ПРОДУЦИРОВАНИЕ IL-21 В ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ-ХОЗЯЕВАХ Российский патент 2009 года по МПК C12N15/74 C12N15/24 C12N1/21 C12P21/02 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в биомедицинской промышленности. Предложены экспрессионные векторы для получения IL-21 в клетках Е.coli. Кодирующая IL-21 нуклеотидная последовательность, включенная в состав новых векторов, содержит модификации, которые направлены на оптимизацию кодонов и вторичной структуры мРНК для трансляции в Е.coli. В результате трансформации предложенными векторными конструкциями получены штаммы Е.coli, пригодные для применения в промышленном масштабе. Разработаны способы крупномасштабного производства IL-21, использующие названные штаммы, которые позволяют получать более 1 г/л рекомбинантного цитокина. 8 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 12 табл.

1. Экспрессионный вектор для продуцирования в Е.coli белка IL-21, содержащий следующие функционально присоединенные элементы:
(a) точку начала репликации;
(b) ДНК-элемент инициации транскрипции;
(c) полинуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO:27, и
(d) терминатор транскрипции.

2. Экспрессионный вектор по п.1, который дополнительно содержит селектируемый маркер.

3. Экспрессионный вектор рТАР337 для продуцирования в Е.coli белка, кодируемого нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:27, который депонирован в АТСС под номером РТА-4853.

4. Клетка-хозяин E.coli, трансформированная экспрессионным вектором по любому из пп.1-3.

5. Клетка-хозяин по п.4, которая является клеткой штамма E.coli W3110.

6. Способ продуцирования белка IL-21, предусматривающий:
(a) культивирование клеток-хозяев по п.5 в среде, подходящей для экспрессии IL-21;
(b) извлечение клеток из среды для выращивания;
(c) выделение из клеток белка IL-21.

7. Способ продуцирования белка IL-21, предусматривающий:
(a) культивирование клеток-хозяев по п.5 в среде для выращивания периодической ферментацией с подпиткой;
(b) извлечение клеток из среды для выращивания;
(c) выделение из клеток белка IL-21.

8. Способ продуцирования белка IL-21, предусматривающий:
(a) культивирование клеток-хозяев по п.4 или 5 во встряхиваемой колбе до OD600 от 5 до 20 в среде для выращивания;
(b) засев аппарата для ферментации от 1 до 12% об./об. содержимым встряхиваемой колбы;
(c) культивирование клеток в аппарате в среде для выращивания при рН от 6,2 до 7,2, в процессе которого питательный раствор подают ранее 15 ч фактической продолжительности ферментации (EFT);
(d) добавление на 20-30 часы фактической продолжительности ферментации индуцирующего агента;
(e) сбор клеток-хозяев в интервале от 48 до 56 ч фактической продолжительности ферментации;
(f) выделение из клеток белка IL-21.

9. Способ по п.8, в котором индуцирующим агентом является изопропилтиогалактопиранозид (IPTG) из расчета от 0,5 до 2 мМ.

10. Способ по п.8, где питательный раствор содержит углевод, выбранный из группы, состоящей из глицерина и глюкозы, в концентрации среды для выращивания и скоростью питания 5-15 г углевода в час.

11. Способ по п.10, где глицерин является 40-70%-ным (об./об.) глицерином, а глюкоза является 40-70%-ной (мас./об.) глюкозой.

12. Способ по п.10, где содержание глицерина составляет примерно 70% (об./об.) или содержание глюкозы составляет примерно 60% (мас./об.).

13. Способ продуцирования белка IL-21, предусматривающий:
(а) подготовку посевной колбы с инокулятом, содержащим клетки-хозяева по п.5, и со средой для выращивания, содержащей примерно 5 г/л глицерина;
(b) культивирование инокулята в среде для выращивания в течение 16-20 ч приблизительно при 30°С;
(c) перенос культивированного инокулята в среде для выращивания в ферментер для периодического культивирования в концентрации 0,5-5% (об./об.);
(d) ферментацию периодического культивирования примерно при 37°С и рН около 6,8 в присутствии приблизительно 2% глицерина;
(e) начало подачи на 8 часу фактической продолжительности ферментации глюкозного питания с параметрами, соответствующими примерно 9,5 г/л/ч, и продолжение этой процедуры до истечения времени ферментации;
(f) добавление на 24 часу IPTG до конечной концентрации от 0,5 до 2 мМ;
(g) ферментацию еще примерно в течение 28 ч после добавления IPTG;
(h) слив ферментационной среды из ферментера;
(i) добавление к ферментационной среде примерно равного объема воды;
(j) гомогенизацию и центрифугирование ферментационной среды для сбора осадка или суспензии клеток, содержащих белковый материал;
(k) выделение из клеток белка IL-21.

14. Клетка-хозяин штамма, обозначенного ZGOLD1 и сданного на хранение в АТСС под номером РТА - 5698, которая трансформирована вектором рТАР337, охарактеризованным в п.3, - продуцент IL-21.
Приоритет по пунктам:

13.12.2002 по пп.1-14.