Штамм бактерий MIcRococcUS SpecIeS - продуцент рестриктазы MSp 20 I Советский патент 1993 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению штамма продуцента эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5- TGGCCA-3 , Эндонуклеаэа данной специфичности может быть использована для работ по клонированию, физическому картированию генов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Целью изобретения является выявление штамма-продуцента, синтезирующего эндонуклеазу рестрикции, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -TGGCCA-3 , с высоким выходом целевого фермента.

Это достигается получением штамма Mlcrococcus species ВКПМ В-5463 - продуцента эндонуклеазы рестрикции Msp 20 I.

Новый штамм выделен как контаминант при культивировании в результате систематического поиска продуцентов эндонуклеаз рестрикции, используя экспресс-метод.

Штамм депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетика под номером ВКПМ В-5463.

Фермент назван Msp 20 I согласно общепринятой номенклатуре.

00

о

DS N0

зтА

СО

Штамм Mlcrococcus species обладает следующими признаками,

Культурально-морфологические признаки. Клетки сферические, размером 0,5- 0,7 мкм в диаметре, расположенные одиночно, в парах, тетрадах или неправильных скоплениях. Неподвижны, не образуют эндопор. Хорошо растут на обычных питательных средах (СПА, МПБ) при температуре 30°С. Колонии на СПА опаковые, желтоватые, округлые, край ровный.

Физиолого-биохимические свойства, Аэроб, отрицателен по оксидазе, амилазе, аргининдегидролазе и реакции с метиловым красным, не выделяет сероводород и индол, каталазоположителен, не утилизирует малонат, цитрат, мочевину, не восстанавливает нитраты.

Содержание ГЦ пар в ДНК - 77 мол. %.

Хранение штамма осуществляют под вазелиновым маслом или в 30% глицерине при-70°С..

Выход рестриктазы Msp 20 I 3000 ед/г сырой биомассы.

На чертеже представлена электрофо- реграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментами Bal I и Msp 20 I.

1-ая дорожка - гидролиз Bal I

2-ая дорожка - совместный гидролиз Ball и Msp 20I

3-ая дорожка - гидролиз Msp 20 I

Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента,

Перед началом работы клетки штамма- продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 30°С. После 10-12 часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): бактотриптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, хлористый натрий - 10 и помещают в термостатированную качалку.

Культивируют при температуре 30°С, при 200 об/мин до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 4°С. Выделение осуществляют по методике Blckle, Plrotta, lmber 4. Выход фермента составляет 3000 ед/г сырой биомассы.

Фермент хранится при -20°С в глицерине.

Пример 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине совместного и параллельного гидролиза субстратной ДНК {фиг, 1), Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую посяедователь- ность нуклеотидов 5 -TGGCCA-3 ,

Выход фермента Msp 20 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фер- мента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37°С. Выход фермента составляет 3000 ед/г, активность - 5000 ед/мл.

Полученный штамм обладает следую- щими преимуществами по сравнению с известным:

имеет продуктивность в 3 раза большую, чем штамм-прототип,

не требует длительного культивирова- ния,

Поскольку эндонуклеаза рестрикции

Msp 20 I имеет сайт узнавания идентичный

сайту Msc I, а выход фермента более высок,

то Msp 20 t может заменить прототип во

всех генно-инженерных работах.

Иэошизомеры фермента в СССР до сих

пор не найдены. Поэтому производство эндонуклеазы рестрикции Msp 20 I позволит

полностью отказаться от закупок фермента

за рубежом.

Внедрение штамма планируется в НИ- КТИ биологически активных веществ НПО Вектор в 1991-1992 годах.

В настоящее время рестриктаза Msp 20 I, полученная из Mlcrococcus species, используется для выполнения различных тем НИР во ВНИИ молекулярной биологии и НИКТИ биологически активных веществ НПО Вектор, в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР.

Формул а изо бретени я Штамм бактерий Mlcrococcus species 8КПМ В-5463 - продуцент рестриктазы Msp 20 I.

.&.,.. - :«; -i -«-.-;-.u..ii ,i Vij i-

fr «tu&Xi. Si

Л 11И ЧЯтттгс& .Ъ «wim

Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: штамм бактерий Mlcrococcus species, хранящийся в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-5463, получен в результате систематического поиска продуцентов эн- донуклеаз рестрикции как контаминант при культивировании. При выращивании штамма на с вежей .питатель ной среде при 30°С в термостатированных качалках до достижения стационарной фазы роста получают урожай клеток, из которых выделяют фермент Msp 20 I, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5- TGGCCA-3 . Рестриктазу данной специфичности применяют в генетической инженерии для создания рекомбинантных молекул и для создания физического картирования молекул ДНК. 1 ил. w Ё

..vvt-ssnp - , „;,;-;-.v ,;

if||g|::;1

.