СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БИФИДОБАКТЕРИЙ ПО ОТНОШЕНИЮ К МИКОБАКТЕРИЯМ И РОДОКОККАМ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к микробиологии, касается способа определения антагонистической активности бифидобактерий по отношению к микобактериям и родококкам и может быть использовано для отбора препаратов-пробиотиков медицинского и ветеринарного назначения, эффективных при микобактериозах и родококкозах.

Известен способ выявления антагонистической активности производственных штаммов Bifidobacterium bifidum (шт. №№1, 791 и ЛВА-3) по отношению к условно патогенным индикаторным бактериям методом отсроченного антагонизма. Для этого 0,1 мл культуры бифидобактерий из разведения 10^-7 наносят на поверхность жидкой питательной среды МРС-5 и культивируют 72 часа при 37° в анаэробных условиях. Затем для изучения антагонистической активности бифидобактерий по отношению к Shigella, E.coli, S.aureus, Protei к выросшей культуре подсевают 0,1 мл 18-часовой жидкой культуры какого-либо одного индикаторного штамма /1/.

Известен способ определения антагонистической активности бифидобактерий по отношению к условно патогенным индикаторным бактериям по P.Muriana и T.Klaenhammer /2/. Для этого 0,1 мл 16-часовой культуры бифидобактерий из разведения 10^-7 наносят на поверхность твердой питательной среды Бактофок и культивируют 48 часов при 37,5°С в анаэробных условиях. Затем для изучения антагонистической активности бифидобактерий по отношению к K.ozaenae, E.coli, S.aureus, E.faecalis выросшие колонии тестируемого микроорганизма заливают 3,5 мл расплавленной и остуженной до 50°С полужидкой (0,75% агара) среды Brain Heart Infusion, в которую предварительно вносят 0,1 мл 18-часовой жидкой культуры одного индикаторного штамма. При изучении антагонистической активности штаммов бифидобактерий к P.aeruginosa на чашки с выросшими колониями бифидобактерий наносят 3,5 мл 1,5% агара на основе Brain Heart Infusion. После остывания этого промежуточного слоя на его поверхность наносят 0,1 мл 12-часовой культуры индикаторного штамма из разведения 10^-1 и растирают на поверхности агара. После 18-часовой инкубации в аэробных условиях при 37°С измеряют радиусы зон задержки роста индикаторных штаммов вокруг колоний бифидобактерий. При изучении ингибирующей способности штаммов бифидобактерий по отношению к G.vaginalis готовят суспензию индикаторных штаммов, содержащую 9,0×10 м.к./мл. 100 мл суспензии смешивают с 3,5 мл расплавленной и остуженной до 50°С полужидкой (0,75% агара) среды, ресуспендируют и заливают на выросшие колонии бифидобактерий.

Цель изобретения - способ определения антагонистической активности бифидобактерий по отношению к микобактериям и родококкам.

Поставленная цель достигается способом определения антагонистической активности бифидобактерий, включающим внесение бифидобактерий в жидкую питательную среду, культивирование при температурном и временном оптимуме с последующей агаризацией и нанесением на агаризированную среду с выросшими бифидобактериями питательной среды, удовлетворяющей пищевые потребности микобактерий и родококков, на поверхность которой наносят культуру индикаторного штамма, а антагонистическую активность оценивают по индексу блокирования роста. Для выращивания индикаторных штаммов используют среду, содержащую L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин0,4 гкалий фосфорнокислый двузамещенный0,05 гсернокислый магний0,05 глимонная кислота0,2 глимоннокислое аммиачное железо0,005 гпируват натрия0,05 гглицерин4,0 гагар3,0 ггумивит10,0 млводный раствор желтка куриного яйца (1:1)10,0 млдистиллированная водадо 100,0 мл

Способ осуществляется следующим образом.

