СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ БИОМАССЫ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ ПО ОТНОШЕНИЮ К ПАТОГЕННЫМ МИКОБАКТЕРИЯМ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Способ оценки антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы анаэробных бактерий по отношению к патогенным микобактериям

Изобретение относится к микробиологии, касается способа оценки антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы анаэробных бактерий, в частности бифидобактерий, по отношению к патогенным микобактериям, и может быть использовано для отбора препаратов-пробиотиков медицинского и ветеринарного назначения, эффективных при микобактериозах.

Известен способ контроля антагонистической активности производственных штаммов Bifidobacterium bifidum (шт. №№1, 791 и ЛВА-3) по отношению к условно патогенным индикаторным бактериям методом отсроченного антагонизма, включающим регидратацию лиофилизированного штамма, его культивирование на поверхности жидкой питательной среды МРС-5 в анаэробных условиях с подсевом к выросшей культуре жидкой культуры какого-либо одного индикаторного штамма /1/.

Антагонистическую активность пробиотиков и бактериальных штаммов можно определить in vitro регламентированными способами, включающими регидратацию лиофилизированного штамма и совместное культивирование с индикаторными культурами в жидкой или на плотной питательной среде /2/. Определение антагонистической активности пробиотиков по отношению к индикаторным штаммам методом прямого антагонизма рассматривается нами в качестве предпочтительного аналога.

Общим недостатком известных способов является их неэффективность при определении антагонистической активности пробиотиков по отношению к микобактериям из-за особенностей биологии последних, касающихся скорости роста и требований к питательным средам, что затрудняет совместное культивирование с другими микроорганизмами.

Цель изобретения - повышение эффективности.

Поставленная цель достигается использованием для совместного культивирования среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин0,4 гкалий фосфорнокислый двузамещенный0,05 гсернокислый магний0,05 глимонная кислота0,2 глимоннокислое аммиачное железо0,005 гпируват натрия0,05 гглицерин4,0 гагар3,0 ггумивит10,0 млводный раствор желтка куриного яйца (1:1)10,0 млдистиллированная водадо 100,0 мл,

причем исследуемый материал вносят в количестве 8-16% от общего объема среды, а антагонистическую активность оценивают по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением среды культивирования (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика (опыт).

Способ осуществляется следующим образом.

Ампулу с сухим пробиотиком вскрывают и регидратируют 0,9% раствором натрия хлорида. В стерильную пробирку с расплавленной и охлажденной до 70°С средой, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду, инокулируют пробиотик в количестве 8-16% от общего объема среды, после чего среду скашивают, на поверхность косячка осуществляют посев индикаторного штамма с последующим культивированием при температурном (37°С) и временном (30 дней) оптимуме. Контроль - косячки расплавленной и охлажденной до 70°С среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду, с добавлением среды культивирования пробиотического штамма в количестве 8-16%.

Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 200 мл наливают 30,0 мл дистиллированной воды, прогревают на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяют последовательно 0,2 г лимонной кислоты, 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г сернокислого магния, 0,05 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 10,0 мл гумивита и 3,0 г агара. Каждый компонент добавляют после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов устанавливают рН 7,1-7,2 10% раствором натрия гидроокиси, общий объем доводят до 90,0 мл стерильной дистиллированной водой. Раствор автоклавировают в течение 30 минут при 1 атм. Свежие куриные яйца хорошо промывают в проточной воде, протирают 96° этиловым спиртом, разбивают в стерильных условиях и отделяют белок от желтка. В стерильной колбе смешивают желток и дистиллированную воду в соотношении 1:1, 10,0 мл полученного раствора добавляют в расплавленную агаровую среду и перемешивают.

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром), представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот /3/. Раствор солей гумусных кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов /4, 5/. Гумивит - жидкость от темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.

Исследования проводили с использованием пробиотического препарата бифидобактерин (ИмБио, г.Нижний Новгород), представляющего собой лифолизированную биомассу живых бифидобактерий Bifidobacterium bifidum.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Оценка антагонистической активности бифидобактерина (ИмБио, г.Нижний Новгород) по отношению к референс-штаммам M.tuberculosis (шт.Academia), M.avium (шт.ГИСК), M.bovis (шт.Vallee, Ravenal)

Ампулу с сухим пробиотиком вскрывали и регидратировали 0,9% раствором натрия хлорида с температурой 15-20°С из расчета 1 мл на одну дозу препарата. Продолжительность регидратации при интенсивном встряхивании составляла 2-5 минут. В стерильную пробирку с 3,0 мл расплавленной и охлажденной до 70°С средой, содержащей 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,05 г сернокислого магния, 0,2 г лимонной кислоты, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 3,0 г агара, 10,0 мл гумивита, 10,0 мл водного раствора желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду (до 100,0 мл), инокулировали пробиотик в количестве 10% от общего объема среды (0,3 мл), после чего среду скашивали, на поверхность косячка осуществляли посев индикаторного штамма с последующим культивированием при температурном (37°С) и временном (30 дней) оптимуме. Контроль - косячок (3,0 мл) расплавленной и охлажденной до 70°С среды, содержащей 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,05 г сернокислого магния, 0,2 г лимонной кислоты, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 3,0 г агара, 10,0 мл гумивита, 10,0 мл водного раствора желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду (до 100,0 мл) с добавлением среды Блаурокка в количестве 10% от общего объема среды (0,3 мл). Антагонистическую активность оценивали по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт). Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Оценка антагонистической активности бифидобактерина по отношению к патогенным микобактериямКоличество пробиотика, % от общего объема средыИндекс блокирования роста*M.avium ГИСКM.tuberculosis AcademiaM.bovis ValleeM.bovis Ravenal10,01010610Примечание: Индекс блокирования роста - отношение количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением среды Блаурокка (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика (опыт).

