ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ПРЕПАРАТ Российский патент 2007 года по МПК A61K33/24 A61P35/00 C01G30/02 

Изобретение относится к фторидным комплексным соединениям сурьмы (III), проявляющим цитотоксическую активность, которые могут найти применение в качестве противоопухолевых препаратов в медицине и ветеринарии, а также в качестве препарата для научных исследований.

Известно, что хемотерапия является одной из основных форм лечения раковых заболеваний, а следовательно, существует настоятельная необходимость в новых веществах, обладающих эффективностью по ингибированию роста опухолей.

Основу лекарственной терапии опухолей составляет принцип использования фармакологических средств цитотоксического или цитостатического действия, повреждающих опухолевые клетки. Вычисление необходимых доз цитостатиков осуществляется на основании данных экспериментальных исследований "in vitro", как правило, на моделях клеточных линий (Константинова М.М. «Возможности хрономодулирующей терапии в онкологии» Тезисы VI Российской онкологической конференции, 26-28 ноября 2002 года, г.Москва).

Известно, что в качестве противоопухолевых препаратов могут быть использованы оксидные соединения сурьмы (III) (Tiekink ERT "Antimony and bismuth compounds in oncology" Critical reviews in oncology hematology, v.14, №4, 257-262, 2002).

Обнаружена цитотоксическая активность оксида сурьмы Sb₂O₃, калий-антимонилтартрата KSbOC₄Н₄O₆ (PAT) и комплексов сурьмы (III) с основаниями Шиффа в отношении лейкемии (М.Т.Н.Tarafder, M.A.Ali и др. «Complexes of tridentate ONS Schiff base. Synthesis and biological properties». Transition Metal Chem., 25:456-460, 2000). Известно также, что калий-антимонилтартрат (PAT) обладает цитотоксической активностью в отношении четырех линий (HL60, К562,. KGla, U937) миелоидной лейкемии человека (S.Muller, W.H.Miller и др. «Trivalent Antimonials induce degradation of the PML-RAR α Oncoprotein and reorganization of the Promyelocytic Leukemia Nuclear bodies in Actute Promyelocytic Leukemia NB4 Cells», Blood, v.92, N 11, 4308-4316, 1998).

Известно использование PAT и при лечении карциномы (P.Naredi, D.D.Heath и др. «Cross-Resistance between Cisplatin and Antimony in a Human Ovarian Carcinoma Cell Line», Cancer Research, v.54, 6464-6468, 1994).

Противоопухолевой активностью обладают и комплексные соединения сурьмы(III) с аминополикарбоновыми кислотами (B.Hsu, Y.S.Kao, J.S.Tsai и др. «Pharmacological studies of several new antitumour agents», Scientia Sinica, v.13, No. 5, 791-800, 1964).

Фторидные комплексные соединения сурьмы (III) представляют собой многочисленный класс химических соединений, хорошо растворимых в воде, обладающий необычными электрофизическими, оптическими, пьезоэлектрическими (Avkhutskii L.M., Davidovich R.L., Zemnukhova L.A., Gordienko P.S., Urbonavicius V., Grigas J. - Peculiarities of Phase Transitions and Physical Properties in (NH₄)₂SbF₅ // Phys. Stat. Sol. (b). 1983. V.116. P.483-488; Борзенкова М.П., Калинченко Ф.В., Новоселова А.В., Ивановиц А.К., Сорокин Н.И. - Синтез и электропроводность фторантимонатов(III) щелочных металлов // Журн. неорган, химии. 1984. Т.29. №3. С.703-705; Panich A.M., Zemnukhova L.A., Davidovich R.L. - Incommensurability and Domain Structure of K₂SbF₅ // Z. Naturforsch. 2002. V.57a. P.456-460; Кавун В.Я., Земнухова Л.А., Сергиенко В.И., Кайдалова Т.А., Давидович Р.Л., Сорокин Н.И. - Исследование гептафтордиантимонатов(III) калия, рубидия и цезия методами ЯКР ¹²³Sb и ЯМР ¹⁹F. // Изв. АН. Серия химическая. 2002. №11. С.1842-1848.; Bergman I.G., Chenla D.S. - Linear and nonlinear optical properties of Na₂SbF₅ // J. Sol. Stat. Chem. 1978. №3. P.187-190; Самуленис В., Урбонавичюс В., Давидович Р.Л. - Скорость и поглощение ультразвука в области фазовых переходов в кристалле (NH₄)₂SbF₅ // Литовский физический сборник. 1987. Т.27. №3. С.361-365); Zemnukhova L.A., Davidovich R.L - ^121,123Sb and ²⁰⁹Bi Nuclear Qudrupole Resonance Study of Complexes compounds of Antimony(III) and Bismuth(III) in the temperature range 77-400 К // Z. Naturforrsch. 1998. V.53а. Р.573-584) и другими свойствами, что привело к их всестороннему исследованию различными физико-химическими методами.