10 мкл суспензии, содержащей 5×10⁴ КОЕ бифидобактерий, вносят в 2,5 мл жидкой среды Блаурокка и культивируют 96 часов при 37°С. Выросшие колонии тестируемого штамма смешивают с 2,5 мл расплавленного в физиологическом растворе и остуженного до 70°С агара (5%), после скашивания наслаивают среду, содержащую L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду, на поверхность которой наносят 10 мкл суспензии индикаторного штамма, обеспечивающей рост 20-60 КОЕ в контроле. Индекс блокирования роста определяют после 30-дневной инкубации при 37°С.

Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 200 мл наливают 30,0 мл дистиллированной воды, прогревают на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяют последовательно 0,2 г лимонной кислоты, 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г сернокислого магния, 0,05 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 10,0 мл гумивита и 3,0 г агара. Каждый компонент добавляют после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов устанавливают рН 7,1-7,2 10%-ным раствором NaOH, общий объем доводят до 90,0 мл стерильной дистиллированной водой. Раствор автоклавируют в течение 30 минут при 1 атм. Свежие куриные яйца хорошо промывают в проточной воде, протирают 96° этиловым спиртом, разбивают в стерильных условиях и отделяют белок от желтка. В стерильной колбе смешивают желток и дистиллированную воду в соотношении 1:1 и 10,0 мл полученного раствора добавляют в расплавленную агаровую среду и перемешивают.

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром), представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот /3/. Раствор солей гумусных кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов /4, 5/. Гумивит - жидкость темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Определение антагонистической активности штамма бифидобактерий B.bifidum ЛВА-3 (препарат бифидумбактерин, ИмБио, Н.Новгород) по отношению к M.tuberculosis (шт.Academia), M.avium (шт.ГИСК), M.bovis (шт.Vallee, Ravenal).

Сухую биомассу бифидумбактерина (на основе штамма B.bifidum ЛВА-3) в ампуле или флаконе растворяли 0,9%-ным раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на дозу препарата. Во флакон с 2,5 мл среды Блаурокка вносили 10 мкл суспензии, содержащей 5×10⁴ КОЕ бифидобактерий, и культивировали 96 часов при 37°С. Выросшие колонии тестируемого штамма смешивали с 2,5 мл расплавленного в физиологическом растворе и остуженного до 70°С агара (5%). Агаризированную среду с выросшей культурой бифидобактерий скашивали и на полученные «косячки» наслаивали 3 мл среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду и скашивали. На поверхность наносили по 10 мкл суспензии каждого индикаторного штамма, обеспечивающей рост 20-60 КОЕ в контроле. Контроль - агаризированная среда Блаурокка с наслоенной средой как в опыте. Индекс блокирования роста как отношение количества колоний, выросших в контроле, к количеству колоний, выросших в опыте, определяли после 30-дневной инкубации при 37°С. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1:
Антагонистическая активность штамма бифидобактерий по отношению к патогенным микобактериям Индекс блокирования ростаШтамм бифидобактерийM.avium ГИСКM.tuberculosis AcademiaM.bovis ValleeM.bovis RavenalB.bifidum ЛВА10101010

Пример 2. Определение антагонистической активности штамма бифидобактерий B.bifidum ЛВА-3 (препарат бифидумбактерин, ИмБио, Н.Новгород) по отношению к клиническим штаммам микобактерий M.avium (шт.4), M.bovis (шт.2, 3) и M.vaccae (шт.296), выделенным от крупного рогатого скота. Схема изучения антагонистической активности, как в примере 1. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2:
Антагонистическая активность штамма бифидобактерий по отношению к патогенным микобактериям Индекс блокирования ростаШтамм бифидобактерийM.avium 4M.vaccae 296M.bovis 2M.bovis 3B.bifidum10101010

Пример 3. Определение антагонистической активности штамма бифидобактерий B.bifidum ЛВА-3 (препарат бифидумбактерин, ИмБио, Н.Новород) по отношению к родококкам Rhodococcus equi 6, 12, 13.

