КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ IN VITRO Российский патент 2005 года по МПК A61K45/00 A61K31/575 A61P15/08 

Настоящее изобретение относится к твердому продукту, который может быть использован в связи с оплодотворением in vitro.

Предпосылки к созданию изобретения

Было обнаружено несколько веществ, активирующих мейоз (в данном тексте указанные вещества обозначены как MAS). Когда MAS находятся в среде, содержащей ооциты, они становятся более способными к оплодотворению. Однако основная проблема, связанная с применением MAS, заключается в том, что они имеют очень низкую растворимость.

Краткое описание сущности изобретения

Одной из целей данного изобретения является разработка композиции, содержащей MAS или их производные, которые могут растворяться в водной среде.

Другой целью изобретения является разработка композиции, содержащей MAS или их производные, которая может растворяться в водной среде без какого-либо физического воздействия, такого как нагревание, перемешивание или обработка ультразвуком.

Подробное описание настоящего изобретения

Растворимость предпочтительных MAS, т.е. FF-MAS, в воде является очень низкой, т.е. приблизительно 20 пикограмм/мл (соответственно 2×10^-5 мкг/мл), а в этаноле растворимость значительно выше, т.е. приблизительно 4 мг/мл. Согласно предварительным исследованиям самая высокая растворимость FF-MAS в смеси этанола и воды (1:2,5) составляет приблизительно 0,4 мг/мл. Несколько других MAS имеют подобную низкую растворимость в воде.

Неожиданно было обнаружено, что твердая композиция, содержащая MAS и добавку, хорошо растворяется в воде. Добавки представляют собой компоненты, добавление которых к MAS приводит к такой композиции, которая может быть использована для приготовления водного раствора, содержащего MAS.

Примерами добавок являются водорастворимые белки, такие как сывороточный альбумин, например сывороточный альбумин человека (обозначенный в данном тексте как HSA), необязательно в рекомбинантном виде, ферменты и фосфоглицериды, как, например, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит.

Предпочтительно, когда композиции согласно настоящему изобретению имеют содержание воды ниже 10%, предпочтительно ниже 5%, более предпочтительно ниже 1% (мас./мас.).

Предпочтительно, когда композиции согласно настоящему изобретению имеют содержание органического растворителя ниже 10%, предпочтительно ниже 5%, более предпочтительно ниже 1% (мас./мас.).

Предпочтительно, когда композиции согласно настоящему изобретению имеют содержание MAS ниже 1%, предпочтительно ниже 0,1%, более предпочтительно ниже 0,05% (мас./мас.).

Предпочтительно, когда композиции согласно настоящему изобретению имеют содержание добавки выше, чем 99%, более предпочтительно выше, чем 99,9%.

Предпочтительными композициями согласно настоящему изобретению являются такие, которые могут быть обработаны водной средой, не содержащей органический растворитель или содержащей его только в низких концентрациях, что приводит к раствору, содержащему MAS. Предпочтительно, когда указанная водные среда содержит менее чем 1%, предпочтительно менее чем 0,5%, более предпочтительно менее чем 0,1% органического растворителя (мас./мас.).

Предпринятые ранее попытки приготовить композиции, удовлетворяющие указанному требованию, оказались неудачными.

В данном тексте термин «вещества, активирующие мейоз» (MAS), означает соединения, которые опосредованно вызывают мейоз ооцитов. Точнее сказать, MAS являются соединениями, при испытании которых в примере 1, описанном ниже, распад зародышевого пузырька (в данном тексте обозначен как GVB), выраженный в процентах, был в значительной степени выше распада в контроле. Предпочтительными MAS являются такие вещества, которые способствуют GVB, составляющему, по крайней мере, 50%, предпочтительно, по крайней мере, 80%. Примерами предпочтительных MAS являются 4,4-диметил-5α-холеста-8,14,24-триен-3β-ол (в данном тексте обозначен как FF-MAS); гемисукцинат 4,4-диметил-5α-холест-8,14,24-триен-3β-ола; 5α-холест-8,14-диен-3β-ол; гемисукцинат 5α-холест-8,14-диен-3β-ола; (20S)-холест-5-ен-3β,20-диол; N-(метионин) амид 3β-гидрокси-4,4-диметил-5α-хола-8,14-диен-24-овой кислоты и холест-5-ен-16β-ол. Следующие примеры MAS упомянуты в WO 96/00235, 96/27658, 97/00884, 98/28323, 98/54965 и 98/55498, точнее сказать, в пункте 1 формулы изобретения.

