СПОСОБ ОЦЕНКИ НАСЫЩЕНИЯ ЭОЗИНОФИЛОВ МОКРОТЫ И НАЗАЛЬНОГО СЕКРЕТА ЭОЗИНОФИЛЬНЫМ КАТИОННЫМ ПРОТЕИНОМ Российский патент 2020 года по МПК G01N33/48 G01N1/30 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано в клинической аллергологии и иммунологии, гистологии, патологической физиологии при исследовании содержания катионных протеинов в эозинофилах мокроты и мазка со слизистой оболочки носа у пациентов с аллергическим ринитом и бронхиальной астмой.

В настоящий момент общепринятой методикой изучения цитологии дыхательных путей является микроскопия мазка со слизистой оболочки носа (или микроскопия мокроты), окрашенного по методу Романовского-Гимзе, в котором подсчитываются нейтрофилы и эозинофилы не менее чем в 10 полях зрения, при подсчете не менее 200 клеточных элементов.

Данный метод успешно используется в медицине, однако имеет ряд недостатков. Во-первых, показатели цитологии динамичны и способны изменяться в течение суток, что требует неоднократного повтора исследования. Во-вторых, количественные показатели клеток в ряде случаев не коррелируют с выраженностью (тяжестью) клинических симптомов.

В основу изобретения положена задача нивелировать указанные недостатки, путем оценки функциональной активности клеток, а не их количества.

Эозинофильные катионные протеины являются главным фактором, приводящим к повреждению клеток слизистых оболочек дыхательных путей при аллергическом воспалении [Колобовникова, Ю.В. Эозинофил в норме и при патологии/ Ю.В. Колоборовникова, О.И. Новицкий. - Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2014. - 124 с.], в связи с чем, количество данных протеинов в клетках может отражать интенсивность воспалительного процесса и коррелировать с тяжестью клинической картины.

В предлагаемом способе цитологического изучения секретов слизистых оболочек дыхательных путей впервые используется окраска водным раствором бромфенолового красителя и оценка количественного содержания бромфенол-положительных гранул в эозинофилах.

Применение данного способа возможно не только для диагностики аллергической природы воспаления, что можно осуществить и при известных методиках исследования, но также для оценки интенсивности воспалительного процесса и ответа на медикаментозную терапию.

Способ оценки насыщения эозинофилов мокроты и назального секрета эозинофильным катионным протеином включает в себя:

1. Биологический материал (мазок со слизистой носа или мокрота) нанести тонким слоем на предметное стекло (фиг. 1).

2. Высушить при комнатной температуре строго в горизонтальном положении.

3. Зафиксировать в 95% этилового спирта (нанести 1-2 капли 95% этилового спирта на мазок) (фиг. 2).

4. Высушить мазок.

5. Окрасить 0,5% водным раствором бромфенолового синего (так, чтобы весь биоматериал был покрыт красителем) в течение 20 минут (фиг. 3).

6. Тщательно промыть в дистиллированной воде и высушить на воздухе (фиг. 4).

7. Осуществить иммерсионную микроскопию при увеличении не менее ×1000. При микроскопии эозинофилы определяются как клетки, содержащие крупные темно-фиолетовые гранулы с неокрашенной цитоплазмой и ядром (фиг. 5).

8. Оценить визуализируемые эозинофилы полуколичественно от 1 до 3 баллов, где «3» балла соответствуют полному заполнению цитоплазмы гранулами без светлых промежутков (фиг. 6, В)., «2» балла - наличию немногочисленных просветов между гранулами (фиг. 6, Б)., «1» балл - единичным гранулам цитоплазмы (фиг. 6, А).

9. Провести расчет насыщения эозинофилов бромфенол-положительными гранулами (среднего коэффициента насыщения эозинофилов) в условных единицах с помощью модифицированной формулы Астальди-Верга (1957). Для этого число клеток с одинаковым содержанием гранул умножить на соответствующее данной группе число баллов, сумма этих произведений делится на общее количество подсчитанных эозинофилов. Пример расчета: в мазке выявлено 10 эозинофилов, оцененных на «1 балл», 20 эозинофилов, оцененных на «2 балла» и 30 эозинофилов, оцененных на «3 балла».

Расчет:

Механизм действия основан на переходе красителя в окрашенную форму при связывании с катионными белками.

Пример конкретного осуществления

Пример 1

Пациент А., 16 лет, впервые поступил на обследование в аллергологическое отделение, диагноз J45.9 - астма неуточненная. При поступлении до начала базисной терапии было выполнено цитологическое исследование индуцированной мокроты, а также определялся средний коэффициент насыщения эозинофилов катионным протеином. Результат:

Через 7 дней от начала лечения ингаляционными кортикостероидами выполнено повторное цитологическое исследование с определением среднего коэффициента насыщения эозинофилов катионным протеином. Результат:

На фоне приема базисной терапии, несмотря на отсутствие существенных количественных изменений цитологического состава, отмечено снижение содержания катионного протеина в эозинофилах мокроты, что говорит о положительной динамике на фоне лечения.

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине. Описан способ оценки насыщения эозинофилов мокроты и назального секрета эозинофильным катионным протеином. Проводят цитологическое исследование назального секрета или индуцированной мокроты при окраске 0,5% водным раствором бромфенолового синего с последующей иммерсионной микроскопией. При микроскопии эозинофилы определяются как клетки, содержащие крупные темно-фиолетовые гранулы с неокрашенной цитоплазмой и ядром. Затем проводят полуколичественную оценку визуализируемых эозинофилов от 1 до 3 баллов, где «3» балла соответствует полному заполнению цитоплазмы гранулами без светлых промежутков, «2» балла соответствует наличию немногочисленных просветов между гранулами, «1» балл соответствует единичным гранулам цитоплазмы. После чего проводят подсчет среднего коэффициента насыщения эозинофилов бромфенол-положительными гранулами. Технический результат - возможность избирательной оценки содержания в эозинофилах катионных протеинов, являющихся главным фактором повреждения слизистых оболочек дыхательных путей при аллергическом воспалении. 6 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ оценки насыщения эозинофилов мокроты и назального секрета эозинофильным катионным протеином, включающий окраску мазка 0,5% водным раствором красителя бромфеноловым синим, последующую иммерсионную микроскопию, где при микроскопии эозинофилы определяются как клетки, содержащие крупные темно-фиолетовые гранулы с неокрашенной цитоплазмой и ядром, оценку визуализируемых эозинофилов полуколичественно от 1 до 3 баллов, где «3» балла соответствует полному заполнению цитоплазмы гранулами без светлых промежутков, «2» балла соответствует наличию немногочисленных просветов между гранулами, «1» балл соответствует единичным гранулам цитоплазмы, и подсчет среднего коэффициента насыщения эозинофилов бромфенол-положительными гранулами.