СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ, СПЕЦИФИЧНО СВЯЗЫВАЮЩИХСЯ С КЛЕТКАМИ-МИШЕНЯМИ И ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ Российский патент 2005 года по МПК C12N15/12 C07K14/47 C12N7/01 

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к способам получения бактериофагов, которые способны специфически связываться с клетками-мишенями и могут быть использованы в диагностике, терапии и фармацевтических приложениях.

В настоящее время одной из главных проблем является повышение уровня сердечно-сосудистых, раковых и иммунных заболеваний. В большинстве случаях, первоисточниками таких нарушений является быстротечная неконтролируемая пролиферация тканево-клеточных структур, что затрудняет и осложняет их диагностику и терапию. Поэтому первоочередным условием является своевременное выявление патологического состояния, разработка и доставка лекарственных препаратов, блокирующих клеточную активность в очагах заболеваний.

Известны терапевтические ингибиторы для сосудистых гладкомышечных клеток, которые используют для подавления клеточной активности и/или уничтожения клетки путем целевой доставки терапевтических агентов в очаги активной пролиферации (см. пат. США №6515009 от 04.02.2003 г., МПК А 61 К 31/40). Для ингибирования сосудистых гладкомышечных клеток, согласно данному патенту, используются терапевтические конъюгаты, которые содержат лекарственный препарат, ассоциированный с пептидом или белком, специфическим образом связывающийся с клеточной мембраной сосудистых гладкомышечных клеток (например, моноклональные и поликлональные антитела, факторы роста, полипептидные гормоны, цитокины и им подобные) или с элементом внутри- или внеклеточного матрикса (например, макромолекулы, распознающие рецепторы интегринов и фибронектинов, а также эпитопы коллагена и внеклеточных гликопротеинов) этих же клеток. Один из таких пептидов, например, содержит последовательность аминокислот, специфически узнающую хондроитин - сульфат протеогликан, с предположительным молекулярным весом около 250 килодальтон, экспрессируемым на мембранах сосудистых гладкомышечных клетках. Такая же последовательность аминокислот находится в Fab и Fv фрагментах или CDR (регионы, обуславливающие комплементарность) моноклонального антитела NR-AN-01 и/или его функциональных эквивалентов.

Недостатками данного изобретения является использование пептидов, которые распознают белки с выраженной экспрессией в ряде других функционально важных клеток и тканей, это ведет к тому, что данный терапевтический конъюгат может связываться и с другими типами клеток не гладкомышечного происхождения, как, например, клетки нейроглии, костной ткани и другие, что приводит к нежелательной аккумуляции лекарственного препарата в данных клетках и побочному цитотоксическому эффекту (клеточной гибели). Кроме того, при использовании антител в качестве ведущих составляющих конъюгатов их размер, ввиду плотного внеклеточного матрикса, может стать препятствием при проникновении конъюгата в очаг пролиферации, причем кросс-реактивность антител к другим молекулярным структурам снижает их специфичность.

Известен также способ целенаправленной доставки пептидов к рестенозным сосудистым гладкомышечным клеткам in vitro и in vivo с целью доставки лекарственных препаратов к рестенозной бляшке посредством пептидов, встроенных в фаговые частицы, которые связываются с пролиферирующими сосудистыми гладкомышечными клетками из библиотеки синтетических 15-ти членных пептидов, сконструированной случайным образом (см. статью Ingrid N. Michon et al. "Targeting of peptides to restenotic vascular smooth muscle cells using phage display in vitro and in vivo" в журнале "Biochimica et Biophysica Acta" вып. №1591, 2002 г., стр.87-97). Отобранные пептиды посредством многократного повторения одноэтапного скрининга в дальнейшем проходят подтверждение специфичности исключительно методом иммуноферментного анализа и визуализируются с помощью иммунофлюоресценции, при которых обнаруживают два пептида с консервативной аминокислотной последовательностью, такие как 5G6 (CNIWGVVLSWIGVFPEC) и 5Е5 (CESLWGGLMWTIGLSDC).

Недостатками данного способа являются использование одной исходной библиотеки на основе синтетических случайно ориентированных пептидов, не имеющих аналогов в природе, что определяет их первично низкую специфичность и селективность, а также высокую иммуногенность. Кроме того, многократное повторение одноэтапного скрининга приводит к ослаблению специфических взаимодействий и наращиванию неспецифических.

В основу заявленного изобретения поставлена задача создать способ получения бактериофагов, специфично связывающихся с клетками-мишенями с высокой степенью селективности, которые предназначены для терапевтических целей.

Поставленная задача достигается путем осуществления нового способа получения бактериофагов, специфично связывающихся с клетками-мишенями, при котором предусматривают конструирование фаговой библиотеки случайных пептидов на основе кодирующих их олигонуклеотидных фрагментов, ее скрининг для получения бактериофагов, связывающихся с клетками-мишенями, и подтверждают специфичность отобранных бактериофагов, при этом, согласно изобретению,

- олигонуклеотидные фрагменты, кодирующие случайные пептиды, получают реакцией обратной транскрипции с использованием случайных праймеров и суммарных РНК клеток-мишеней и клеток других типов, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его диагностику и терапию;

- указанные олигонуклеотидные фрагменты встраивают в бактериофаговые векторы в правильной ориентации и используют для создания фаговых библиотек случайных пептидов для всех типов клеток, использованных для выделения суммарных РНК;

- скрининг полученных фаговых библиотек случайных пептидов проводят в два этапа, на первом из которых отбирают бактериофаги, способные связываться с клетками-мишенями, а на втором - из отобранных на первом этапе бактериофагов отбирают не связывающиеся с клетками других использованных типов;

- для подтверждения специфичности бактериофагов к клеткам-мишеням используют комбинацию различных тестов.

Причем в качестве клеток-мишеней выбирают сосудистые гладкомышечные клетки (СГМК), а критерием отбора (скрининга) специфических бактериофагов является их способность связываться с такими клетками и не связываться с остальными типами клеток. Кроме того, в качестве бактериофаговых векторов используют векторs на основе ДНК бактериофага Т7.