Общая формула таких гомолигандных комплексных фторидных соединений сурьмы(III) для одновалентных катионов (М-Na, К, Rb, Cs, NH₄, Tl) определяется соотношением атомов фтора и сурьмы (F:Sb) в молекуле, которое принимает значения 3,25; 3,33; 3,50; 3,66; 3,75; 4,0 и 5,0 (Ковалева Е.В., Земнухова Л.А., Коньшин В.В. - Исследование фторидных комплексных соединений сурьмы(III) в растворе методом ЯМР ¹⁹F // Координационная химия. 2002. Т.28. №11. С.809-811). Например, соотношение F:Sb=3,33 соответствует соединению общей формулы MSb₃F₁₀, а соотношение F:Sb=5,00 - M₂SbF₅.

Способы получения фторидных комплексных соединений сурьмы(III), их строение и свойства известны (Давидович Р.Л., Земнухова Л.А. - Синтез и термическая устойчивость комплексных фторидов трехвалентной сурьмы // Координационная химия. 1975. Т.1. №4. С.477-481; Ryan R.R., Mastin S.H., Allen C. Larson. The Geometry of the Heptafluorodiantimonate Ion. The Crystal Structure of Cesium Heptafluorodiantimonate(III) // Inorg. Chem. 1971. V.10. №12. P.2793-2795; Удовенко А.А., Волкова Л.М., Гордиенко П.С., Давидович Р.Л., Стручков Ю.Т. Кристаллическая структура и фазовые переходы (NH₄)₂SbF₅ в интервале температур 311-123 К // Координационная химия. 1987. Т.13. №4. С.558-569; Удовенко А.А., Горбунова Ю.Е., Земнухова Л.А., Михайлов Ю.Н., Давидович Р.Л. - Кристаллическая структура пентадекафторотетраантимонатов(III) аммония и цезия, (NH₄)₃Sb₄F₁₅ и Cs₃Sb₄F₁₅ // Координационная химия. 2001. Т.27. №7. С.514-517; Удовенко А.А., Земнухова Л.А., Горбунова Ю.Е., Михайлов Ю.Н, Давидович Р.Л. - Кристаллическая структура тридекафторотетраантимоната (III) таллия, TlSb₄F₁₃ // Координационная химия. 2003. Т.29. №5. С.334-335).

Обнаружено, что большинство комплексных фторидов Sb(III) ингибируют процесс фотосинтеза водорослей и одновременно активизируют процесс их дыхания (Ковалева Е.В., Земнухова Л.А., Никитин В.М., Корякова М.Д., Спешнева Н.В. // Журнал прикладной химии. 2002. Т.75. №6. С.971-975).

Широкого практического применения эти соединения пока не нашли, кроме трехфтористой сурьмы SbF₃, которая используется в качестве фторирующего агента в органическом синтезе, в текстильной промышленности (Рысс И.Г. Химия фтора и его соединений. М., Госхимиздат, 1956, - 718 с) и для формирования прозрачной электропроводящей пленки (в.з. Японии №60-121272).

