мМ), антибиотиками, глюкозой (15 мМ) и KCl до 25 мМ, рН среды доводили до 7-7,2 NaHCO₃. Все компоненты сред фирмы Sigma. Планшеты с культурами помещали в СО₂-инкубатор при 37°С и 100% влажности. Через день 80% культуральной среды заменяли на аналогичную свежую с Supplement N1, но без сыворотки и с добавлением цитозинарабинозида для подавления деления не-нейрональных клеток. Через 8-11 дней после созревания нейронов и их соответствующих рецепторов культуры подвергали воздействию 100 мкМ глутамата и исследуемых веществ совместно или с предварительной инкубацией с веществами. Перед инкубацией с глутаматом среду культивирования заменяли на минимальную среду Игла (без фенолового красного), дополненную 10 мМ HEPES, глюкозой, антибиотиками, рН 7,4-7,5, и выдерживали культуры 30-40 мин в CO₂-инкубаторе перед прикапыванием исследуемых веществ или совместно с ними. Затем добавляли глутамат и исследуемые вещества, если их еще не было. Инкубацию с глутаматом проводили 30 мин при комнатной температуре. Затем среду заменяли на стандартную среду культивирования с соответствующими исследуемыми веществами и культуры помещали в инкубатор на 18-20 час. Состояние клеток в культуре оценивали ежедневно с помощью фазово-контрастного инвертированного микроскопа Aksiovert с видеоводом изображения на монитор компьютера с программным обеспечением, позволяющим сравнивать фото полей культивируемых нейронов, получаемые в разное время эксперимента. Культуры фотографировали до эксперимента и сравнивали с фотографиями соответствующих полей зрения после эксперимента по количеству выживших нейронов. Для каждой концентрации вещества подсчитывали клетки на 3 полях зрения в 2-4 культурах до и через 18-20 часов после воздействия.

Инкубация с концентратом побегов черники (содержание флавоноидных компонентов - 25%) до прикапывания глутамата, во время инкубации с глутаматом и после ее, выявило более достоверно протекторные свойства концентрата побегов черники. Показано также защитное действие флавоноидного компонента концентрата побегов черники - кверцетина (фиг.1). На культуре нейронов коры мозга, на которых больше рецепторов к глутамату по сравнению с нейронами мозжечка, действие глутамата было более выражено и протекторные свойства концентрата побегов черники и кверцетина проявились более очевидно (фиг.2). Специфический ингибитор глутаматных рецепторов NMDA-типа МК-801 в условиях нашего эксперимента защищал нейроны практически на 100%, у концентрата побегов черники защитные свойства также хорошо выражены (фиг.2). Известный механизм действия растительных экстрактов - их антиоксидантные свойства. Необходимость предварительной инкубации для проявления нейропротекторного действия, наряду с антиоксидантными свойствами, может свидетельствовать о более специфическом действии кверцетина и компонентов концентрата побегов черники на глутаматную нейротоксичность, например, через действие на глутаматные рецепторы. Из анализа полученных результатов следует, что концентрат побегов черники и флавоноидный компонент концентрата побегов черники кверцетин проявляют выраженные нейропротекторные свойства и препятствуют дегенерации нейронов.

Пример 10. Получение экстрактов растений.

Получение экстрактов растений: поручейник, щавель, кровохлебка, репешок, таволга вязолистная, фаллопия, проводилось, как описано в примере 1.

Выход экстрактов представлен в таблице 4.

Таблица 4.
Выход экстрактивных веществ.Название растенияВыход экстрактивных веществ (%)водная экстракцияэкстракция 40% водно-спиртовым растворомSium latifolium12,18,8Agrimonia eupatoria20,226,8Filipendula ulmaria16,422,4Fallopia convolvulus15,220,1Rumex acetosa16,216,6Sanguisorba officinalis21,124,2

Определение суммы флавоноидов проводили, как описано в примере 1а), согласно методике, применяемой в фармацевтической промышленности (Химический анализ лекарственных растений, под ред. Н.И.Гринкевич, Л.Н.Сафронич. М.: Высшая школа, 1983, стр.91-92).