При осуществлении данного способа получают бактериофаги с высокой степенью селективности, которые могут использоваться для доставки лекарственных препаратов в место непосредственного их действия с целью профилактики и/или терапии, связанные с нарушением функционирования сосудистых гладкомышечных клеток, для непосредственного использования полученных пептидов как лекарственной формы в терапевтических приложениях. Кроме того, использование таких бактериофагов или их фрагментов, или модифицированного вектора позволит диагностировать нарушение функционирования сосудистых гладкомышечных клеток и прогнозировать их лечение.

Заявленный способ позволяет получать высокоселективные бактериофаги к определенному типу клеток-мишеней, а именно к сосудистым гладкомышечным клеткам.

Способ получения бактериофагов поясняется схемами и иллюстрациями, где на

фиг.1 показаны синтез кДНК и конструирование библиотек;

фиг.2 изображена схема одно- и многошагового скрининга.

Способ получения бактериофагов осуществляют таким образом.

Вначале проводят отбор и разделение клеточных популяций на типы: клетки-мишени и клетки, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию. Затем конструируют серии библиотек случайных пептидов с использованием суммарной клеточной РНК в векторе вирусного типа на основе ДНК бактериофагов.

Сначала изолируют суммарную РНК общеизвестными методами с адаптационными модификациями с последующей, в случае необходимости, очисткой ее и выделением фракции матричной РНК. Качество такой РНК анализируют и в дальнейшем, используют РНК в реакциях обратной транскрипции, направляемых праймерами, как случайного происхождения, так и комплементарными к поли А+ участку матричных РНК.

На этом этапе осуществляют первичное разделение суммарной клеточной РНК посредством контролируемого синтеза фрагментов кДНК, ограниченных в размере и гетерогенности, что достигается использованием различных концентраций ионов в реакционной смеси, комбинацией праймеров, количеством исходного материала и режимов температур.

Вторичное разделение клеточной РНК осуществляют на этапе фракционирования и очистки полученных молекул кДНК, для чего используют гельфильтрационную хроматографию так, что после элюции пул кДНК молекул состоит из 2-х частей: фракции с количеством нуклеотидных звеньев менее 500 и фракции, состоящей из молекул размером более 500 пар оснований.

Такое разделение позволяет в первом случае создание библиотек, направленных на определение точных мест взаимодействия молекулы пептида, в составе фаговой частицы, с молекулами на клетках-мишенях, а во втором случае идентифицировать фрагмент нуклеиновой кислоты, ответственный за синтез данного пептида или белкового фрагмента.

Далее, на стадии встраивания фрагментов кДНК в бактериофаговый вектор в правильной ориентации полученные в результате деления и синтеза молекулы кДНК лигируют с олигонуклеотидными линкерами, синтетически синтезированными и содержащими места узнавания для рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз), используемых для обработки и подготовки вектора для клонирования. Для этого концы кДНК вначале обрабатывают с помощью полимеразы и только потом такие фрагменты лигируют с линкерами и инкубируют с рестриктазами. Используя данные линкеры, становится возможным получить фрагменты кДНК, которые содержат на разных концах места узнавания для используемых рестриктаз в таком расположении, что могут быть беспрепятственно клонированы в вектор в определенной ориентации (смысловое клонирование).

Одновременно с этим бактериофаговый вектор обрабатывают рестрикционными эндонуклеазами с целью получения фрагментов, пригодных для лигирования с синтезированными фрагментами кДНК. Полученные в результате лигирования фрагментов кДНК и молекул вектора, рекомбинантные молекулы, упаковывают in vitro и инициируют экспрессию данного фрагмента посредством одного цикла репликации. Затем определяют количество рекомбинантов в библиотеке и абсолютное число частиц.

После этого проводят отбор (скрининг) таких библиотек, используя комбинации клеток-мишеней и клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию. При этом скрининг осуществляют многократным повторением раундов инкубации с клетками, отмывок, растворами различной ионной силы и растворами различной способности нарушать белок - белковые взаимодействия, фаговых частиц, которые не связались с клетками, с последующей элюцией и амплификацией искомых фаговых частиц. Причем в случае прямого скрининга определенно - рассчитанное количество фаговых частиц в буфере сначала инкубируют с материалом, который используют для культивирования клеток, а потом остаточную фракцию (супернатант), содержащую свободные фаги, переносят на клетки-мишени. В случае многошагового скрининга, а именно использования комбинаций нескольких типов клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию, супернатант после инкубации с материалом направляют на эти клетки, после которых супернатант направляют либо на клетки-мишени, либо на следующий тип клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию, с последующей инкубацией на клетках-мишенях. Аналогично следуют при использовании клеток-мишеней и клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию, в различных структурно-функциональных состояниях.

Таким образом, результатом многошагового скрининга является группа пептидов в составе фаговых частиц, обладающая выраженной специфичностью в отношении клеток-мишеней.

Для получения конечных бактериофагов из вышеуказанных групп выделяют индивидуальные фаговые частицы и их тестируют.

В одном случае тестируемый фаг нарабатывают (наращивают) в необходимом количестве, очищают и испытывают как первичное антитело в прямом иммуноферментном анализе (ИФА), где антигеном выступают культивируемые клетки выбранного функционального состояния.

При исследовании большого количества фаговых частиц проводят микроселекцию. Для этого исходную группу рассеивают до получения индивидуальных бляшек, которые затем элюируют буфером для инкубации в ИФА и используют непосредственно как источник первичных антител в ИФА, без предварительного наращивания и очистки.

В другом случае индивидуальный клон аналогично первому случаю амплифицируют, очищают и инкубируют с клетками-мишенями и клетками, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию, одновременно. После чего отмывают клетки, элюируют связанные частицы и определяют их титр, затем сравнивают его с аналогичным для другого типа клеток.