Один из способов приготовления композиций согласно данному изобретению заключается в том, что смешивают раствор MAS в органическом растворителе, таком как этанол, с водным раствором добавки и после этого оставляют смесь до тех пор, пока растворитель не испарится. Испарение может быть ускорено применением устройства постоянного обдува над продуктом с помощью вакуума или любых других возможных способов удаления растворителя. Товарный продукт может представлять собой систему доставки, имеющую одно углубление или одну полость или более. Эти углубленные полости являются взаимно обозначенными полостями. По крайней мере, одна из этих полостей содержит композицию согласно настоящему изобретению. Подходящий способ заключения твердой композиции в полость включает вначале внесение раствора, содержащего MAS и добавку, в полость и после этого выпаривание раствора. В этом способе остаток после выпаривания, т.е. композиция согласно настоящему изобретению, находится прямо в полости указанного устройства (система доставки).

Поскольку композицию согласно настоящему изобретению предполагается использовать для обработки ооцитов, важным фактором является то, что данная композиция не содержит составных частей, отрицательно влияющих на ооциты.

Один из способов применения композиций согласно настоящему изобретению заключается в растворении композиции в водной среде, такой как вода, и затем, если желательно, добавлении составных частей, которые могут оказывать благоприятное воздействие на созревание ооцитов.

Другим способом применения композиции является растворение ее в среде, которая обычно используется для созревания in vitro.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые, однако, не должны истолковываться как ограничивающие объем защиты изобретения. Свойства, раскрытые в описании изобретения и в примерах, в любых их комбинациях, могут быть использованы для осуществления изобретения в его разнообразных видах.

Пример 1

Метод определения того, является ли вещество MAS или нет

Ооциты были получены от недоразвившихся самок мышей (C 57 BL/6J × DBA/2J Fl, Bomholtgaard, Denmark) весом 13-16 грамм, которых содержали при контролируемой температуре (20-22°С), освещении (освещение с 06.00 до 18.00) и относительной влажности (50-70%). Мышам внутрибрюшинно вводили 0,2 мл гонадотропинов (Gonal-F, Serono), содержащих 20 международных единиц (IU) фолликулостимулирующего гормона (FSH), и через 48 часов животных убивали путем сдвига шейных позвонков. Яичники удаляли, и ооциты изолировали в Нх-среду (см. ниже) под стереомикроскопом путем мануального разрыва фолликул, используя пару игл размером 27. Сферические ооциты, обнаруживающие интактный зародышевый пузырек (в тексте обозначен как GV), были разделены на ооциты, окруженные яйценосным бугорком (в данном тексте обозначены как СЕО), и голые ооциты (в данном тексте обозначены как NO) и помещали в α-минимальную поддерживающую essential среду (α-МЕМ без рибонуклеозидов, Gibco BRL, Cat. No. 22561), дополненную 3 мг/мл сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA, Sigma Cat. No. A-7030), 5 мг/мл сывороточного альбумина человека (HSA, State Serum Institute, Denmark), 0,23 ммоль пирувата (Sigma, Cat. No. S-8636), 2 ммоль глутамина (Flow, Cat. No. 16-801), 100 IU/мл пеницилина и 100 мкг/мл стрептомицина (Flow, Cat №16-700). Эту среду дополняли 3 ммоль гипоксантина (Sigma, Cat. No. H-9377) и обозначали как Нх-среда.

Ооциты промывали три раза в Нх-среде и однородные по размеру ооциты разделяли на группы СЕО и NO. СЕО и NO культивировали в 4-луночных планшетах (Nunclon, Denmark), в которых каждая лунка содержала 0,4 мл Нх-среды и испытуемое соединение в концентрации 10 мкмоль. Одну контрольную лунку (т.е. 35-45 ооцитов культивировали в идентичной среде без добавления испытуемого соединения) всегда содержали в условиях культивирования одновременно с 3 опытными лунками (35-45 ооцитов на лунку с добавленным испытуемым соединением).

Ооциты культивировали в увлажненной атмосфере воздуха, содержащей 5% СО₂, в течение 24 часов при 37°С. В конце периода культивирования число ооцитов с GV, GVB и полярными тельцами (в тексте обозначены как РВ) соответственно подсчитывали с помощью стереомикроскопа (Wildt, Leica MZ 12). Процент GVB, обозначенный как процент ооцитов, претерпевших GVB, на общее число ооцитов в указанной лунке, был рассчитан следующим образом:

%GVB=((число GVB + число РВ)/общее число ооцитов) × 100.