Содержание флавоноидных компонентов представлено в таблице 5.

Таблица 5.
Содержание флавоноидных компонентов в экстрактах растений.Название растенияСодержание флавоноидных компонентов (%)водная экстракцияэкстракция 40% водно-спиртовым растворомSium latifolium15,412,5Agrimonia eupatoria24,423,6Filipendula ulmaria19,821,4Fallopia convolvulus23,121,2Rumex acetosa28,227,9Sanguisorba officinalis22,123,6

Пример 11. Получение экстрактов растений.

а) 300 г предварительно измельченного на роторно-ножевой мельнице растительного сырья 0,63-3 мм фракций, насыпной вес 316 кг/м³, засыпали в сушильный шкаф с принудительной вентиляцией. Сушку и концентрирование проводили при 45°С при постоянном обдуве воздухом той же температуры.

б) 300 г предварительно измельченного на роторно-ножевой мельнице растительного сырья 0,63-3 мм фракций, насыпной вес 316 кг/м³, засыпали в лиофильную сушку. Сырье замораживали до температуры -25°С, затем включали форвакуумный насос. При достижении вакуума 10^-5 МПа включали подогрев тарелок лиофильной сушки, температура 30°С. Сушку и концентрирование вели до достижения температуры образца 30°С.

Таблица 6.
Содержание флавоноидов (%) в высушенном и вымороженном концентрате растений.Название растенияВысушенный концентратВымороженный концентратпоручейник7,88,8репешок6,47,2таволга вязолистная7,48,3фаллопия7,78,1щавель8,19,2кровохлебка6,26,8

Пример 12. Получение экстрактов растений.

Получение экстрактов растений: поручейник, щавель, кровохлебка, репешок, таволга вязолистная, фаллопия, проводилось, как описано в примере 1, но в качестве экстрагента применяется ацетон, этилацетат или пропан-2-ол. Выход экстрактов представлен в таблице 7.

Таблица 7.
Выход экстрактивных веществ.Название растенияВыход экстрактивных веществ (%)экстракция ацетономэкстракция этилацетатомэкстракция пропаноломSium latifolium11,27,99,9Agrimonia eupatoria18,425,124,7Filipendula ulmaria17,319,723,4Fallopia convolvulus16,121,219,1Rumex acetosa18,415,917,8Sanguisorba officinalis22,223,125,6

Определение суммы флавоноидов проводили, как описано в примере 1а), согласно методике, применяемой в фармацевтической промышленности (Химический анализ лекарственных растений, под ред. Н.И.Гринкевич, Л.Н.Сафронич. М., Высшая школа, 1983, стр.91-92).

Содержание флавоноидных компонентов представлено в таблице 8.

Таблица 8.
Содержание флавоноидных компонентов в экстрактах растений.Название растенияСодержание флавоноидных компонентов (%)экстракция ацетономэкстракция этилацетатомэкстракция пропаноломSium latifolium13,513,413,6Agrimonia eupatoria22,121,922,9Filipendula ulmaria17,920,121,1Fallopia convolvulus22,522,220,2Rumex acetosa27,429,128,8Sanguisorba officinalis20,720,122,8

Пример 13. Антиоксидантная активность композиций на основе концентрата черники и экстрактов растений: поручейник, щавель, кровохлебка, репешок, таволга вязолистная, фаллопия.

Исследование первичной антиоксидантной активности проводили с использованием так называемого FRAP assay, основанного на восстановлении ионов железа Fe³⁺ в Fe²⁺. В качестве стандарта использовали тимол. Измерения проводили при 505 нм. Для калибровки использовали водный раствор 1000 мкм/л Fe₂SO₄×7H₂O.

