СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СУХОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БИФИДО- И/ИЛИ ЛАКТОБАКТЕРИЙ И ПРЕПАРАТ, ИЗГОТОВЛЕННЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к получению сухих препаратов на основе бифидо- и/или лактобактерий для перорального применения, обладающих иммуномодулирующей и противовирусной активностью, и может быть использована для неспецифической профилактики инфекционных заболеваний, связанных с нарушениями в иммунокомпетентных зонах кишечника и печени, способствующих вследствие этого развитию дисбактериозов.

Известные технические решения, относящиеся к способам изготовления сухих препаратов на основе бифидо- и/или лактобактерий, как правило, предусматривают приготовление питательной среды и инокулята, заквашивание среды, наращивание клеток, получение бактериальной массы, смешивание с защитной средой, розлив во флаконы или в лотки, замораживание, сушку.

В соответствии с патентом RU 2129794 в качестве инокулята для заквашивания питательных сред используют активированную культуру Bifidobacterium longum В 379 М третьей генерации в количестве 1-5%. Для получения сухого препарата в виде сухой закваски в качестве питательной среды используют обезжиренное или цельное молоко, при этом количество инокулята составляет 1-2%. Для получения сухого препарата в виде бактериального концентрата используют питательную среду на основе молочной сыворотки, при этом количество инокулята составляет 3-5%. Это позволяет повысить биохимическую активность бифидобактерий и создать сухой препарат, активно ферментирующий молоко и пищевые среды без добавления ростовых веществ.

В соответствии с заявкой RU 95118767 известен способ приготовления сухого лактобактерина ацидофильного препарата, предусматривающий приготовление питательной среды, засев и выращивание биомассы дактобацилл, смешивание биомассы с подготовленными компонентами защитной среды, розлив, замораживание до температуры (-35)-(-38°)С в течение 10-14 ч, закалку путем выдержки при той же температуре в течение 5-7 ч и сублимационную сушку при постепенном нагреве до 0°С в течение 35-40 ч, после чего проводят дальнейшее повышение температуры до 30-35°С в течение 5-6 ч с выдержкой при той же температуре в течение 10-14 ч.

Наиболее близким способом к предложенному является способ изготовления сухих препаратов на основе бифидо- и/или лактобактерий, включающий выращивание биомассы бактерий В.bifidum, получение концентрированной биомассы, добавление защитной среды высушивания; лиофилизацию замороженного продукта, смешивание с предварительно простерилизованным наполнителем, который выполняет одновременно роль защитного вещества и источника энергии для роста бактерий, в качестве которого используют лактозу, и фасовку смеси в жесткие разъемные желатиновые капсулы с последующим их размещением в герметичную упаковку и получением конечного продукта со степенью активности бифидобактерий на уровне не менее 2·10⁸. Соответственно в данном патенте также раскрывается препарат, полученный данным способом (RU 2123343).

К недостаткам всех описанных технических решений относится низкая производительность всех описанных способов, а также низкая активность получаемых при их использовании продуктов.

Задачей изобретения является быстрое и экономичное и получение продукта с более высокой активностью и стабильностью, который может непосредственно использоваться в пищевой промышленности для заквасок, например для йогуртов и т.п.

Технический результат изобретения заключается в повышении активности и стабильности получаемого сухого препарата на основе бифидо- и/или лактобактерий.

Технический результат достигается тем, что в способе получения сухого препарата на основе бифидо- и/или лактобактерий, включающем выращивание биомассы бифидо- и/или лактобактерий, смешение жидкой культуры бифидо- и/или лактобактерий с наполнителем, в качестве которого используют гуммиарабик и олигосахариды, при температуре 8-16°С с образованием суспензии, а получение препарата осуществляют путем распылительной сушки упомянутой суспензии с образованием микрокапсул.

В частных воплощениях изобретения сушку проводят при температуре 60-80°С.

Кроме того, препарат получают в виде микрокапсул с размером от 30 до 50 мкм.

Предпочтительно после смешения суспензии осуществить ее диспергирование для ускорения ее смешивания.