В третьем случае используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в анализе специфичности пептидов, при этом несколько фагов очищают и смешивают в одинаковых количествах, потом инкубируют с клетками-мишенями и клетками, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию, элюируют, рассеивают до отдельных бляшек, которые отбирают парами, выделяют ДНК и используют ее в качестве матрицы для ПЦР. Так определяют количественное распределение и степень специфичности фагов.

Также определяют стабильность и способность интернализироваться, которые проверяют, инкубируя фаг с клетками-мишенями при различных режимах температуры и времени, с последующим элюированием оставшихся фагов.

Примеры конкретного выполнения заявленного способа.

Пример 1. Выбор клеточных популяций.

Для получения высокоспецифичных бактериофагов к сосудистым гладкомышечным клеткам (СГМК), которые используют в качестве клеток-мишеней, а клетки, взаимодействующие с ними, как в составе стенки кровеносного сосуда (эндотелиальные), так и переносимые потоком крови (фибробласты), используют в качестве клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию. Клетки карциномы цервикального канала - HeLa и клетки карциномы печени - Нер-G2 также используют как клетки, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию.

Культуру СГМК инициируют из магистральных кровеносных сосудов пациентов с патологиями сердечно-сосудистой системы. Целый ряд клеточных линий доступен в виде коммерческих препаратов. Например, параллельно культурам клеток, полученным при обработке артерий и вен пациентов, использовали гладкомышечные клетки коронарной артерии (Cell Systems GmbH, Lot# 17151, Catalog # CC-2583). Препараты исходной культуры СГМК являются первичными в своем происхождении и имеют ограниченное количество дупликаций, что лимитирует количество последующих пересевов. Поэтому во всех случаях инициируют культуры для последующего исследования, используя образцы клеток, имеющих не более чем 6 делений. Для культивирования используют пластиковые флаконы, произведенные исключительно для работы с культурами тканей, общей площадью поверхности для роста от 25 до 182 квадратных сантиметров (например, флаконы типов Т25, Т75, Т182).

Сосудистые гладкомышечные клетки культивируют, используя питательную среду, которая состоит на 1/3 из каждого следующего компонента - Waymouth (GIBCO BRL Cat. # 31220-023), F12 (GIBCO BRL Cat. # 31220-023), SMCBM (Promocell Cat. # C-22260). Такую среду дополняют предварительно инактивированной инкубацией 30 минут при температуре 56°С на водяной бане, сывороткой плода коровы (GIBCO BRL Cat. # СС-4102) до конечной концентрации - 15%, а также раствором пенициллина и стрептомицина (GIBCO BRL Cat. # 15140-114) до конечной концентрации - 1,5%. Среду, содержащую в своем составе сыворотку плода коровы, называют обогащенной. Сосудистые гладкомышечные клетки, блокированные на стадии роста, культивируют, используя обедненную питательную среду, т.е. без добавления сыворотки плода коровы, но с добавлением раствора пенициллина/стрептомицина в вышеуказанной концентрации. Для блокирования сосудистых гладкомышечных клеток на стадии роста их сначала культивируют, пока размер монослоя не достигнет 90% от всей площади роста, используя обогащенную питательную среду, и лишь затем проводят замену обогащенной питательной среды на обедненную и продолжают инкубацию в течение 72 часов, проводя замену старой питательной среды на новую каждые 24 часа.

Эндотелиальные клетки культивируют, используя питательную среду - EGM-2 (Clonetics Company, Cat. # CC-3202), дополненную прилагающимся к ней пакетом комплементации - EGM-2 MV (Clonetics Company, Cat # CC-4147), который содержит факторы роста, гормоны и инактивированную сыворотку плода коровы, конечная концентрация которой в среде после комплементации составляет 10%. Эндотелиальные клетки инициируют из препарата (Promocell Cat. # СС-2519). Блокируют эндотелиальные клетки на стадии роста аналогично тому, как в случае сосудистых гладкомышечных клеток.

Фибробласты культивируют, используя питательную среду, основой которой является стандартная среда DMEM (GIBCO BRL) дополненная инактивированной сывороткой плода коровы до конечной концентрации 10%, и раствором пенициллина/стрептомицина до конечной концентрации 1,5%. Инициируют культуру клеток фибробластов из препарата пациентов с патологиями сердечно-сосудистой системы и блокируют так же, как это описано для сосудистых гладкомышечных клеток.

Клетки HeLa 3T3 и клетки Нер-G2 представляют собой иммортализованные линии, поэтому практически любой доступный образец клеток используют для инициирования культуры, однако стараются использовать клетки, прошедшие не более 100 делений. Для культивирования этих клеток используют питательную среду на основе какой-либо из MEM-композиций (GIBCO BRL), дополненную сывороткой плода коровы в конечной концентрации 15-20% (что определяется желаемыми скоростями роста) и раствором пенициллина/стрептомицина в конечной концентрации 1,5%. Для получения достоверных результатов скрининга данные типы клеток также подвергают культивированию с использованием обедненной питательной среды, имитируя блокирование роста, сходное с таковым наблюдаемым для первичных типов клеток (СГМК, эндотелиальные и фибробласты).

Пример 2. Выделение РНК и реакции обратной транскрипции (см. фиг.1).

На основе первичного отбора клеточных популяций выделяют РНК как из клеток-мишеней, так и из клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию.

Клетки всех типов наращивают в течение 5-7 суток, используя флаконы типа Т75 и 18 мл питательной среды, замену которой производят каждые сутки. Сосудистые гладкомышечные клетки культивируют в 40 флаконах, из расчета 3,5·10⁵ клеток на флакон. Эндотелиальные клетки культивируют в 20 флаконах, из расчета 3·10⁵ клеток на флакон. Клетки HeLa и Hep-G2 культивируют в 20 флаконах, из расчета 1,6·10⁵ клеток на флакон. Клетки интенсивно промывают 2 раза, используя 12 мл буфера HBSS (GIBCO BRL) каждый раз, далее обрабатывают в течение 3 минут, используя 6 мл раствора, содержащего 0,05% трипсина и 0,53 мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетата), и нейтрализуют добавлением 9 мл буфера HBSS. Собирают клетки центрифугированием в течение 10 минут на 3000*g и промывают 3 раза, используя 20 мл буфера HBSS. Число клеток определяют с помощью камеры для счета клеток, для этого смешивают 50 мкл суспензии клеток с равным объемом 15%-ого раствора трипанового голубого, являющегося витальным красителем. Число живых клеток фиксируют и рассчитывают общее число клеток в суспензии.

