ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА HAEMOPHILUS Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12R1/21 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается увеличения ростовых свойств питательной среды по отношению к бактериям рода Haemophilus - в частности Н.influenzae типа b - одного из трех основных возбудителей гнойного бактериального менингита, а также в отношении бескапсульного штамма Н.influenzae №8143 и штамма другого вида - Н.parainfluenzae.

Изобретение может быть использовано в медицине, в микробиологии, в микробиологической промышленности в процессе приготовления питательных сред.

Изобретение заключается в том, что в известной питательной среде, содержащей источник азотного питания (ферментативный гидролизат крови животных - аминопептид), гидролизат казеина средней степени расщепления, экстракт кормовых дрожжей (источник витаминов), НАД, гемин, соль, в качестве источника факторов роста используют экстракт семян льна.

Прототипом служит питательная среда для получения рестриктирующих эндонуклеаз из бактерий рода Haemophilus. При выращивании на агаровых вариантах этих питательных сред Н.influenzae и Н.parainfluenzae образуют мелкие колонии (около 0,5 мм в диаметре) и в мазках из этих колоний, окрашенных по Граму, отмечены типичные мелкие грамотрицательные палочки, очень полиморфные, часто встречаются нитевидные формы и кроме того остатки разрушенных клеток.

Цель изобретения: разработка рецептуры питательной среды, обеспечивающей увеличение жизнеспособности клеток Н.influenzae b, бескапсульного штамма Н.influenzae и Н.parainfluenzae, определяемой по KOE, и диаметра выросших колоний, а также уменьшения полиморфизма клеток в мазках, что облегчает (способствует использованию) использование питательной среды в лабораторной практике.

Цель достигается тем, что в качестве препарата, дополнительно стимулирующего рост гемофильных бактерий, используется растительный экстракт, приготавливаемый из семян льна и добавляемый к ранее запатентованной среде в количестве 0,21-0,27 мас.%. Предлагаемая среда лишена этих недостатков, т.е. Н.influenzae b образуют колонии диаметром около 1 мм (почти в 2 раза крупнее - на 180% при р=0,05) и KOE - 200% по сравнению с прототипом (при р=0,05); в мазках - более однородные грамотрицательные палочки. Такие же результаты получены в отношении бескапсульного штамма Н.influenzae и Н.parainfluenzae.

Питательную среду готовят следующим образом.

К ингредиентам предложенной ранее питательной среды, в заданном соотношении, включая глюкозу и агар, добавляют водный экстракт семян льна, который получают после добавления к семенам льна кипящей дистиллированной воды (1:20), 3 часов экстракции в процессе остывания, осветления через марлевый фильтр. Для хранения экстракт семян льна стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. В питательную среду после стерилизации также при 121°С в течение 15 мин и остывания до 45-50°С добавляют необходимые для гемофилов факторы роста - НАД и гемин (10 мкг/мл) и готовую питательную среду разливают в чашки Петри.

Выращивание Н.influenzae и Н.parainfluenzae, проводят при 37°С в течение 18-24 часов.

Процент жизнеспособных клеток определяют по КОЕ (высев из разведения 10^-6 исходной взвеси густотой 10 ед.), диаметр колоний - путем их измерения с использованием специальной сетки с ценой деления 0,01 мм, морфологию клеток - в мазках из колоний, окрашенных по Граму.

Пример 1 (оптимальный). Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Аминопептид0,8Гидролизат казеина0,8Дрожжевой экстракт0,4Экстракт семян льна0,24НАД0,001Гемин0,001Глюкоза0,2Хлорид натрия (NaCl)0,3Карбонат натрия (Na₂CO₃)0,06Агар1,3Дистиллированная водаостальное

Пример 2 (минимальный). Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Аминопептид0,75Гидролизат казеина0,75Дрожжевой экстракт0,35Экстракт семян льна0,21НАД0,001Гемин0,001Глюкоза0,2Хлорид натрия (NaCl)0,3Карбонат натрия (Na₂CO₃)0,06Агар1,3Дистиллированная водаостальное.