Желательно также проведение фасовки препарата в жесткие желатиновые капсулы.

Дополнительно в качестве наполнителя можно вводить гидроксиаппатит кальция и/или лактозу.

Технический результат также достигается тем, что сухой препарат на основе бифидо- и/или лактобактерий содержит наполнитель и сухую культуру бифидо- и/или лактобактерий, при этом в качестве наполнителя он содержит гуммиарабик и олигосахариды при следующем содержании компонентов, мас.%:

Гуммиарабик5-35Олигосахариды5-50Сухая культуры бифидо- и /или лактобактерийОстальное

Кроме того, препарат может дополнительно содержать гидроксиаппатит кальция в количестве до 5 мас.% сверх 100% и/или лактозу до 85 мас.% сверх 100%.

Препарат может быть заключен в твердую желатиновую капсулу.

Сущность предложенных технических решений состоит в следующем.

Для того чтобы препараты - эубиотики - могли успешно выполнить свое назначение и обеспечить эффективный рост колоний в кишечнике, необходимо сочетание целого ряда благоприятных факторов и условий, которые необходимо учитывать при разработке и производстве препаратов на их основе.

Будучи облигатно-анаэробными бактериями бифидо-лактобактерии не растут в атмосфере, содержащей кислород, нуждаются в источнике углерода (различные углеводы, углекислый газ), витаминов, пуриновых и пиримидиновых остатков.

В качестве исходного сырья служила жидкая культура лактобактерий (ЖКЛ) и жидкая культура бифидобактерий (ЖКБ), выращенных на обрате (обезжиренном коровьем молоке).

В таблице 1 приведена характеристика сырья бактерий.

Таблица 1№п/пОбразецВнешний видУпаковкаСодержание бифидо- (ацидо) бактерий, колонииСухой остаток1Жидкая культура бифидобактерий ЖКБМутная жидкость, коричневого цвета с осадкомФлакон 1000 млБолее 10¹¹ КОЕ /1 г8,0%2Жидкая культура лактобактерий ЖКЛМутная жидкость, коричневого цвета с осадкомФлакон 1000 млболее 10¹¹ КОЕ /1 г8,3%

Гуммиарабик - смола Акации Сенегал, натуральный полисахарид, классифицируется как комплексный арабиногалактан, с высокими эмульгирующими свойствами. В предлагаемом изобретении можно использовать гуммиарабик с фирменным названием (CNI) Fibrigum - белый порошок без запаха, хорошо растворим в воде и нейтральный по вкусу. Также может использоваться гуммиарабик марки Instantgum 40830 или другой марки. Это натуральное растворимое в воде волокно, не усваиваемое верхними отделами желудочно-кишечного тракта человека, в кишечнике полностью ферментируется бактериями, является субстратом для ацидо-бифидобактерий. В процессе ферментации гуммиарабик вырабатывает органические кислоты (короткоцепочные жирные кислоты), которые окисляют содержимое толстой кишки, снижение рН подавляет размножение гнилостных и патогенных бактерий. Помимо этого короткоцепочные жирные кислоты обладают целым рядом других биологических эффектов, таких как стимуляция абсорбции воды и минералов, увеличение кишечной моторики или стимуляции механизма удаления поврежденных клеток.

Стимулируя микробную сахаролитическую активность и окисляя содержимое ободочной кишки, гуммиарабик стимулирует процесс бактериальной детоксикации и снижает производство токсинов и веществ, являющихся потенциально канцерогенными. Гуммиарабик улучшает моторику желудочно-кишечного тракта человека за счет эффекта увеличения биомассы. Насыщенная водой биомасса выводится со стулом, который становится мягче, периодичность его выведения учащается, ферментация его проходит медленно и формирует очень мало газов.

В таблице 2 приведена краткая характеристика олигосахаридов, использующихся в настоящем изобретении.

Фрукто-олигосахариды (ФОС)- это короткоцепочные полисахариды, являются необходимым питательным субстратом (источником углерода), улучшающие рост сапрофитной микрофлоры, подавляя рост патогенных микроорганизмов. Кроме того, ФОС улучшают синтез жирных кислот с короткой цепочкой (бутираты), нормализуют функцию печени, снижают уровень холестерина в плазме, улучшают элиминацию токсических соединений (Gibson G.R. et. Al., 1995).