Задачей изобретения является расширение арсенала противоопухолевых средств за счет выявления новых свойств у известных химических соединений.

Поставленная задача решается применением в качестве противоопухолевого средства гомолигандных фторидных комплексных соединений сурьмы(III) с катионами одновалентных металлов, соотношение фтора к сурьме в которых находится в интервале от 3,25 до 5,0.

Заявителю впервые удалось обнаружить цитотоксическую активность гомолигандных фторидных комплексных соединений сурьмы(III), что позволяет предполагать возможность их использования в медицине и ветеринарии в качестве противоопухолевого средства.

Ни в одном из известных литературных источников заявителю не удалось обнаружить сведений о цитотоксической активности комплексных фторидных соединений трехвалентной сурьмы.

Определение цитотоксической активности.

Для определения цитотоксической активности использовали комплексные фторидные соединения сурьмы(III) с соотношением фтора и сурьмы в молекуле, равном 3,33 ( MSb₃F₁₀), 3,50 (MSb₂F₇), 4,0 (MSbF₄) и 5,0 (M₂SbF₅), где М - Na, К, Rb, Cs,NH₄,Tl.

Цитотоксическую активность определяли на моделях клеточной линии К562 эритролейкемии человека и тетраплоидной линии опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха.

В экспериментах использовали тетраплоидную линию опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха (Волколупова О.П., Макухо Л.В. // Антибиотики и химиотерапия. 1989. Т.34., No. 3. С.213-215.), которую поддерживали путем перевивки белым беспородньм мышам. Опухолевые клетки извлекали на 7-8 день развития опухоли. Цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам определяли по ингибированию синтеза ДНК (Wand M., Zeuthen E., Evans Е.А. // Science. 1967. V.157. Р.436-438) (включение в опухолевые клетки ³H-тимидина, вносимого из расчета 4,0 мкКи на 1 мл клеточной суспензии). Инкубационная смесь содержала 90 мкл суспензии опухолевых клеток (0,5-1,0×10⁶ клеток/мл) в среде №199 с добавлением пенициллина и стрептомицина (из расчета 250 ед. каждого антибиотика на 1 мл суспензий), 5% сыворотки крови плодов коров (СПК) и 10 мкл раствора исследуемого фторидного соединения сурьмы(III) или дистиллированной воды для контрольной пробы. Инкубацию проводили 2 часа при 37°С. Пробы наносили на бумажные фильтры ("Whatman 3MM") размером 1×1 см, высушивали на воздухе, последовательно промывали 5%-ным холодным раствором ТХУ (три порции по 5 мл) и этанолом (две порции по 5 мл). После высушивания фильтров уровень включения радиоактивной метки измеряли в толуольном сцинтилляторе на счетчике "Rackbeta" (LKB, Швеция). Цитотоксическую активность D (% ингибирования) рассчитывали по формуле:

где А₀ общая радиоактивность (имп/мин) контрольной пробы;

А - радиоактивность в исследуемой пробе;

за 100% включения метки принимали величину А₀.

На фиг.1 приведена зависимость процента ингибирования включения меченых предшественников в ДНК опухолевых клеток карциномы Эрлиха от концентрации внесенного вещества в пробе, где 1 - NH₄Sb₂F₇; 2 - NaSbF₄; 3 - CsSbF₄; 4 - NH₄SbF₄. Значения показателя ЛК₅₀, соответствующего концентрации вещества, при которой гибнет 50% клеток, представлены в таблице 1, летальные концентрации для опухолевых клеток карциномы Эрлиха, имеют значения в области 0,22-1,77·10^-5 моль·л^-1, что свидетельствует о цитотоксичном действии на опухолевые клетки карциномы Эрлиха представленных соединений, при этом наиболее токсичным соединением по действию является тетрафторантимонат(III)аммония, NH₄SbF₄(F:Sb=4,0).