В случае использования методов грубой экстракции гуанидинизотиоцианатом как с последующим осаждением солями лития, так и без осаждения, клетки концентрируют центрифугированием, супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют интенсивно в буфере для лизиса (5,25 М гуанидинизотиоцианата; 50 мМ Трис-Cl, рН 6,4; 20 мМ ЭДТА; 1% Тритон Х-100; 0,1 М 2-меркаптоэтанола) из расчета 1 мл на 10⁷ клеток. К данному раствору добавляют 0,1 объема 2 М р-ра ацетата натрия, 1 объем р-ра водного фенола, 0,3 объема смеси хлороформ - изоамиловый спирт (в соотношении 24:1) и интенсивно перемешивают в течение 30-60 секунд. Инкубируют полученную смесь 15 минут при температуре 0°С, после чего центрифугируют в течение 30 минут на 8000*g при температуре 4°С с целью разделения водной и органической фаз. Водную фазу после осаждения переносят в новую пробирку и добавляют к ней 0,6 объема изопропилового спирта, предварительно охлажденного до температуры -20°С, перемешивают и помещают на не менее 60 минут в охладитель с температурой -70°С. После инкубации раствор центрифугируют 30 минут на 12000*g при температуре 4°С, супернатант тщательно удаляют, а осадок промывают несколько раз центрифугированием по 5 минут в присутствии 1 мл 70%-го р-ра этилового спирта. Полученный осадок растворяют в 0,4 мл воды обработанной диэтилпирокарбонатом (ДЭПК).

В случае применения методов мягкой экстракции с использованием протеиназы К, клетки концентрируют центрифугированием, супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют интенсивно в предварительно охлажденном буфере для лизиса (0,15 М хлорида натрия; 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5; 0,05% NP-40; 0,01% 3-карбоксиауриновой кислоты; 0,1 М 2-меркаптоэтанола) из расчета 1 мл на 5·10⁷ клеток. Затем смесь центрифугируют 2 минуты на 12000*g и температуре 4°С, супернатант переносят в новую пробирку и добавляют равный объем буфера для протеиназы К (0,2 М Трис-Ацетат; 0,3 М натрия ацетат; 0,05 М ЭДТА, рН 7,5; 2% (в/о) натрия додецилсульфат), содержащего 400 мг/мл протеиназы К, и инкубируют 60 минут при температуре 37°С. Далее добавляют 1 объем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (в соотношении 25:24:1) и интенсивно перемешивают 5 минут при комнатной температуре. После чего смесь центрифугируют 2 минуты на 12000*g при комнатной температуре, полученную водную фазу переносят в новую пробирку и повторяют экстракцию смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (в соотношении 25:24:1) несколько раз. К водной фазе, полученной в результате экстракции, добавляют 2,5 объема абсолютного этилового спирта, интенсивно перемешивают и осаждают РНК, помещая образец на 30 минут в охладитель с температурой -70°С. Далее раствор, содержащий РНК, центрифугируют 10 минут на 12000*g при температуре 4°С, и полученный осадок промывают 3 раза центрифугированием 5 минут на 12000*g в присутствии 700 мкл 70%-го раствора этилового спирта. Осадок осушают 2,5 минуты под вакуумом и растворяют в 0,4 мл воды, обработанной ДЭПК.

Полученный в результате первичной экстракции раствор суммарной клеточной РНК подвергают обработке дезоксирибонуклеазой первого типа с целью удаления фрагментов ДНК, способных попасть в раствор РНК в процессе ее экстракции и способных затруднять дальнейшее фракционирование такой РНК и использование ее в реакциях обратной транскрипции. Для этого к 0,4 мл раствора, содержащего 4 мг/мл РНК, добавляют 12 мкл (480 единиц) ингибитора рибонуклеаз (Invitrogen, Cat # 10777-019), 50 мкл 10-кратного стандартного буфера для дезоксирибонуклеазы и 50 мкл (500 единиц) дезоксирибонуклеазы первого типа (GIBCO BRL). Затем полученную смесь инкубируют 2 часа при температуре 37°С, и реакцию останавливают одновременным добавлением 0,1 объема 3 М р-ра ацетата натрия (рН 5,2), 1,1 объема раствора водного фенола, 0,3 объема смеси хлороформ-изоамиловый спирт (в соотношении 24:1). Раствор интенсивно перемешивают в течение 1 минуты, инкубируют 15 минут при температуре 0°С и центрифугируют 10 минут на 12000*g при температуре 4°С. Водную фазу переносят в новую пробирку и осаждают РНК с помощью абсолютного этилового спирта, как описано выше.

Для выделения фракции матричной РНК (мРНК) 1-2 мг суммарной РНК растворяют в 5 мл буфера для нанесения (прилагается к колонке) и наносят на колонку, содержащую олиго-(дТ)-целлюлозу (Sigma, Cat # 03131), предварительно промытую 3 раза 1 мл буфера для нейтрализации (прилагается к колонке). После экстракции колонку промывают 5 раз, используя 1 мл буфера для нейтрализации, и связанную мРНК элюируют 1,5 мл буфера для элюции. В дальнейшем, мРНК, содержащуюся в полученном растворе, осаждают добавление 150 мкл р-ра 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 3,75 мл абсолютного этилового спирта.

Пример 3. Синтез кДНК и фрагментация суммарной РНК.