Рекомендуемая доза для очищенных ФОС - 2000-3000 мг в сутки. Естественными пищевыми источниками ФОС являются иерусалимский артишок, репчатый лук, спаржа и чеснок. Однако рассчитанное количество ФОС, потребляемое с этими источниками, составляет около 800 мг. Таким образом, обогащение продуктов питания, БАДов ФОС могут восполнить требуемое количество.

Способствует размножению нормальной микрофлоры кишечника лактулоза (Нормазе) - полусинтетический дисахарид, состоящий из галактозы и фруктозы, который не расщепляется в кишечнике, поскольку у человека отсутствует лактулаза - фермент, необходимый для расщепления лактулозы, и в неизменном виде достигает поперечно-ободочной кишки.

Продукты с эубиотиками способствуют расщеплению лактулозы в кишечнике, с образованием основных метаболитов:

низкомолекулярных жирных кислот (молочной, уксусной, масляной и пропионовой), водорода, диоксида углерода. Результатом этого является сдвиг рН кишечного содержимого в кислую сторону и усиление перистальтики. Кроме того, лактулоза, расщепляясь в толстой кишке, высвобождает ионы водорода, связывает свободный аммиак, уменьшает образование токсических азотсодержащих веществ в проксимальном отделе толстого кишечника и их абсорбцию, увеличивает диффузию аммиака из крови в кишечник и соответственно его выведение из организма. Оказывает слабительное действие, ускоряя тем самым выведение токсинов.

Таблица 2№ОлигосахараЭффект1ФОС - фруктоолигосахараРост бифидобактерий, пропионовой кислоты, масляной, увеличение галактозидазной активности2ГалактоолигосахараИндуцируют гидролиз субстрата, увеличение с секрецией водорода, молочной кислоты, активирует гидролазы3ТрансгалактоолигосахаридаУменьшение в крови холестерола4ИнулинУвеличение микробиологической массы. Подавление рака, снижение холестерола в крови, стимуляция иммунной системы, повышение синтеза витаминов усвоение азота5ЛактулозаБаланс кишечной микроэкологии, нормализация транзита кишечного содержимого, увеличение лактобифидобактерий

В основе предложенного способа лежит процесс микрокапсулирования - процесс заключения в оболочку из гуммиарабика бифидо-ацидобактерий, заключенных в твердую матрицу из олигосахаридов, сухих веществ молока, получение микрокапсул сферической формы, размером 30-50 мкм.

В качестве примера приводятся 2 варианта - с добавление 5% и 10% гуммиарабика. Метод распыления основан на механическом нанесении оболочки гуммиарабика на бифидо-лактобактерии.

Пример 1. Приготовление микрокапсулированного препарата бифидобактерий с добавлением 5% гуммиарабика.

Процесс проводили в реакторе, снабженном рубашкой, мешалкой и диспергатором, при температуре 8-16°С.

8.35 кг жидкой культуры бифидобактерий (сухой культуры 0.668 кг) смешивали в реакторе с работающей мешалкой с 0.0334 кг гуммиарабика Fibrigum (5% по отношению к сухой культуре) и 0.167 кг (25% по отношению к сухой культуре) олигосахарида-мальтодекстрина. Полученная суспензия перемешивалась в течение 15 мин, диспергировалась в диспергаторе в течение 5 мин и высушивалась на распылительной сушилке при температуре 68-72°С. Было получено 0.85 кг сухого микрокапсулированного препарата бифидобактерий (Бифидогум).

Полученный порошок фасовался в твердые желатиновые капсулы.

Пример 2. Приготовление микрокапсулированного препарата бифидобактерий с добавлением 10% гуммиарабика:

Процесс проводили в реакторе, снабженном рубашкой, мешалкой и диспергатором, при температуре 8-16°С.