Пример 2

Метод определения того, можно ли использовать соединение в качестве добавки в композициях согласно настоящему изобретению или нет

Добавки для композиций, содержащих FF-MAS, характеризуются тем, что:

улучшают растворимость FF-MAS в смеси этанол/вода (1:2,5 об./об.);

способствуют тому, что раствор FF-MAS остается прозрачным после воссоздания композиции в α-МЕМ среде.

Полученный в результате исследований уровень GVB составил, по крайней мере, 50%, предпочтительно 80%, при испытании соединения на ооцитах, полученных от недоразвившихся самок мышей.

Приготовляли насыщенный раствор FF-MAS в этаноле. Смешивали с водным раствором добавки в отношении 1:2,5. Путем визуального осмотра контролировали, чтобы раствор содержал избыточное количество FF-MAS. Перемешивали раствор в течение 24 часов при комнатной температуре. Фильтровали раствор через фильтр с размером пор 0,22 мкм, определяли содержание FF-MAS с помощью ВЭЖХ и рассчитывали растворимость. Переносили 350 мкл раствора в 4-луночный планшет и оставляли выпаривать досуха при комнатной температуре. Добавляли 500 мкл альфа-МЕМ среды (Gibcobal). Если в течение получаса образовывался прозрачный раствор, то композицию испытывали на ооцитах, полученных от недоразвивишихся самок мышей. Полученный в результате исследований уровень GVB составлял, по крайней мере, 50%, предпочтительно 80%, см. пример 1.

Пример 3

Композиция, содержащая сывороточный альбумин человека (HSA)

В данном примере были получены три продукта. Как видно из таблицы, представленной ниже, основной раствор FF-MAS использовали для продукта 1, 2 и 3, содержащего 50, 500 и 3330 мкг/мл соответственно. Для каждого из продуктов основной раствор HSA содержал 20% HSA. Количество указанных используемых основных растворов представлено в таблице. Например, для продукта 1 основной раствор FF-MAS в количестве 400 мкл смешивали с 1000 мкл основного раствора HSA. После смешивания указанных основных растворов растворы были прозрачными и в них не наблюдали выпадение осадка. После перемешивания количество растворов, указанное в таблице, переносили в 4-луночные планшеты (Nuclon, Denmark). Например, для продукта 1 смесь в количестве 350 мкл переносили в планшет. Наконец, растворы выпаривали досуха при комнатной температуре. После выпаривания некоторые из продуктов образовывали опалесцирующую прозрачную пленку в планшетах, другие были невидны для человеческого глаза. Самая высокая концентрация FF-MAS, растворенного в данном примере, составляла 0,95 мг/мл.

Перед использованием 500 мкл альфа-МЕМ среды (Gibcobal) добавляли и получали прозрачный раствор FF-MAS и HSA в течение получаса при комнатной температуре.

 4-луночный планшет No. 14-луночный планшет No. 24-луночный планшет No. 3Раствор FF-MAS в этаноле, 50 мкг/мл400 мкл--Раствор FF-MAS в этаноле, 500 мкг/мл-400 мкл-Раствор FF-MAS в этаноле, 3,33 мг/мл--450 мклРаствор HSA в воде, 20%1000 мкл1000 мкл1125 мклКоличество, перенесенное в планшет350 мкл350 мкл525 мклСоотношение между FF-MAS и HSA1:100001:10001:150Внешний вид раствора до выпариванияПрозрачные бесцветные растворы без осадка

Пример 4

Композиции, содержащие сывороточный альбумин человека (HSA)

Аналогично описанному в предыдущем примере способу растворы FF-MAS в смеси вода/этанол, содержащие HSA, были получены в указанных ниже концентрациях путем простого смешивания при комнатной температуре. После приготовления растворы были прозрачными и осадка не наблюдалось. Растворы были перенесены в 4-луночные планшеты (Nuclon, Denmark). Наконец, растворы выпаривали досуха при комнатной температуре.

Перед использованием 500 мкл альфа-МЕМ среды (Gibcobal) добавляли и в течение получаса при комнатной температуре получали прозрачный раствор FF-MAS и HSA.

Композиции испытывали на ооцитах, полученных от недоразвившихся самок мышей. Уровни GVB, выраженные в процентах, для соответствующей композиции указаны в таблице ниже.