Сухую биомассу бифидумбактерина (на основе штамма B.bifidum ЛВА-3) в ампуле или флаконе растворяли 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на дозу препарата. Во флакон с 2,5 мл среды Блаурокка вносили 10 мкл суспензии, содержащей 5×10⁴ КОЕ бифидобактерий, и культивировали 96 часов при 37°С. Выросшие колонии тестируемого штамма смешивали с 2,5 мл расплавленного в физиологическом растворе и остуженного до 70°С агара (5%). Агаризированную среду с выросшей культурой бифидобактерий скашивали и на полученные «косячки» наслаивали 3 мл среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду и скашивали. На поверхность наносили по 10 мкл суспензии каждого индикаторного штамма, обеспечивающей рост 10-15 КОЕ в контроле. Контроль - агаризированная среда Блаурокка с наслоенной средой как в опыте. Индекс блокирования роста как отношение количества колоний, выросших в контроле, к количеству колоний, выросших в опыте, определяли в течение 2-дневной инкубации при 37°С. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3:
Антагонистическая активность штамма бифидобактерий по отношению к патогенным родококкам Индекс блокирования ростаШтамм бифидобактерийR.equi 6R.equi 12R.equi 13B.bifidum989B.globosum878В.adolescentis989

Проведенные исследования подтвердили возможность изучения антагонистической активности бифидобактерий по отношению к патогенным микобактериям и родококкам способом в соответствии с изобретением с использованием двухслойной среды, что обеспечивает создание оптимальных условий раздельно для роста штамма-продуцента, биосинтеза бактериоцина и роста индикаторной культуры, которые существенно отличаются.

Источники информации

1. Bifidumbacterinum siccum. ВФС 42-3947.12.07.2000.

2. Muriana PA., Klaenhammer T.R // Appl. Env. Microbiol. - 1987. - V.53. - C.553-560.

3. Гришин Г.И., Слинина К.Н. // Практик. - 2004. - №3-4. - С.80-82.

4. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Марков С.Е., 1999. - 198 с.

5. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфа // Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.

Способ включает внесение бифидобактерий в среду Блаурокка, культивирование при температурном и временном оптимуме, агаризацию расплавленным в физиологическом растворе и остуженным до 70°С агаром. На агаризированную среду с выросшими бифидобактериями наносят питательную среду, содержащую: L-аспарагин - 0,4 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,05 г, сернокислый магний - 0,05 г, лимонную кислоту - 0,2 г, лимоннокислое аммиачное железо - 0,005 г, пируват натрия - 0,05 г, глицерин - 4,0 г, агар - 3,0 г, гумивит - 10,0 мл, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) - 10,0 мл, дистиллированную воду - до 100,0 мл. На ее поверхность засевают культуру индикаторного штамма и проводят инкубацию в течение от 14 до 30 дней. Оценку результатов ведут по индексу блокирования роста. Изобретение обеспечивает создание оптимальных условий для роста исследуемого штамма-продуцента и роста индикаторной культуры. 3 табл.

Способ определения антагонистической активности бифидобактерий по отношению к микобактериям и родококкам, включающий внесение бифидобактерий в среду Блаурокка, культивирование при температурном и временном оптимуме, агаризацию расплавленным в физиологическом растворе и остуженным до 70°С агаром (5%), нанесение на агаризированную среду с выросшими бифидобактериями питательной среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорно-кислый двузамещенный, серно-кислый магний, лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин0,4, гкалий фосфорно-кислый двузамещенный0,05 гсерно-кислый магний0,05 глимонная кислота0,2 глимонно-кислое аммиачное железо0,005 гпируват натрия0,05 гглицерин4,0 гагар3,0 ггумивит10,0 млводный раствор желтка куриного яйца (1:1)10,0 млдистиллированная водадо 100,0 мл

посев на ее поверхность культуры индикаторного штамма, инкубацию в течение от 14 до 30 дней и оценку результата по индексу блокирования роста.