7.71 кг жидкой культуры бифидобактерий (сухой культуры 0.6168 кг) смешивали в реакторе с работающей мешалкой с 0.06168 кг гуммиарабика «Instantgum 40830» (10% по отношению к сухой культуре) и 0.1542 кг (25% по отношению к сухой культуре) олигосахарида-мальтодекстрина. Полученная суспензия перемешивалась в течение 15 мин, диспергировалась в диспергаторе в течение 5 мин и высушивалась на распылительной сушилке при температуре 68-72°С. Было получено 0.82 кг сухого микрокапсулированного препарата бифидобактерий (Бифидогум).

Полученный препарат фосовался в двойные полиэтиленовые пакеты.

Также приводятся примеры получения сухим микрокапсулированным препаратом лактобактерий (лактогум)

Пример 3. Приготовление микрокапсулированного препарата лактобактерий с добавлением 5% гуммиарабика:

Процесс проводили в реакторе, снабженном рубашкой, мешалкой и диспергатором, при температуре 8-16°С.

8.0 кг жидкой культуры лактобактерий (сухой культуры 0.640 кг) смешивали в реакторе с работающей мешалкой с 0.032 кг гуммиарабика «Instantgum 40830» (5% по отношению к сухой культуре) и 0.16 кг (25% по отношению к сухой культуре) олигосахарида-мальтодекстрина. Полученная суспензия перемешивалась в течение 15 мин, диспергировалась в диспергаторе в течение 5 мин и высушивалась на распылительной сушилке при температуре 68-72°С. Было получено 0.76 кг сухого микрокапсулированного препарата лактобактерий (Лактогум).

Полученный порошок фасовался в твердые желатиновые капсулы.

Пример 4. Приготовление микрокапсулированного препарата лактобактерий с добавлением 10% гуммиарабика:

Процесс проводили в реакторе, снабженном рубашкой, мешалкой и диспергатором, при температуре 8-16°С.

7.5 кг жидкой культуры лактобактерий (сухой культуры 0.6 кг) смешивали в реакторе с работающей мешалкой с 0.06 кг гуммиарабика Fibrigum (10% по отношению к сухой культуре) и 0.15 кг (25% по отношению к сухой культуре) олигосахарида-мальтодекстрина. Полученная суспензия перемешивалась в течение 15 мин, диспергировалась в диспергаторе в течение 5 мин и высушивалась на распылительной сушилке при температуре 68-72°С. Было получено 0.82 кг сухого микрокапсулированного препарата лактобактерий (Лактогум).

Полученный порошок фасовался в двойные полиэтиленовые пакеты.

В таблице 3 приведена характеристика полученного продукта.

Таблица 3№ОбразецВнешний видСыпучесть гр/секСодержание бифидо- (ацидо) бактериий, колонииВлажность, %1Бифидогум (5% гуммиарабика)порошок светло-коричневого цвета, липкий, однородный, гигроскопичный50/20более 10¹¹ КОЕ/1 г7,72Лактогум (5% гуммиарабика)порошок светло-коричневого цвета, липкий, однородный, гигроскопичный, легко комкуется50/325,9 10⁹ КОЕ/1 г4,943Бифидогум (10% гуммиарабика)порошок светло-коричневого цвета, липкий, однородный, гигроскопичный50/22более 10¹⁰ КОЕ/1 г9,044Лактогум (10% гуммиарабика)порошок светло-коричневого цвета, липкий, однородный, гигроскопичный50/32Более 10¹⁰ КОЕ /1 г9,0

С целью определения влияния рН 3,0 на сохранность микрокапсул Бифидогума и Лактогума в среде желудка были проведены опыты нахождения бифидо- лактобактерий в кислой среде желудка, с экспозицией 10, 20, 30 мин. Результаты, подтверждающие высокую стабильность заявляемых продуктов в сравнении с жидкими культурами Бифидумбактерином (ЖКБ) и Лактобактерином (ЖКЛ) (производства «Био-Веста»), приведены в таблице 4.