Таблица 9.
Антиоксидантная активность композиций на основе концентрата черники.№Состав композиции% развития окраски1концентрат черники - 90 вес.%
экстракт поручейника - 10 вес.%42,32концентрат черники - 50 вес.%
экстракт поручейника - 50 вес.%44,73концентрат черники - 90 вес.%
экстракт репешка - 10 вес.%36,24концентрат черники - 50 вес.%
экстракт репешка - 50 вес.%31,15концентрат черники - 90 вес.%
экстракт таволги - 10 вес.%41,46концентрат черники - 50 вес.%
экстракт таволги - 50 вес.%41,17концентрат черники - 90 вес.%
экстракт фаллопии - 10 вес.%40,18концентрат черники - 50 вес.%
экстракт фаллопии - 50 вес.%47,39концентрат черники - 90 вес.%
экстракт щавеля - 10 вес.%39,510концентрат черники - 50 вес.%
экстракт щавеля - 50 вес.%41,211концентрат черники - 90 вес.%
экстракт кровохлебки - 10 вес.%44,612концентрат черники - 50 вес.% экстракт кровохлебки - 50 вес.%41,213концентрат черники - 60 вес.%
экстракт поручейника - 10 вес.%
микрокристаллическая целлюлоза - 30 вес.%47,414концентрат черники - 60 вес.%
экстракт репешка - 10 вес.%
микрокристаллическая целлюлоза - 30 вес.%39,815концентрат черники - 60 вес.% экстракт таволги - 10 вес.% микрокристаллическая целлюлоза - 30 вес.%48,316концентрат черники - 60 вес.%
экстракт фаллопии - 10 вес.%
микрокристаллическая целлюлоза - 30 вес.%45,617концентрат черники - 60 вес.%
экстракт щавеля - 10 вес.%
микрокристаллическая целлюлоза - 30 вес.%42,418концентрат черники - 60 вес.%
экстракт кровохлебки - 10 вес.%
микрокристаллическая целлюлоза - 30 вес.%47,819концентрат черники - 60 вес.%
экстракт поручейника - 10 вес.%
карбонат кальция (мел) - 30 вес.%49,320концентрат черники - 60 вес.%
экстракт репешка - 10 вес.%
карбонат кальция (мел) - 30 вес.%41,821концентрат черники - 60 вес.%
экстракт таволги - 10 вес.%
карбонат кальция (мел) - 30 вес.%47,622концентрат черники - 60 вес.%
экстракт фаллопии - 10 вес.%
карбонат кальция (мел) - 30 вес.%44,823концентрат черники - 60 вес.%
экстракт щавеля - 10 вес.%
карбонат кальция (мел) - 30 вес.%41.724концентрат черники - 60 вес.%
экстракт кровохлебки - 10 вес.%
карбонат кальция (мел) - 30 вес.%48,725тимол56,8

Как видно из приведенной таблицы, исследуемые композиции на основе концентрата черники обладают выраженной антиоксидантной активностью, превосходящей активность стандарта - тимола.

Влияние композиций на основе концентрата черники на перекисное окисление липидов в митохондриях.

Опыты проводились на препаратах изолированных митохондрий печени крыс в соответствии с методами, описанными в статье: «Шевцова Е.Ф., Киреева Е.Г., Бачурин С.О. Влияние фрагмента β-амилоидного пептида 25-35 на неселективную проницаемость митохондрий. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2001, т. 132 (12), стр.652-656.»

Таблица 10.
Влияние композиций на основе концентрата черники на перекисное окисление липидов в митохондриях.№Состав композицииIC50, мкг/мл1концентрат черники - 90 вес.%
экстракт поручейника - 10 вес.%282концентрат черники - 90 вес.%
экстракт репешка - 10 вес.%25,83концентрат черники - 90 вес.%
экстракт таволги - 10 вес.%384концентрат черники - 90 вес.%
экстракт фаллопии - 10 вес.%44,75концентрат черники - 90 вес.%
экстракт щавеля - 10 вес.%706концентрат черники - 90 вес.%
экстракт кровохлебки - 10 вес.%>507концентрат черники - 60 вес.%
экстракт поручейника- 10 вес.%
микрокристаллическая целлюлоза - 30 вес.%328концентрат черники - 60 вес.%
экстракт репешка - 10 вес.%
микрокристаллическая целлюлоза - 30 вес.%279концентрат черники - 60 вес.%
экстракт таволги - 10 вес.%
микрокристаллическая целлюлоза - 30 вес.%4010концентрат черники - 60 вес.%
экстракт фаллопии - 10 вес.%
микрокристаллическая целлюлоза - 30 вес.%4511концентрат черники - 60 вес.%
экстракт щавеля - 10 вес.%65 микрокристаллическая целлюлоза - 30 вес.% 12концентрат черники - 60 вес.%
экстракт кровохлебки - 10 вес.%
микрокристаллическая целлюлоза - 30 вес.%5113Кверцитин1714Ginkgo biloba15