С целью получения молекул кДНК для клонирования суммарную РНК и/или мРНК используют в реакциях обратной транскрипции направляемых РНК-зависимой - ДНК-полимеразой.

Для этого смешивают 0,001-5,000 мг суммарной РНК и 1 мкл праймера (500 мкг олиго-(дТ) или 0,050-0,250 мкг случайного связывающегося праймера, 5'-TTNNNNNN-3'), к которым добавляют 1 мкл 10 мМ р-ра дезоксирибонуклеотидов (10 мМ каждого в нейтральном растворе) и доводят объем смеси до 12 мкл, используя дважды дистиллированную воду, обработанную диэтилпирокарбонатом. Полученную смесь инкубируют 5 минут при температуре 65°С, быстро охлаждают и добавляют 4 мкл 5-кратного буфера для синтеза первичной цепи кДНК (250 мМ Трис-Cl, рН 8,3; 375 мМ калия хлорида; 15 мМ хлорида магния), 2 мкл 0,1 М р-ра дитиотриэтола (ДТТ), 1 мкл (40 единиц) ингибитора рибонуклеаз. Содержимое пробирки интенсивно перемешивают и инкубируют 2 минуты при температуре 42°С, после чего добавляют 1 мкл (200 единиц) Superscript II РНК-зависимой - ДНК-полимеразы (GIBCO BRL, Cat. # 18064-014), интенсивно перемешивают и инкубируют 60 минут при температуре 42°С. Реакцию обратной транскрипции останавливают посредством инактивации фермента, для чего смесь инкубируют 15 минут при температуре 70°С. С целью удаления фрагментов РНК, комплиментарных новосинтезированным молекулам кДНК и затрудняющих последующую амплификацию кДНК с помощью ПЦР, к раствору добавляют 1 мкл (2 единицы) рибонуклеазы Н и инкубируют 20 минут при температуре 37°С.

На этом этапе осуществляют первичное разделение суммарной РНК посредством контролируемого синтеза фрагментов кДНК, ограниченных в размере и гетерогенности, что достигается использованием различных концентраций ионов в реакционной смеси, комбинацией праймеров, количеством исходного материала и режимов температур.

Синтез 2-ой цепи кДНК осуществляют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), для чего используют не более 10% конечного раствора после обработки рибонуклеазой Н. Собирают смесь последовательным добавлением 5 мкл 10-ти кратного буфера для ПЦР (200 мМ Трис-Cl, рН 8,4; 500 мМ хлорида калия), 1,5 мкл 50 мМ р-ра хлорида магния, 1 мкл 10 мМ р-ра дезоксирибонуклеотидов, 0,5 мкл (2,5 единиц) Taq-ДНК-полимеразы, 2 мкл р-ра кДНК (конечный продукт реакции синтеза первичной цепи кДНК), 38,1 мкл воды, обработанной ДЭПК. Раствор интенсивно перемешивают и инкубируют в течение 2 минут при температуре 94°С. Затем проводят 15-40 стандартных циклов амплификации ПЦР.

С целью получения фрагментов, пригодных для клонирования, концы молекул кДНК обрабатывают и лигируют с синтетическими олигонуклеотидными линкерами, которые содержат в своем составе место узнавания для рестрикционной эндонуклеазы - Eco R1 и частично место узнавания для рестрикционной эндонуклеазы - Hind III. Это позволяет получить после обработки таких линкеров соответствующими рестрикционными эндонуклеазами молекулы кДНК, способные эффективно лигироваться с 5' конца только с Eco R1 обработанной ДНК и с 3' конца только с Hind III обработанной ДНК. Для этого к 20 мкл (не более 10 мкг) раствора молекул кДНК добавляют 3 мкл 10-кратного буфера для Т4 ДНК-полимеразы (200 мМ Трис-Cl, рН 8,4; 500 мМ хлорида калия), 1,5 мкл 100 мМ р-ра ДТТ, 3 мкл 1 мМ р-ра дезоксирибонуклеотидов и 1,0 мкл (1,5 единиц) Т4 - ДНК-полимеразы и доводят конечный объем раствора до 30,0 мкл, используя дважды дистиллированную воду, обработанную ДЭПК. Раствор медленно перемешивают и инкубируют в течение 20 минут при температуре 11°С. Реакцию останавливают добавлением равного объема смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (в соотношении 25:24:1) и затем ДНК, которая содержится в водной фазе, осаждают добавлением растворов ацетата натрия и абсолютного этилового спирта, как описано выше. Полученный осадок, который содержит молекулы кДНК, растворяют в 10 мкл дважды дистиллированной воды, обработанной ДЭПК. Олигонуклеотидные линкеры фосфориллируют посредством инкубации с Т4 - полинуклеотидкиназой, непосредственно перед использованием в реакции лигирования. Для этого собирают смесь последовательным добавлением к 10 мкл р-ра молекул кДНК (с предыдущего этапа), 2 мкл 10-кратного буфера для лигирования (10x=200 мМ Трис-Cl, рН 7,6; 50 мМ хлорида калия), 2 мкл 1 мМ р-ра АТФ, 2 мкл (100 пикомоль) р-ра олигонуклеотидных линкеров (5'-GCTTGAATTCAAGC-3'/3'-CGAACTTAAGTTCG-5'), 2 мкл 100 мМ р-ра ДТТ, 2,0 мкл (5 единиц) Т4 - полинуклеотидкиназы. Раствор перемешивают и инкубируют в течение 5 минут при температуре 37°С. Затем добавляют 6-8 единиц Т4 - ДНК-лигазы и инкубируют в течение 6-20 часов при температуре 16°С.

