СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ЯДЕР ИЗ ПЫЛЬНИКОВ ПШЕНИЦЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к физиологии и биохимии растений и может быть применено к анализу механизмов генеративного этапа морфогенеза пыльника пшеницы, а именно при исследовании взаимосвязи надмолекулярных структур клеточных ядер в течение развертывания генетических программ развития, что необходимо для получения дополнительной информации в разработках и построении компьютерных моделей организации генных и эпигенных сетей управления.

Известен способ выделения растительных клеточных ядер [1], в котором был описан способ изоляции клеточных ядер из соматических клеток растений.

Недостаток этого метода заключается в том, что в процессе изоляции клеточных ядер из генеративных органов и тканей растений наблюдается низкий выход нативных клеточных ядер.

Вышеуказанный способ выделения растительных клеточных ядер был принят за основу, в котором первоначально производят консервацию растительных тканей в 80-90% глицерине с последующей трехступенчатой гомогенизацией в забуференной 20% глицериновой среде, низкоскоростное центрифугирование растительного гомогената и очистку ядер через пятислойный (50, 60, 70, 80, 90 мас./объем) забуференный глицериновый градиент.

Недостатком этого способа является то, что при трехступенчатой гомогенизации происходит большая потеря клеточных ядер из генеративных органов и тканей растений, при низкоскоростном центрифугировании не происходит их осаждения, т.к. в гомогенате в основном содержатся репродуктивные клетки, оболочки которых не снимаются 0,5% тритоном Х-100.

Цель изобретения - повышение выхода очищенных клеточных ядер из репродуктивных органов и тканей растений с одновременным сохранением их нативности.

Указанная цель достигается тем, что в способе выделения клеточных ядер из пыльников пшеницы из консервированных пыльников пшеницы в глицериновой среде первоначально выделяют репродуктивные клетки путем раздавливания пыльников в яшмовой ступке, высокоскоростном центрифугировании гомогената для осаждения репродуктивных клеток, с последующей их очисткой через пятислойный глицериновый градиент и промывкой 1% тритоном Х-100 для снятия клеточных оболочек.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример. Опыты проводили на пыльниках пшениц сортов Московская 35 и Фотос на стадиях микроскпороцита, невакуолизированной, слабо- и сильновакуолизированной микроспоры, двухклеточного и трехклеточного пыльцевого зерна. Пшеница выращивалась в полевых условиях, стадии созревания пыльника контролировались цитологически. Изолированные пыльники консервировали в 80-90% глицерине при температуре -25°С. Затем заливали гомогенизационной средой: 20% глицерин, 0.02 М триэтаноламин (ТЭА)·НСl рН 6.8; 0.005 М MgCl₂; 0.025 М KCl; 0.003 CaCl₂; 0.005 M NaCl; 0.004 М n-октиловый спирт и 0.004 М β-меркаптоэтанол. Гомогенат получали путем раздавливания растительного материала в яшмовой ступке в течение 60 с, который фильтровали через 4 слоя капрона размером пор 70 мкм с последующим центрифугированием при 15000 об/мин (К-24, ГДР) в течение 15 мин с целью осаждения генеративных клеток, затем осадок собирали суспендированием в среде гомогенизации (1,5 мл) и наслаивали на прерывистый глицериновый градиент, состоящий из 5 слоев (по 0,5 мл) возрастающей концентрации глицерина (50%, 60%, 70%, 80%, 90% вес./объем) приготовленном на ТЭА-НСl рН 6,8 буфере со всеми вышеперечисленными компонентами гомогенизационной среды, исключая 20% глицерин. Градиентное центрифугирование проводили при 2500 об/мин в течение часа (К-23, ГДР). Осадок клеток промывали 1% тритоном Х-100 на среде гомогенизации, но без глицерина, с последующим центрифугированием при 2700 об/мин (К-23, ГДР) в течение 15 мин для снятия клеточной оболочки, после чего полученные ядра промывали дважды в среде следующего состава: 0.005 М MgCl₂; 0.025 М KCl; 0.003 CaCl₂; 0.005 M NaCl; 0,01 М трис-HCl рН 6.8 с последующим центрифугированием при вышеуказанных условиях.

Степень чистоты выделенных препаратов клеточных ядер определяли микроскопически, спектрофотометрически и по компонентному составу клеточных ядер (белок/ДНК, РНК/ДНК) (табл.1).

Количество белка определяли по связыванию белка с кумасси ярко-синим G (Loba, Австрия) [2, 3]. Метод использовался в случае микронаноколичественного определения белка.

Для определения ДНК и РНК использовали метод А.С.Спирина [4].

Протеолитическую активность в препаратах клеточных ядер и ядерных фракциях определяли по методу [2].

Анализ таблицы 2 показал, что процентный выход нативных клеточных ядер с сохраненной ферментативной системой предложенным способом приблизительной в 10 раз выше по сравнению со способом, известным ранее.

Данное изобретение рекомендуется для молекулярно-генетического анализа репродуктивных органов и тканей растений.

Источники информация

1. Иванова Э.А., Вафина Г.Х. Способ выделения растительных клеточных ядер. Авторское свидетельство 1701747 // БИ 1991. №48. С.98.

2. Иванова Э.А., Вафина Г.Х. Способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназой и ингибирующей активностью. Авторское свидетельство 1733471 // БИ 1992. Т.18, С.96.

3. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. С.342.

4. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия, 1968, Т.23, 35, С.656.

Таблица 1 Спектрофотометрическая характеристика очищенных клеточных ядер, выделенных из различных клеток и их компонентный состав Варианты опыта А_260/230 А_280/260 Белок/ДНК РНК/ДНК Микроспороцит 1,1 0,9 4 0,45 Невакуолизированная микроспора 1 0,8 3,6 0,6 Вакуолизированная микроспора 1,3 0,6 4,6 0,6 Сильновакуолизированная микроспора 1,2   4 0,5 Двухклеточное пыльцевое зерно 1,1 0,7 4,4 0,5 Трехклеточное пыльцевое зерно 1,2 0,8 4,7 0,4

Таблица 2 Сравнение % выхода ядер из репродуктивных клеток пыльника и их ферментативной активности при использовании метода [1] Способ получения растительных клеточных ядер Выход ядер в % Удельная ферментативная активность в белковых фракциях пыльника пшеницы по субстрату протамину: нмоль аргинина·с^-1·мг белка Способ выделения растительныхклеточных ядер [1]. 5±2 0,04±0,01 Способ выделения клеточных ядер из пыльника пшеницы 50±10 2,1±0,3

Изобретение относится к физиологии и биохимии растений и представляет собой способ выделения клеточных ядер из пыльников пшеницы. Способ включает консервацию изолированных пыльников при температуре минус 25°С в присутствии 80-90% глицерина, гомогенизацию раздавливанием в яшмовой ступке в среде гомогенизации, фильтрование, высокоскоростное центрифугирование, очистку в градиенте плотности глицерина 50, 60, 70, 80, 90 мас./объем и снятие клеточных оболочек 1% тритоном Х-100. Изобретение позволяет повысить выход очищенных клеточных ядер из репродуктивных органов и тканей растений с одновременным сохранением их нативности. 2 табл.

Способ выделения клеточных ядер из пыльников пшеницы, включающий консервацию изолированных пыльников при температуре минус 25°С в присутствии 80-90% глицерина, гомогенизацию раздавливанием в яшмовой ступке в среде гомогенизации, фильтрование, высокоскоростное центрифугирование, очистку в градиенте плотности глицерина 50, 60, 70, 80, 90 мас./об. и снятие клеточных оболочек 1%-ным тритоном Х-100.