СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫМ ПРЕПАРАТАМ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины в частности к способу диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis (МБТ), к препаратам изониазиду и рифампицину у больных туберкулезом легких, путем определения нитратредуктазной активности МБТ при прямом посеве мокроты на питательную среду Левенштейна-Йенсена с противотуберкулезными препаратами.

Прототипом данного изобретения стал метод абсолютных концентраций (Meissener 1970, Приказ МЗ РФ № 109 от 21.03.03 г.).

Аналогом данного способа является разработанный в середине 90-х годов в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН ускоренный нитратредуктазный метод определения лекарственной чувствительности МБТ на среде Левенштейна-Йенсена (Голышевская В.И., Сафонова С.Г. Патент России RU №2099425 С1 "Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза").

В последние годы резко обострилась проблема лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза. Среди устойчивых штаммов возбудителя туберкулеза особую опасность представляют мультирезистентые штаммы M.tuberculosis, одновременно устойчивые к двум наиболее активным противотуберкулезным препаратам: изониазиду и рифампицину. Стоимость лечения больного туберкулезом обходится сегодня в 200 долларов США, а стоимость лечения больного с мультирезистентным туберкулезом превышает 5000 долларов.

Использование традиционных методов определения лекарственной чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам, таких как метод абсолютных концентраций, требует значительной затраты времени (5-7 недель). Длительные сроки получения результатов лекарственной чувствительности задерживают адекватный выбор лечения и способствуют распространению популяции штаммов МБТ с множественной лекарственной устойчивостью. Современные автоматические системы, а также молекулярно-генетические методы являются недоступными для рядовых бактериологических лабораторий из-за высокой стоимости и отсутствия специального оборудования.

Ускоренный нитратредуктазный метод, разработанный в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН, хотя и сокращает продолжительность исследования на 10-14 суток, тем не менее не позволяет решить проблему распространения штаммов МБТ с множественной лекарственной устойчивостью.

Очевидно, что сегодня существует острая необходимость в быстрых, недорогих и легко воспроизводимых методах определения лекарственной чувствительности МБТ. Быстрое выявление и изоляция больных-бактериовыделителей, носителей штаммов МБТ с множественной лекарственной устойчивостью позволят предотвратить распространение инфекции.

Отличие предлагаемого способа от всех предыдущих состоит в том, что определение лекарственной чувствительности M.tuberculosis происходит в течение 10-21 дня после посева клинического материала против 45-90 дней при методе абсолютных концентраций. Кроме того, метод не требует затрат на приобретение специального оборудования и расходных материалов, а также не требуются время и затраты на специальное обучение сотрудников лаборатории.

Принцип метода заключается в использовании активности фермента микобактерий туберкулеза - нитратредуктазы, для их ранней детекции роста с помощью реактива Грисса, когда на поверхности питательной среды видимого роста еще нет. Для этого перед свертыванием во весь объем питательной среды Левенштейна-Йенсена (см. Приказ МЗ РФ № 109 от 21.03.03 г., Приложение № 11, п.3.1) добавляют KNO₃ или NaNO₃ (из расчета 1000 мг соли на 1л питательной среды).

Отличительной особенностью метода является то, что один комплект для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза состоит из 3 контрольных пробирок, не содержащих противотуберкулезных препаратов, и пробирок с препаратами в следующих концентрациях: изониазид - 1 мкг/мл, рифампицин - 40 мкг/мл, всего 5 пробирок.

Образец мокроты, выделенный от больного туберкулезом с положительным результатом микроскопического исследования по Циль-Нильсену, обрабатывали 10%-ным раствором трехзамещенного фосфата натрия (Na₃PO₄) в течение 18-20 часов при температуре 37°С. Затем образец центрифугировали 20 мин при 3000 g. Осадок обработанной мокроты разбавляли дистиллированной водой до объема 1 мл и засевали по 0,2 мл в каждую пробирку со средой.

Засеянные пробирки выдерживают в термостате 10 дней. Затем в одну из контрольных пробирок добавляют 3-5 капель 7,5% раствора реактива Грисса. Если окрашивания поверхности среды не происходит, пробирки выдерживают в термостате еще 4 дня. Затем закапывают реактив Грисса во вторую контрольную пробирку, при отсутствии окрашивания пробирки выдерживали в термостате еще 7 дней и закапывали реактив в третью контрольную пробирку.

При наличии окрашивания в контрольной пробирке реактив закапывают в пробирки с препаратами.

В пробирке происходит изменение окраски среды, которая варьирует от малинового до бурого цвета. Слабо-фиолетовое окрашивание не учитывается. При окрашивании среды с препаратами микобактерии туберкулеза считаются устойчивыми к препаратам, при отсутствии окраски - чувствительными. Положительным контролем служит пробирка без противотуберкулезных препаратов.

Стандартный реактив Грисса, выпускаемый промышленностью, представляет собой смесь 1-нафтиламина (α-нафтиламин) с сульфаниловой кислотой или винной солью. Кроме того, реактив Грисса можно приготовить самостоятельно следующим образом:

раствор А. - 2 г сульфаниловой кислоты растворить в 250 мл 5N уксусной кислоты.

раствор Б. - 1,25 г α-нафтиламина растворить в 250 мл 5N уксусной кислоты.

5N уксусная кислота: 143 мл ледяной уксусной кислоты довести до 500 мл дистиллированной водой.

Растворы А и Б хранятся в посуде из темного стекла в холодильнике (до появления осадка, но не более 1 года).

Перед употреблением растворы А и Б смешивают в равных объемах, смешанные растворы хранить не следует. Полученный реактив Грисса используют сразу.

Клинический пример: Больной Н., поступил противотуберкулезный диспансер с диагнозом - туберкулез легких. Проведенное микроскопическое исследование показало значительное содержание кислотоустойчивых микобактерий в мокроте. Больному был назначен стандартный курс химиотерапии противотуберкулезными препаратами 1-го ряда: изониазид, рифампицин, пиразинамид, этамбутол. В то же время провели исследование лекарственной чувствительности прямым нитратредуктазным методом, через 10 дней получили результат: устойчивость к изониазиду и рифампицину. На основании полученных данных была проведена коррекция химиотерапии на раннем этапе лечения, что впоследствии повлияло на положительную динамику у больного. Кроме того, больного изолировали от других пациентов, предотвращая тем самым их заражение мультирезистентным туберкулезом. При отсутствии данной методики в лаборатории результат лекарственной чувствительности получили бы не ранее чем через 6-7 недель. Все это время больной Н. получал бы неадекватную химиотерапию и заражал других пациентов штаммами МБТ с множественной лекарственной устойчивостью.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам. Способ предусматривает отбор у больного мокроты, ее подготовку. Засев подготовленной мокроты в пробирки со средой Левенштейна-Йенсена. Выдерживание пробирок в термостате. Добавление реактива Грисса и учет результатов по изменению окраски питательной среды. Изобретение позволяет сократить сроки исследования лекарственной чувствительности. Снизить себестоимость способа определения чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам.

Способ диагностики чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам (ПТП) на основе питательной среды Левенштейна-Йенсена, дополнительно содержащей нитрат натрия или калия, включающий выделение культуры M.tuberculosis, отличающийся тем, что исследование проводится непосредственно на первичном клиническом материале (прямой метод) и с использованием нитратредуктазного теста.