Далее молекулы кДНК расщепляют с помощью 2-х рестриктаз - Hind III и EcoR1. Для этого к раствору кДНК добавляют 10 мкл 10-кратного буфера для рестрикционной эндонуклеазы Hind III и 10 мкл (100 единиц) рестрикционной эндонуклеазы Hind III (Invitrogen), объем такой смеси доводят до 100 мкл с помощью дважды дистиллированной воды. Полученную смесь инкубируют в течение 2-х часов при температуре 37°С. Затем добавляют 10 мкл 10-кратного буфера для рестрикционной эндонуклеазы Eco R1 и 10 мкл (100 единиц) рестрикционной эндонуклеазы Eco R1 (Invitrogen) и снова инкубируют в течение 4 часов при температуре 37°С. Реакцию останавливают добавлением равного объема смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (в соотношении 25:24:1) и затем ДНК, которая содержится в водной фазе, осаждают добавлением растворов ацетата натрия и абсолютного этилового спирта, как описано выше.

Вторичное разделение суммарной РНК осуществляют на этапе фракционирования и очистки полученных молекул кДНК, для чего используют гельфильтрационную хроматографию. Хроматографическую колонку, содержащую частицы сефарозы определенного размера (Novagen) промывают 5 раз, используя 1 мл буфера для нейтрализации каждый раз. Наносят разделяемый материал, популяцию кДНК в объеме 1 мл и собирают фракции по 25 мкл в конических пробирках.

Пример 4. Клонирование и создание множества библиотек.

Создание библиотек всех органов проводят по одной модели как для клеток мишеней, так и для клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию.

Для этого используют ДНК бактериофага Т7 (Novagen, T7 Select 10-3 вектор), обработанную с использованием 2-х рестрикционных эндонуклеаз - Eco R1 и Hind III, т.е. того же типа, которые использовались для обработки концов кДНК. Раствор молекул ДНК вектора и раствор молекул кДНК смешивают в отношении 1:3, в пересчете на моль вещества, добавляют эквивалентное количество Т4 - ДНК-лигазы (GIBCO BRL) и инкубируют не более 28 часов при температуре 16°С. Реакцию останавливают добавлением равного объема смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (в соотношении 25:24:1), и затем ДНК, которая содержится в водной фазе, осаждают добавлением растворов ацетата натрия и абсолютного этилового спирта, как описано выше.

Полученные рекомбинантные молекулы кДНК в количестве не более 1 мкг смешивают с 250 мкл р-ра упаковочных белков бактериофага и инкубируют в течение 5 минут при температуре 0°С. Затем добавляют питательную среду и продолжают инкубацию еще 60 минут при температуре 37°С.

Пример 5. Амплификация бактериофагов.

Бактериофаг T7 культивируют, используя штамм E.coli BLT5403 в качестве хозяина. При этом амплификацию проводят несколькими путями.

В одном случае (микроамплификация) единичную бляшку или элюат после скрининга, или какое-либо другое малое количество бактериофагов растворяют в 1 мл питательной среды, приготовленной по методу Луриа-Бертани. Затем добавляют 1 мл свежеприготовленной дневной культуры штамма-хозяина с оптической плотностью 0,4-0,6 при длине волны 600 нм (ОП₆₀₀=0,4-0,6), которую готовят наращиванием 0,5 мл ночной культуры в 50 мл питательной среды ЛБ в течение 2-3 часов. Смесь фагов и бактерий общим объемом 2 мл инкубируют при температуре 37°С и 200 оборотах в минуту на шейкере в течение 3-4 часов, наблюдая полный лизис, выражающийся просветлением содержимого пробирки.

В другом случае, макроамплификацию проводят, используя колбы посредством инокуляции необходимого числа фагов в 135 мл свежеприготовленной дневной культуры штамма-хозяина (Оп₆₀₀=0,4-0,6) и последующим ростом в течение 4-5 часов до момента полного лизиса.

К лизированным культурам добавляют 0,1 объема 5 М р-ра хлорида натрия, интенсивно перемешивают 30 секунд и центрифугируют в течение 3 минут на 7000*g и при температуре 4°С. Супернатант переносят в новую пробирку и добавляют 1/6 объема раствора, содержащего 20% полиэтиленгликоля и 2,5 М хлорида натрия, интенсивно перемешивают, и инкубируют не менее 3 часов при температуре 0°С. Далее, раствор центрифугируют 10 минут на 8000*g, а осадок, содержащий фаги, растворяют в 1 мл стандартного буфера TBS (Трис - Боратный Буфер) и снова осаждают фаговые частицы добавлением раствора полиэтиденгликоля - хлористого натрия с последующей инкубацией и центрифугированием в течение 10 минут на 12000*g и при температуре 4°С. Полученный осадок растворяют в 0,2 мл буфера TBS.

Пример 6. Скрининг (см. фиг.2).

Скрининг библиотек осуществляют как многократным повторением одношаговой процедуры, так и с использованием многошаговой комплексной процедуры, включающей селекцию на комбинациях различных типов клеток, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию.

Для этого инициируют культуру сосудистых гладкомышечных клеток в чашках Петри диаметром 60 мм из расчета 64000 клеток на чашку и растят в течение 2-х суток. Одновременно в аналогичных чашках инициируют культуры эндотелиальных клеток, фибробластов, HeLa, Hep-G2 соответственно в количествах 48000, 24000, 16000, 16000 клеток на чашку и растят в течение 2-х суток.

Клетки промывают интенсивно 5 раз по 5 минут, используя каждый раз 3 мл буфера HBSS.

При использовании одношаговой процедуры 10¹⁰ фаговых частиц из любой библиотеки, растворяют в 2 мл буфера HBSS и инкубируют 20 минут с преинкубационным материалом (пластик). После этого верхнюю фазу, содержащую не связавшиеся с пластиком фаги, переносят на предварительно промытые сосудистые гладкомышечные клетки и инкубируют 40 минут при температуре +4°С. После инкубации, с целью удаления несвязанного материала, клетки интенсивно отмывают 5 раз по 5 минут, используя каждый раз 3 мл буфера HBSS, с последующей элюцией специфично связывающихся фагов с помощью 1 мл буфера для элюции, который содержит в своем составе не более чем 1,0% додецилсульфата натрия, или с помощью 1 мл свежеприготовленной дневной культуры штамма-хозяина. Титр фагов в элюате определяют и элюат амплифицируют для получения как минимум 10¹⁰ фагов, которые инкубируют с новой порцией преинкубационного материала и новой порцией сосудистых гладкомышечных клеток, повторяя селекционный цикл 3-5 раз.