 4-луночный планшет No. 14-луночный планшет No. 24-луночный планшет No. 3Раствор FF-MAS в этаноле, 5,22 мкг/мл100 мкл--Раствор FF-MAS в этаноле, 26,1 мкг/мл-100 мкл-Раствор FF-MAS в этаноле, 261 мг/мл--100 мклРаствор HSA в воде, 20%250 мкл250 мкл250 мклСоотношение между FF-MAS и HSA1:100001:20001:200Теоретическое количество FF- MAS на лунку0,5 мкг2, 5 мкг25 мкг% GVB729391

Пример 5

Композиции, содержащие сывороточный альбумин человека (HSA)

Аналогично описанному в предыдущем примере способу растворы FF-MAS в смеси вода/этанол, содержащие HSA, были получены в указанных ниже концентрациях путем простого смешивания при комнатной температуре. После приготовления растворы были прозрачными и осадка не наблюдалось. Растворы были перенесены в 4-луночные планшеты (Nuclon, Denmark). Наконец, растворы выпаривали досуха при комнатной температуре.

Перед использованием 500 мкл альфа-МЕМ среды (Gibcoba-l) добавляли и в течение получаса при комнатной температуре получали прозрачный раствор FF-MAS и HSA.

Концентрацию FF-MAS после воссоздания определяли с помощью ВЭЖХ, полученные результаты указаны в таблице ниже.

Предложено: композиция для оплодотворения in vitro, система ее доставки (устройство). Композиция содержит стероид в количестве менее 5% (мас./мас.), а именно: 4,4-диметил-5α-холеста-8,14,24-триен-3β-ол, гемисукцинат 4,4-диметил-5α-холест-8,14,24-триен-3β-ола; 5α -холест-8,14-диен-3β-ол; гемисукцинат 5α-холест-8,14-диен-3β-ола; (20S)-холест-5-ен-3β,20-диол; N-(метионин)амид 3β-гидрокси-4,4-диметил-5α-хола-8,14-диен-24-овой кислоты или холест-5-ен-16β-ол, а также добавку (водорастворимый белок или фосфоглицерид). Система доставки имеет одно углубление или одну полость, содержащую указанную композицию в виде твердого продукта или раствора. Изобретение отличается тем, что композиция стеролов не содержит составных частей, отрицательно влияющих на ооциты, и может растворяться в водной среде без физического воздействия (т.е. нагревания, перемешивания, или обработки ультразвуком). 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Композиция, активирующая мейоз ооцитов для оплодотворения in vitro, содержащая стероид и добавку, отличающаяся тем, что активирующие мейоз стероиды содержатся в количестве менее 5% (мас./мас.) и представляют собой 4,4-диметил-5α-холеста-8,14,24-триен-3β-ол, гемисукцинат 4,4-диметил-5α-холест-8,14,24-триен-3β-ола; 5α-холест-8,14-диен-3β-ол; гемисукцинат 5α-холест-8,14-диен-3β-ола; (2OS)-холест-5-ен-3β,20-диол; N-(метионин)амид 3β-гидрокси-4,4-диметил-5α-хола-8,14-диен-24-овой кислоты или холест-5-ен-16β-ол, а добавкой является водорастворимый белок или фосфоглицерид.2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что стероидом является 4,4-диметил-5а-холеста-8,14,24-триен-3β-ол.3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что она может быть использована для приготовления водного раствора.4. Композиция по п.1, 2 или 3, отличающаяся тем, что представляет собой водный раствор, в котором содержанием стероида составляет, по крайней мере, 0,001 мкг/мл, предпочтительно, по крайней мере, 0,01 мкг/мл, более предпочтительно, по крайней мере, 0,1 мкг/мл, наиболее предпочтительно, по крайней мере, 0,5 мкг/мл.5. Композиция по пп.1, 2, 3 или 4, отличающаяся тем, что содержание стероида в водном растворе составляет не более чем 0,1 г/мл, предпочтительно не более чем 0,01 г/мл.6. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что дополнительно содержит органический растворитель в количестве менее чем 0,1%, предпочтительно менее чем 0,05%, наиболее предпочтительное менее чем 0,01%.7. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что добавкой является сывороточный альбумин человека, необязательно в рекомбинантном виде.8. Устройство, представляющее собой систему доставки, имеющее одно углубление или одну полость, содержащую композицию в виде твердого продукта или раствора по любому из предшествующих пунктов.