Пример 2. Эффективность способа оценки антагонистической активности бифидобактерина (ИмБио, г.Нижний Новгород) по отношению к референс-штаммам M.tuberculosis (шт.Academia), M.avium (шт.ГИСК), M.bovis (шт.Vallee, Ravenal в зависимости от количества пробиотика

Схема оценки антагонистической активности, как в примере 1. Результаты-представлены в таблице 2.

Таблица 2
Антагонистическая активность бифидобактерина по отношению патогенным микобактериямКоличеств пробиотика, % отобщего объема средыИндекс блокирования роста*M.avium ГИСКM.tuberculosis AcademiaM.bovis ValleeM.bovis Ravenal2,011214,01052108,0101041016,01010101032,010101010Примечание: Индекс блокирования роста - отношение количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением среды Блаурокка (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика (опыт).

Пример 3. Эффективность способа оценки антагонистической активности бифидобактерина (ИмБио, г.Нижний Новгород) по отношению к клиническим штаммам M.bovis (№№2 и 3) и M.avium (№4), выделенным из лимфатических узлов крупного рогатого скота с подтвержденным диагнозом на туберкулез, в зависимости от количества пробиотика. Схема определения антагонистической активности, как в примере 1. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Антагонистическая активность бифидобактерина по отношению к патогенным микобактериямКоличество пробиотика, % от общего объема средыИндекс блокирования роста*M.avium №4M.bovis№2№32,01114.032108,05101016,010101032,0101010Примечание: Индекс блокирования роста - отношение количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением среды Блаурокка (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика (опыт).

Проведенные исследования подтвердили возможность оценки антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы анаэробных бактерий способом в соответствии с изобретением. Полученные результаты свидетельствуют о сопоставимости показателей антагонистической активности пробиотиков по отношению к референс-штаммам и клиническим изолятам, полученным от крупного рогатого скота с подтвержденным диагнозом на туберкулез. Применение способа предполагает наличие параметров величины индекса блокирования роста и концентрации исследуемого материала для каждого препарата. Способ прост в осуществлении и может быть использован в качестве основного или дополнительного теста при определении антагонистической активности пробиотиков на основе бактерий и их метаболитов.

Источники информации

1. Бифидобактерин сухой. ФС 42-3947. 12.07.2000.

2. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. Проф. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987, С.341-343.

3. Гришин Г.И., Слинина К.Н. // Практик. - 2004. - №3-4. - С.80-82.

4. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Марков С.Е., 1999. - 198 с.

5. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфа // Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.

Для совместного культивирования при температурном и временном оптимуме бактерий используют среду, содержащую: L-аспарагин 0,4 г, калий фосфорнокислый двузамещенный 0,05 г, сернокислый магний 0,05 г, лимонную кислоту 0,2 г, лимоннокислое аммиачное железо 0,005 г, пируват натрия 0,05 г, глицерин 4,0 г, агар 3,0 г, гумивит 10,0 мл, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) 10,0 мл, дистиллированную воду до 100,0 мл. Исследуемую пробу пробиотика вносят в среду в количестве 8-16% от объема среды. Посев культуры индикаторного штамма ведут на поверхность косячка. Антагонистическую активность оценивают по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде с добавлением среды Блаурокка в количестве 10% от объема среды, к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде после внесения в нее пробиотика. Это обеспечивает повышение эффективности способа прямого антагонизма. 3 табл.

Способ оценки антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы анаэробных бактерий по отношению к патогенным микобактериям, включающий внесение исследуемой пробы пробиотика в количестве 8-16% от объема среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорно-кислый двузамещенный, серно-кислый магний, лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин0,4, гкалий фосфорно-кислый двузамещенный0,05 гсерно-кислый магний0,05 глимонная кислота0,2 глимонно-кислое аммиачное железо0,005 гпируват натрия0,05 гглицерин4,0 гагар3,0 ггумивит10,0 млводный раствор желтка куриного яйца (1:1)10,0 млдистиллированная водадо 100,0 мл,

последующее скашивание среды, посев культуры индикаторного штамма на поверхность косячка, культивирование при температурном и временном оптимуме, при этом антагонистическую активность оценивают по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде с добавлением среды Блаурокка в количестве 10% от объема среды, к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде после внесения в нее пробиотика.