При использовании многошаговой процедуры 10¹⁰ фаговых частиц из любой библиотеки растворяют в 2 мл буфера HBSS и инкубируют 20 минут с преинкубационным материалом (чашкой Петри, в которой вместо клеток содержалась лишь среда). После этого верхнюю фазу, содержащую не связавшиеся с пластиком фаги, переносят на предварительно промытые эндотелиальные клетки и инкубируют в течение 40 минут при температуре +4°С, с последующим переносом верхней фазы на новую порцию эндотелиальных клеток и аналогичной инкубацией, что повторяют 2-3 раза, и лишь после этого верхнюю фазу направляют на фибробласты и проводят сходную селекцию 2-3 раза. Или верхнюю фазу после инкубации на эндотелиальных клетках, без дополнительной селекции на фибробластах, переносят непосредственно на сосудистые гладкомышечные клетки и инкубируют в течение 40 минут при температуре +4°С. Отмывку и элюцию проводят, как описано выше.

В другом случае верхнюю фазу после инкубации с преинкубационным материалом (чашкой Петри, в которой вместо клеток содержалась лишь среда) переносят на предварительно промытые клетки HeLa и инкубируют с ними в течение 40 минут при температуре +4°С, а далее верхнюю фазу переносят на клетки Hep-G2 и инкубируют с ними в течение 40 минут при температуре +4°С, после чего верхнюю фазу переносят на новую порцию клеток HeLa и клеток Hep-G2, повторяя комбинированную селекцию 2-3 раза. Конечную верхнюю фазу переносят на сосудистые гладкомышечные клетки и инкубируют в течение 40 минут при температуре +4°С.

В следующем варианте скрининга материал после селекции на иммортализованных типах клеток переносят на эндотелиальные клетки и/или фибробласты и лишь затем на сосудистые гладкомышечные клетки.

Пример 7. Выполнение комбинированного тестирования бактериофагов.

А. Иммуноферментный анализ

Специфичность индивидуальных фаговых частиц оценивают, используя их вместо первого антитела в прямом иммуноферментном анализе, где в качестве антигена выступают клетки-мишени и клетки, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию.

Для этого все используемые типы клеток культивируют в 96-луночных микропланшетах, инициируя культуру из расчета 10000 клеток на лунку. Клетки растят в течение 2-х суток, при этом проводят замену питательной среды каждые 24 часа, Затем микропланшеты промывают интенсивно 5 раз по 5 минут, используя каждый раз 200 мкл буфера HBSS. Далее инкубируют 10⁶-10⁷ фаговых частиц с клетками в течение 1 часа при температуре 4°С с интенсивной последующей отмывкой буфером HBSS и инкубацией со вторым антителом в течение 1 часа при комнатной температуре. В качестве второго антитела используют моноклональное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена и распознающее мотив из 11 аминокислот (Met-Ala-Ser-Met-Thr-(Gly)₂-(Gln)₂-Met-Gly) (Novagen, Cat. №69522), расположенный на N-конце белка №10, входящего в состав поверхности бактериофага Т7. Затем планшеты промывают вновь буфером HBSS и производят детекцию второго антитела, используя субстрат для пероксидазы, расщепление которого останавливают добавлением 50 мкл 1 М р-ра серной кислоты.

Б. Анализ на связывание

Связывание индивидуальных фагов исследуют, используя одношаговую селекцию, при которой анализируемый фаг тестируют параллельно, на связывание с клетками-мишенями и клетками, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию.

Для этого инициируют культуру клеток СГМК в чашках Петри диаметром 60 мм в расчете 64000 клеток на чашку и растят в течение 2-х суток. Одновременно в аналогичных чашках инициируют культуры эндотелиальных клеток, фибробластов, HeLa, Hep-G2 соответственно в количествах 48000, 24000, 16000, 16000 клеток на чашку и растят в течение 2-х суток. Используют 10⁹ фаговых частиц индивидуального фага, которые растворяют в 2 мл буфера HBSS. Такой раствор инкубируют сначала в течение 20 минут с преинкубационным материалом (чашкой Петри, в которой вместо клеток содержалась лишь среда) и потом переносят верхнюю фракцию на испытуемые клетки, предварительно промытые 5 раз буфером HBSS, длительностью по 5 минут каждый раз. При этом процедуру параллельно совершают как для сосудистых гладкомышечных клеток (клетки-мишени), так и для эндотелиальных клеток, фибробластов, клеток HeLa и Hep-G2 (клетки, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию), используя для всех типов клеток 2 режима температур: +4°С и +37°С. После инкубации не связавшиеся частицы интенсивно отмывают, используя буфер HBSS, после чего элюируют, используя 1 мл буфера для элюции. Определяют титр фагов в элюате и сравнивают полученные данные для всех типов клеток. При этом, чем больше отношение титра фагов, полученных после элюции с СГМК к титру фагов, полученных с других типов клеток, тем более специфичен фаг к СГМК и соответственно менее специфичен к другим типам клеток.

В. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Специфичность индивидуальных фагов тестируют, используя ПЦР для идентификации клонов, а также для анализа их количественного распределения при взаимодействии с клетками-мишенями.