Как видно из приведенной таблицы, исследуемые композиции на основе концентрата черники обладают выраженной антиоксидантной активностью. Достоверно показано, что экстракты исследуемых растений снижают образование веществ, взаимодействующих с тиобарбитуровой кислотой (что является показателем перекисного окисления липидов) в митохондриях печени крыс при инкубации их в стандартных условиях энергизации и могут рассматриваться как активные антиоксиданты перекисного окисления липидов в митохондриях.

Таким образом, проведенные исследования показали, что концентраты побегов черники и композиции на его основе с содержанием флавоноидных компонентов не менее 5% и вышеуказанным составом обладают широким спектром активного биологического действия на организм и могут быть использованы в качестве средств с геропротекторной и нейропротекторной активностью в виде биологически активных добавок в пищевых и фармацевтических композициях, благодаря обнаруженным нами воздействию на процессы свободно-радикального окисления, способность стабилизировать кальциевый гомеостаз в клетках и нормализовать функционирование клеточных протекторных систем с действием на рецепторы эстрогенов, функциональная активность которых снижается с возрастом, активно защищая нейроны головного мозга от дегенеративных процессов.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к производству композиций с комплексным геропротекторным действием. Концентрат побегов черники (Vaccinium myrtillus) содержит флавоноиды в количестве не менее 5 вес.% и обладает геропротекторной активностью. Композиция, обладающая геропротекторной активностью, содержит концентрат побегов черники в количестве от 10 до 90 вес.% и фармацевтически приемлемый носитель. Композиция дополнительно содержит концентрат по крайней мере одного из растений, выбранных из ряда: поручейник (Sium latifolium), щавель (Rumex acetosa), кровохлебка (Sanguisorba officinalis), репешок (Agrimonia asiatica), таволга вязолистная (Filipendula ulmaria), фаллопия (Fallopia convolvulus) и/или их смеси, причем содержание этих компонентов составляет от 10 до 90 вес.%. Композиция может быть выполнена в жидкой форме, в форме пилюль, таблеток, капсул, гранул. Композиции воздействуют на процессы свободно-радикального окисления, стабилизируют кальциевый гомеостаз в клетках и нормализуют функционирование клеточных протекторных систем с действием на рецепторы эстрогенов, активно защищают нейроны головного мозга от дегенеративных процессов. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 10 табл., 2 ил.

1. Концентрат побегов черники (Vaccinium myrtillus), содержащий флавоноиды в количестве не менее 5 вес.% и обладающий геропротекторной активностью.2. Композиция, обладающая геропротекторной активностью, характеризующаяся тем, что она содержит концентрат по п.1 в количестве 10-90 вес.% и фармацевтически приемлемый носитель.3. Композиция по п.2, дополнительно содержит концентрат по крайней мере одного из растений, выбранных из ряда - поручейник (Sium latifolium), щавель (Rumex acetosa), кровохлебка (Sanguisorba officinalis), репешок (Agrimonia asiatica), таволга вязолистная (Filipendula ulmaria), фаллопия (Fallopia convolvulus) и/или их смеси, причем содержание этих компонентов составляет 10-90 вес.%.4. Композиция по пп.2 и 3, выполненная в жидкой форме, в форме пилюль, таблеток, капсул, гранул.