Таблица 4 ОбъектрНВремя экспозиции, минСодержание бактерий, КОЕ/1 г1.Жидкая культура Бифидобактерий (ЖКБ)3,0010¹⁰2.Бифидогум (5% гуммиарабик + 25% олигосахара)3,0010¹¹3.Жидкая культура Бифидобактерий (ЖКБ)3,01010⁹4.Бифидогум (5% гуммиарабик + 25% олигосахара)3,01010¹⁰5.Жидкая культура Бифидобактерий (ЖКБ)3,02010⁷6.Бифидогум (5% гуммиарабик + 25% олигосахара)3,02010⁹7.Жидкая культура Бифидобактерий (ЖКБ)3,03010⁴8.Бифидогум (5% гуммиарабик + 25% олигосахара)3,03010⁸     1.Жидкая культура Лактобактерий (ЖКЛ)3,0010¹⁰2.Лактогум (5% гуммиарабик+25% олигосахара)3,005,9·10⁹3.Жидкая культура Лактобактерий (ЖКЛ)3,0103·10⁸4.Лактогум (5% гуммиарабик+2 5% олигосахара)3,0102·10⁹5.Жидкая культура Лактобактерий (ЖКЛ)3,0207·10⁷6.Лактогум(5% гуммиарабик +25% олигосахара)3,02010⁹7.Жидкая культура Лактобактерий (ЖКЛ)3,03010⁶8.Лактогум(5% гуммиарабик+25% олигосахара)3,0309·10⁸     1.Жидкая культура Бифидобактерий (ЖКБ)3,0010¹⁰2.Бифидогум (10% гуммиарабик + 25%олигосахара)3,0010¹¹3.Жидкая культура Бифидобактерий (ЖКБ)3,0106·10⁹4.Бифидогум (10% гуммиарабик + 25%олигосахара)3,0109·10¹⁰5.Жидкая культура Бифидобактерий (ЖКБ)3,02010⁹6.Бифидогум(10% гуммиарабик+25% олигосахара)3,0205·10¹⁰7.Жидкая культура Бифидобактерий (ЖКБ)3,03010⁴8.Бифидогум (10% гуммиарабик + 25% олигосахара)3,0302·10¹⁰     9.Жидкая культура Лактобактерий (ЖКЛ)3,0010¹⁰10.Лактогум (10% гуммиарабик + 25% олигосахара)3,00Более 10¹⁰11.Жидкая культура Лактобактерий (ЖКЛ)3,0103·10⁸12.Лактогум (10% гуммиарабик + 25% олигосахара)3,0104·10⁹13.Жидкая культура Лактобактерий (ЖКЛ)3,0207·10⁷14.Лактогум (10% гуммиарабик +25% олигосахара)3,0202·10⁹15.Жидкая культура Лактобактерий (ЖКЛ)3,03010⁶16.Лактогум (10% гуммиарабик + 25% олигосахара)3,03010⁹

После 3-часовой экспозиции микрокапсул в физиологическом растворе с рН 3,0 при микроскопировании микрокапсулы сохраняли форму, наблюдалось частичное разрушение (10-15%).

Бифидогум (Лактогум) отличался полидисперсностью частиц, форма частиц в основном сферическая, при этом некоторые из частиц объединены в агломераты.

Анализ физико-химических свойств высушенной культуры показал необходимость использования вспомогательных веществ, которые бы снизили влагосорбционную активность, улучшили сыпучесть субстанции при ее капсулировании, оптимизировали наполнение желатиновой капсулы. Живые бифидобактерии, присутствующие в пищевых продуктах, очень чувствительны к факторам окружающей среды, поэтому была выбрана твердая желатиновая капсула.

В таблице 5 приведены технологические характеристики смеси для капсулирования ВКБ, ВКЛ.

ВКБ, ВКЛ - высушенная культура бифидобактерий, лактобактерий.