Для этого инициируют культуру клеток СГМК в чашках Петри диаметром 60 мм в расчете 64000 клеток на чашку и растят в течение 2-х суток. Одновременно в аналогичных чашках инициируют культуры эндотелиальных клеток, фибробластов, HeLa, Hep-G2 соответственно в количествах 48000, 24000, 16000, 16000 клеток на чашку и растят в течение 2 суток. Фаговые частицы смешивают в эквивалентных количествах, обычно 10⁷ частиц каждого типа, из расчета на конечный объем раствора 2 мл. Полученный раствор инкубируют сначала в течение 20 минут с преинкубационным материалом (чашкой Петри, в которой вместо клеток содержалась лишь среда) и потом переносят верхнюю фракцию на испытуемые клетки, предварительно отмытые 5 раз буфером HBSS, длительностью по 5 минут каждый. При этом процедуру одновременно совершают как для сосудистых гладкомышечных клеток (клетки-мишени), так и для эндотелиальных клеток, фибробластов, клеток HeLa и Hep-G2 (клетки, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его течение, диагностику и терапию), используя для всех типов клеток 2 режима температур: +4°С и +37°С. После инкубации не связавшиеся частицы интенсивно отмывают, используя буфер HBSS, после чего связанные фаги элюируют, используя 1 мл буфера для элюции. Затем определяют титр фагов в элюате и рассеивают равные аликвоты элюата до получения единичных бляшек. Отбирают с каждой чашки 100 бляшек, распределяют их группами по две и выделяют ДНК посредством лизиса фаговых частиц. Для этого инкубируют фаговые частицы в 10 мМ растворе ЭДТА в течение 10 минут при температуре 65°С с последующим охлаждением и центрифугированием в течение 3 минут на 14000*g. Полученный раствор, содержащий ДНК бактериофага, используют в качестве матрицы для ПЦР по стандартной для данного вектора схеме, направляемой праймерами к участкам вектора (Т7 "Down" праймер: 5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'; Т7 "Up" праймер: 5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3') или специально разработанными праймерами. После этого определяют абсолютную частоту встречаемости каждого из фагов в зависимости от типа клеток.

Г. Тест на стабильность и способность интернализироваться.

Стабильность специфического фага, т.е. способность максимально долго сохранять свою функциональную эффективность в клетке, к которой он является специфичным и в самом организме хозяина, напрямую пересекается со способностью эффективно проникать в клетку и сохранять активность и специфически бомбардировать внутриклеточные мишени.

Для этого инициируют культуру клеток СГМК в чашках Петри диаметром 60 мм в расчете 64000 клеток на чашку и растят в течение 2-х суток. Одновременно в аналогичных чашках инициируют культуры эндотелиальных клеток, фибробластов, HeLa, Hep-G2 соответственно в количествах 48000, 24000, 16000, 16000 клеток на чашку и растят в течение 2 суток. 10¹⁰ фаговых частиц, представляющих фракцию, полученную после элюции фагов в результате 3-х раундов селекции многошаговым скринингом, инкубируют с сосудистыми гладкомышечными клетками при 2-х режимах температур: +4°С и +37°С и в течение различных периодов времени. Далее, клетки отмывают и лизируют в течение 10 минут, используя 2 мл буфера для лизиса (1 мл 2%-го р-ра дезоксихолиевой к-ты; 10 мМ Трис; 2 мМ ЭДТА, рН 8,0). После нейтрализации раствор, содержащий фаги, рассеивают до одиночных бляшек, которые затем отбирают с целью определения их нуклеотидной первичной последовательности, а также для проведения дополнительного тестирования.

Пример 8. Определение нуклеотидной первичной и кодируемой аминокислотной последовательности и их компьютерный анализ.

Последовательность ДНК участка генома вектора, представляющую вставку кДНК и ограниченную праймерами вектора, амплифицируют, используя ПЦР, и определяют ее нуклеотидную первичную последовательность с помощью автоматического секвенатора ABI Prism 310 (Applied Biosystems Inc.), руководствуясь рекомендованными производителем протоколами проведения реакций.

Используя специфические сигналы распознавания в векторе, нуклеотидную первичную последовательность транслируют в последовательность аминокислот пептида. Последовательность нуклеиновой кислоты и последовательность пептида проверяют на наличие гомологии с зарегистрированными последовательностями, находящимися в базах данных международных агентств. Для этого используют пакет программ компьютерного анализа - GCG или сходный пакет для автоматического анализа последовательностей, распространяемый Национальным Центром Биотехнологической Информации США.

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в диагностике, терапии и фармацевтической промышленности. Предлагаемый способ предусматривает конструирование бактериофаговой библиотеки случайных пептидов на основе кодирующих их олигонуклеотидных фрагментов, отбор бактериофагов, связывающихся с клетками-мишенями и не связывающихся с клетками других типов, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его диагностику и терапию, и подтверждение специфичности отобранных бактериофагов с помощью комбинации различных тестов. Причем олигонуклеотидные фрагменты, кодирующие случайные пептиды, получают реакцией обратной транскрипции с помощью случайных праймеров и суммарных РНК, выделенных из указанных клеток-мишеней и клеток других типов. Использование изобретения позволяет получить бактериофаги, связывающиеся с клетками-мишенями с высокой степенью селективности. 2 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ получения бактериофагов, специфично связывающихся с клетками-мишенями и предназначенных для терапевтических целей, предусматривающий конструирование фаговой библиотеки случайных пептидов на основе кодирующих их олигонуклеотидных фрагментов, ее скрининг для получения бактериофагов, связывающихся с клетками-мишенями, и подтверждение специфичности отобранных бактериофагов, отличающийся тем, что

- олигонуклеотидные фрагменты, кодирующие случайные пептиды, получают реакцией обратной транскрипции с использованием случайных праймеров и суммарных РНК клеток-мишеней и клеток других типов, которые могут быть вовлечены в патологический процесс или способны оказывать влияние на его диагностику и терапию;

- указанные олигонуклеотидные фрагменты встраивают в бактериофаговые векторы в правильной ориентации и используют для создания фаговых библиотек случайных пептидов для всех типов клеток, использованных для выделения суммарных РНК;

- скрининг полученных фаговых библиотек случайных пептидов проводят в два этапа, на первом из которых отбирают бактериофаги, способные связываться с клетками-мишенями, а на втором - из отобранных на первом этапе бактериофагов отбирают не связывающиеся с клетками других использованных типов;

- для подтверждения специфичности бактериофагов к клеткам-мишеням используют комбинацию различных тестов.