Способ выделения растительных клеточных ядер Советский патент 1991 года по МПК C12N9/50 

Изобретение относится к физиологии и биохимии растений и может быть применено при анализе механизмов молекулярной биологии развития, а именно в исследовании взаимосвязи структурно-функциональных элементов клеточных ядер в процессе развертывания генетических программ.

Цель изобретения - повышение выхода очищенных клеточных ядер с одновременным сохранением их нативности.

Пример осуществления изобретения.

Работа проводилась на покоящихся, 1- 2-дневных проростках, а также 3-4-дневных тканях колеоптилей, листьев, корней пшениц Мироновской яровой и озимой, Московской - 35, ржи Чишминской озимой и сорта Чулпан. Проростки и ткани консервировали при t - 25°С в 80-90% глицерине.

Ядра из растительных тканей выделяли путем трехступенчатой гомогенизации ткани 7 с, 15 с, 45 с при 15000 об/мин в 20% глицерине, содержащем 0,02 М триэтанола- мин (ТЭА). HCI рН 6,8; 0,005 М MgCIa;. 0,025 М KCI; 0,003 CaCIa; 0,005 М NaCI; 0,004 М н-октмловый спирт и 0,004 М/ -мер- каптоэтэнол. Растительный материал, отфильтрованный через 4 слоя капрона размером пор в 70 мк, центрифугировали при 500 об/мин в течение 5 мин с целью освобождения от грубых неразрушенных тканей и целых клеток, затем надосадок центрифугировали при 2700 об/мин в течение 20 мин. Осадок ядер счищен через пятислойный глицериновый грздиемт (50, 60, 70, 80, 90 мае./объем), приготовленный на ТЭА HCI рН 6,8 со всеми перечисленными компонентами гомогенизационной ереVI

О i

ч

4 XI

ды, исключая 20% глицерин. Градиентное центрифугирование проводили при 2000 об/мин в течение 1 ч. Прохождение ядер через пятислойный глицериновый градиент контролировали микроскопически. Осадок ядер промывали 0,5% тритоном Х-100 на среде гомогенизации, без глицерина, с последующим центрифугированием при 2J700 об/мин в течение 15 мин, после чего промывали трижды в среде следующе- г|о состава: 0,005 М MgCl2,0,025 М KCI; 0,003 H/l CaCl2; 0,005 М NaCI; 0,01 М трис-HCI рН 6,8, с последующим центрифугированием при указанных условиях. Степень чистоты выделенных препаратов клеточных ядер определяли микроскопически, спектрофото- метрически м по компонентному составу белок/ДНК, РНК/ДНК.

Формула изобретения

Способ выделения растительных клеточных ядер, включающий консервацию

растительных тканей при температуре минус 25°С в присутствии глицерина, гомогенизацию, фильтрование и низкоскоростное центрифугирование гомогената и последующую очистку ядерной фракции методом градиентного центрифугирования, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода очищенных клеточных ядер с одновременным сохранением их нативности, для консервации используют 80-90% глицерин, гомогенизацию проводят в буфере, со- держащем 20% глицерина, а очистку ядер осуществляют в градиенте плотности глицерина 50, 60, 70, 80, 90 мас.%.

Изобретение относится к физиологии и биохимии растений и может быть применено при анализе механизмов молекулярной биологии развития, а именно в исследовании взаимосвязи структурно-функциональных элементов клеточных ядер в процессе развертывания генетических программ. Цель изобретения - повышение выхода очищенных клеточных ядер с одновременным сохранением внутриядерной ферментативной активности и физиологических свойств структурно-функциональных элементов клеточных ядер. Для достижения цели первоначально производят консервацию растительных тканей в 80-90% глицерине с последующей гомогенизацией в ззбуферен- ной 20% глицериновой для выделения клеточных ядер, очистку которых производят через пятислойный (50, 60, 70, 80, 90 мае. %/объем) забуференный глицериновый градиент.