Таблица 5 Смесь для капсулВлажность, %Сыпучесть, г/секВес капсулы, гАктивность150% Бифидогум5,250/42 сек, плохая0,58-0,621*10* КОЕ/г (Лактогум     с 5% гум     миарабика)     3% Cafos     47% Лактозы     25% Бифидогум5, 650/37,0,6-0,628*10¹⁰ КОЕ/г2(Лактогум     с 10% гум     миарабика)     3% Cafos     72% Лактозы    

Введение 3% Cafos (гидроксиаппатит кальция) в качестве агента, улучшающего сыпучесть исходного порошка, влагопоглощающего агента, позволило провести капсулирование смеси, несмотря на плохую сыпучесть порошка.

Обнаружен рост колоний в количестве более 10¹⁰ КОЕ/г (норма по содержанию бифидобактерий согласно СанПиН 2.3.2.1078-01-1·10⁸ КОЕ/г).

Влияние условий хранения, сроков хранения на активность бифидо-лактобактерий.

Бифидогум, Лактогум с 5% и 10% гуммиарабика в виде порошка и в твердых желатиновых капсулах (без добавления вспомогательных веществ) хранились в течение 21 дня при температурах: +4, +12, +20, +55°С. Активность бифидобактерии при +55°С до 1·10⁵ КОЕ/1 г, во всех других случаях активность не снизилась.

Подтверждение результатов получения микрокапсул:

Получены окрашенные мазки ВКЛ, ВКБ (фиксация физиологическим раствором с рН 3,0 с дальнейшей окраской мазка индикатором - метиленовым голубым. При 630-кратном увеличении четко видны микрокапсулы с бифидобактериями внутри микрокапсул - палочки с разветвлениями на конце либо булавовидными окончаниями и лактобактериями в виде палочек. После 3-часового настаивания в физиологическом растворе с рН 3,0 микрокапсулы с бактериями полностью сохраняются (сохраняется сферическая форма, бактерии не вымываются).

Выводы:

1. Разработана рецептура и технология получения сухой культуры бифидо- лактобактерий, обогащенной необходимыми факторами роста микроорганизмов (олигосахариды, натуральные волокна смолы акации).

2. Получена новая оригинальная форма бифидо-, лактобактерий - микрокапсула, которая обеспечивает лучшую сохранность эубиотиков при хранении и доставке к месту локализации. Установлен средний размер микрокапсул 30-50 мкм.

3. Получен оригинальный продукт, обогащенный эубиотиками, в современной упаковке - твердой желатиновой капсуле, обеспечивающей удобство в применении, эффективность продукта, лучшую сохранность до конца срока годности. Однако форма препарата не исчерпывается желатиновой капсулой. Препарат также может использоваться в виде таблеток или порошка.

4. Установлены оптимальные режимы сушки с температурой воздуха на выходе в рабочую камеру 60-80°С.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению сухих препаратов на основе бифидо- и/или лактобактерий для перорального применения. Способ предусматривает выращивание биомассы бифидо- и/или лактобактерий, смешение с наполнителем при 8-16°С с образованием суспензии. Далее полученную суспензию диспергируют и сушат на распылительной сушилке с образованием микрокапсул. Изобретение позволяет повысить активность и стабильность получаемого сухого препарата. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Способ получения сухого препарата на основе бифидо- и/или лактобактерий, включающий выращивание биомассы бифидо- и/или лактобактерий, смешение жидкой культуры бифидо- и/или лактобактерий с наполнителем, в качестве которого используют гуммиарабик и олигосахариды, при температуре 8-16°С с образованием суспензии и распылительную сушку полученной суспензии с образованием микрокапсул.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сушку проводят при температуре 60-80°С.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что препарат получают в виде микрокапсул с размером от 30 до 50 мкм.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что после смешения суспензии осуществляют его диспергирование.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно проводят фасовку препарата в твердые желатиновые капсулы.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве наполнителя дополнительно вводят гидроксиаппатит кальция и/или лактозу.7. Сухой препарат на основе бифидо- и/или лактобактерий, содержащий наполнитель и сухую культуру бифидо- и/или лактобактерий, отличающийся тем, что в качестве наполнителя он содержит гуммиарабик и олигосахариды при следующем содержании компонентов, мас.%:

Гуммиарабик5-35Олигосахариды5-50Сухая культура бифидо- и/или  лактобактерийОстальное