Таблица 1№ соединенияСоединениеЛК₅₀·10^-5, моль·л^-11NH₄Sb₂F₇0.852NaSbF₄1.453CsSbF₄0.914NH₄SbF₄0.22

Цитотоксическое действие комплексных фторидных соединений сурьмы на клетки миелогенного лейкоза человека линии К562 определяли радиометрическим методом по измерению интенсивности включения меченного тритием (³Н) тимидина в ДНК опухолевых клеток эритромиелолейкоза человека К562, адаптированных для интенсивного размножения в условиях in vitro. За основу использована общепринятая иммунологическая методика (Иммунологические методы, под ред. Г.Фримеля (пер. с немецкого). М.: Медицина, 1987. 472 с.; Волколупова О.П., Макухо Л.В. // Антибиотики и химиотерапия. 1989. Т.34. №3. С.213-215). Клетки К562 культивировали в среде для размножения RPMI 1640 с АВ сывороткой (10%) во влажной атмосфере CO₂ (5%). Концентрацию клеток поддерживали на уровне 100 тыс. кл/мл. Пересев осуществляли на 3-й день культивирования. Опухолевые клетки-мишени в логарифмической фазе роста 3-кратно отмывали в минимальной среде (1,5 тыс. об/мин, 5 мин). Действие веществ исследовали в диапазоне концентраций 10^-6-10^-1 моль·л^-1 в микропланшетах на 96 лунок, с концентрацией клеток 1 млн в мл инкубационной среды (RPMI 1640; АВ сыворотка, 5% сыворотка крови АВ человека; 2 мМ глутамин; пенициллин, 100 Ед/мл; стрептомицин, 100 мкг/мл; ³Н-тимидин, 2,5-5 мкКю/мл). Инкубацию проводили 3 часа при 37°С во влажной атмосфере CO₂ (5%). Клеточные суспензии с помощью харвестера переносили на специальные бумажные фильтры, промывали физиологическим раствором и осаждали 80%-ным этиловым спиртом. Фильтры сушили при комнатной температуре и переносили в сцинтилляционные флаконы с 4 мл ЖС-1 для определения радиоактивности на β-счетчике.

Цитотоксическую активность (D, % ингибирования) рассчитывали аналогично опытам с клетками карциномы Эрлиха по формуле (1).

Оценку цитостатического действия образцов на опухолевые клетки проводили по величине ЛК₅₀ - концентрации вещества, вызывающей подавление включения меченого тимидина в ДНК клеток К562 на 50%.

На фиг.2 приведена оценка токсического действия фторидных соединений сурьмы (III) по величине ЛК₅₀, характеризующей концентрацию вещества, при которой подавляется 50% опухолевых клеток.

Полученные данные свидетельствуют о том, что гомолигандные фторидные комплексные соединения сурьмы (III) с одновалентными катионами, в которых соотношение атомов фтора и сурьмы лежит впределах от 3,25 до 5,00, оказывают ингибирующее действие на опухолевые клетки К562, эффект которого зависит от состава и концентрации вещества. В однотипных по составу группах фторидных комплексов сурьмы(III) наблюдается зависимость токсичности от природы катиона, за исключением соединений с NH₄ ⁺: все фтороантимонаты(III) аммония проявляют одинаковую токсичность.

Таким образом, полученные данные о высокой цитотоксической активности фторидных комплексных соединений сурьмы(III) с катионами одновалентных металлов позволяют рассматривать их в качестве перспективных веществ для создания на их основе новых противоопухолевых препаратов.

Изобретение относится к медицине и лекарственным средствам, а именно, к применению гомолигандных фторидных комплексных соединений сурьмы (III) с катионами одновалентных металлов, соотношение атомов фтора к сурьме в которых находится в интервале от 3,25 до 5,0, в качестве противоопухолевого средства.

Технический результат изобретения - расширение арсенала противоопухолевых средств за счет выявления новых свойств у известных соединений. 1 табл., 2 ил.

Применение гомолигандных фторидных комплексных соединений сурьмы (III) с катионами одновалентных металлов, соотношение атомов фтора к сурьме в которых находится в интервале от 3,25 до 5,0, в качестве противоопухолевого средства.