Пример 3 (максимальный). Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Аминопептид0,8Гидролизат казеина0,8Дрожжевой экстракт0,4Экстракт семян льна0,24НАД0,001Гемин0,001Глюкоза0,2Хлорид натрия (NaCl)0,3Карбонат натрия (Na₂CO₃)0,06Агар1,3Дистиллированная водаостальное.

Данные по КОЕ, диаметру колоний и морфологии клеток изученных штаммов на предлагаемой и известной среде приведены в табл.1.

Таблица 1Наименование штаммаПитательная средаПоказатели качества сред:при высеве из 10⁶морфология клеток в мазкеКОЕдиаметр колоний, ммН.influenzae bПредлагаемая (оптимальный вариант)1970,93довольно однородные тонкие палочки р=0,05^*p=0,05^* Среда сравнения (прототип)980,51полиморфные палочки, встречаются нитевидные формы и остатки разрушенных клетокН.influenzae, бескапсульный штаммПредлагаемая (оптимальный вариант)1720,89довольно однородные тонкие палочки p=0,05^*p=0,05^* Среда сравнения (прототип)900,48полиморфные палочки, встречаются нитевидные формы и остатки разрушенных клетокH.parainfluenzaeПредлагаемая (оптимальный вариант)2120,97довольно однородные тонкие палочки p=0,05^*p=0,05^* Среда сравнения (прототип)1100,54полиморфные палочки, встречаются нитевидные формы и остатки разрушенных клеток* по непараметрическому критерию "u" (Вилкоксона-Манна-Уитни).

Качественные характеристики используемых экстрактов и гидролизата

- Кислотный гидролизат казеина средней степени расщепления

Аминный азот - (0,34-0,40)%

Общий азот - (0,55-0,65)%

Степень расщепления белка - 0,57-0,67

Содержание хлоридов - (1,6-1,8)%

рН 4,5-4,7

- Дрожжевой экстракт

Возможно использование экстракта кормовых дрожжей (ЭКД) или импортного дрожжевого экстракта (ДЭ)

ЭКД - аминный азот - (1,9-2,3)%; рН 5,2-6,2

ДЭ - аминный азот - (2,0-3,0)%; рН 6,5-7,0

- Экстракт семян льна

20 г лекарственной формы «льна семена» заливают 400 мл кипящей дистиллированной воды (1:20), настаивают 2 ч, фильтруют;

сухой остаток - (0,5-0,7)%; рН 5,7-6,1.

Кроме приведенной области применения предложенная питательная среда может служить основой в следующих случаях:

- при дифференциации бактерий рода Haemophilus в случае исключения из состава среды фактора роста - гемина выросшие колонии не будут относиться к виду Н.influenzae; при исключении и НАД, и гемина выросшие колонии не относятся к бактериям рода Haemophilus, нуждающимся в одном из перечисленных факторов роста;

- при добавлении соответствующих ингибирующих добавок среда может служить основой для селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus - путем добавления бацитрацина (100 мкг/мл).

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в медицине, в микробиологии в процессе приготовления питательной среды по отношению к бактериям рода Haemophilus. Питательная среда содержит аминопептид, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, экстракт семян льна, глюкозу, карбонат натрия, НАД, гемин, хлорид натрия, агар и дистиллированную воду. Изобретение позволяет увеличить жизнеспособность клеток и уменьшить полиморфизм клеток в мазках. 1 табл.

Питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus, содержащая источники азотного питания, витаминов, НАД, гемин, хлорид натрия, карбонат натрия, глюкозу, агар и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она содержит в качестве стимулятора роста экстракт семян льна при следующем соотношении компонентов, мас.%:

аминопептид0,75-0,85гидролизат казеина0,75-0,85дрожжевой экстракт0,35-0,45экстракт семян льна0,21-0,27НАД0,001гемин0,001глюкозу0,2хлорид натрия0,3карбонат натрия0,06агар1,3дистиллированная водаостальное