СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТРАНСГЕННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ И ПРОДУКТАХ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/68 

Область применения

Изобретение относится к области генной инженерии растений, молекулярной биологии, биобезопасности пищевых продуктов, фитобиотехнологии и защите окружающей среды. Изобретение может быть использовано для выявления и идентификации типичных инсерций ДНК, используемых при генетической трансформации растений, в генетически модифицированном растительном материале и продуктах на его основе.

Уровень техники

Для обнаружения трансгенных компонентов растительного происхождения известен способ анализа ДНК с применением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических праймеров, комплиментарных трансгенным последовательностям ДНК (Lipp M., Brodmann P., Pietsch K., Pauwels J., Anklam E. Journal of АОАС International, 1999, vol.82, №4, рр.923-928).

Наиболее близким способом является способ идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на основе такого материала, предполагающий использование биочипа для анализа результатов ПЦР. (Патент РФ 2270254, Мирзабеков А.Д., Грядунов Д.А., Михайлович В.М., Заседателев А.С., Романов Г.А., Кузнецов В.В., Цыденедамбаев В.Д., Митрохин И.А., Крылова Е.М., опубл. 20.02.2006).

Основным недостатком этого способа является необходимость переноса амплификата после проведения ПЦР в ячейки биочипов, что создает предпосылку для загрязнения реактивов и лабораторного оборудования продуктами ПЦР и может привести к получению ложных результатов анализа.

Кроме того, нельзя использовать заранее приготовленные пробирки со смесью для амплификации.

Задача

Задачей настоящего изобретения является создание нового способа идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на основе этого материала для устранения вышеуказанных недостатков.

Раскрытие изобретения

Эта задача решается новым способом идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на основе этого материала, включающим анализ ДНК при помощи ПЦР с использованием набора олигонуклеотидов - специфических праймеров и флуоресцентномеченых зондов, комплиментарных этим последовательностям, и детекцию результатов ПЦР, причем ПЦР-амплификацию проводят с использованием набора олигонуклеотидов (таблица 1), с детекцией результатов амплификации в закрытых амплификационных пробирках.

Сущность изобретения

Сущность изобретения заключается в новом подходе для обнаружения трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на основе этого материала. Заявляемый способ основан на проведении ПЦР с использованием специфических праймеров и флуоресцентномеченых зондов, комплиментарных трансгенным последовательностям ДНК (таблица 1), с последующей детекцией продуктов амплификации в закрытых амплификационных пробирках с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора. Ключевым элементом заявляемого способа является использование флуоресцентномеченых зондов, представляющих собой олигонуклеотиды, меченные молекулами флуорофора и гасителя флуоресценции. Зонды добавляют в реакционную смесь наряду с праймерами и другими компонентами реакции. В ходе ПЦР флуоресцентномеченый зонд гибридизуется на специфических ампликонах и разрушается Taq-полимеразой, в результате чего флуорофор оказывается свободным от гасителя. Таким образом, уровень флуоресценции в амплификационных пробирках возрастает пропорционально количеству образовавшихся специфических продуктов ПЦР.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский шаг заявляемого изобретения заключается в том, что проведение ПЦР с использованием набора олигонуклеотидов (таблица 1) и детекция результатов ПЦР в закрытых амплификационных пробирках полностью исключает загрязнение реактивов и оборудования продуктами ПЦР и предотвращает появление ложных результатов анализа.

Осуществление изобретения

Принципиальная схема обнаружения фрагментов трансгенной ДНК

ДНК, выделенную из образца, добавляют к смеси для амплификации, содержащей праймеры и флуоресцентномеченые зонды, специфичные к трансгенным последовательностям, затем проводят амплификацию ДНК с помощью амплификатора, а детекцию результатов амплификации - в закрытых амплификационных пробирках осуществляют по завершении ПЦР с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора.

Пример конкретного выполнения

Анализ присутствия чужеродных последовательностей ДНК в растительном материале (ГМ соя линии 40-3-2).

ДНК из бобов ГМ сои линии 40-3-2 выделяют стандартным методом. Равное количество ДНК (5 мкл), выделенной из каждого исследуемого образца, анализируют при помощи четырех комплектов реагентов для амплификации ДНК, отличающихся друг от друга наборами праймеров и флуоресцентномеченых зондов, специфичных по отношению к промотору 35S, промотору nos, гену gus и гену nptII, соответственно. Последовательности праймеров и олигонуклеотидных зондов приведены в таблице 1. Помимо ДНК исследуемых образцов с помощью указанных комплектов реагентов анализируют положительный и отрицательный контрольный образцы.

Указанные комплекты реагентов для амплификации ДНК помимо специфических праймеров (по 14 пМ каждого) и флуоресцентномеченых зондов (по 7 пМ) содержат следующие общие компоненты: 6 мМ каждого dNTP; 84 мМ TRIS-HCl (рН 8,6); 21 мМ (NH₄)₂SO₄; 3,1 мМ - MgCl₂ а также 5 единиц Taq-полимеразы. Общий объем реакционной смеси составляет 35 мкл. Для каждого комплекта реагентов готовят фоновые пробирки, отличающиеся отсутствием Taq-полимеразы, в которые добавляют отрицательный контрольный образец и термоциклируют совместно с остальными пробирками.

Амплификацию проводят с помощью амплификатора "Терцик" производства ЗАО "НПФ ДНК-Технология" (Москва) при следующем температурном режиме: первоначальный прогрев при 94°С в течение 1 мин 30 сек, денатурация при 94°С - 20 сек, отжиг при 64°С - 5 сек, элонгация при 67°С - 5 сек (5 циклов), затем денатурация при 94°С - 1 сек, отжиг при 64°С - 5 сек, элонгация при 67°С - 5 сек (40 циклов).

Детекцию продуктов амплификации в закрытых пробирках проводят по завершении ПЦР с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора «Джин». Интерпретация результатов проводится автоматически, на основании сравнения уровня флуоресценции в пробирках с уровнем флуоресценции в фоновых пробирках соответствующего комплекта реагентов. Результаты анализа отображаются на экране компьютера в виде таблицы. Выявлено существенное повышение уровня флуоресценции, то есть наличие специфических продуктов ПЦР в пробирке, содержащей набор праймеров и флуоресцентномеченых зондов, комплиментарных нуклеотидной последовательности промотора 35S, и анализируемую ДНК.

Следовательно, в результате анализа бобов ГМ сои линии 40-3-2 обнаружена трансгенная ДНК.

Результаты изобретения

Основным преимуществом предлагаемого изобретения является отсутствие необходимости переноса амплификата после проведения ПЦР в ячейки биочипов. В предлагаемом изобретении ПЦР-амплификацию проводят с использованием нового набора олигонуклеотидов (таблица 1), включающего специфические праймеры и флуоресцентномеченые зонды, а детекция результатов ПЦР проводится в закрытых амплификационных пробирках с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, что полностью исключает возможность загрязнения реактивов и оборудования продуктами ПЦР и предотвращает получение ложных результатов анализа.

Кроме того, предлагаемые изобретения высокотехнологичны, не требуют значительных трудовых затрат. Заранее подготовленные пробирки с запечатанной парафином смесью для амплификации хранятся длительное время (более полугода) при комнатной температуре, что позволяет использовать их в составе готовых диагностических наборов. При необходимости возможно использование дополнительных наборов праймеров и флуоресцентномеченых зондов для исследования более широкого спектра трансгенных последовательностей ДНК, применяемых при создании трансгенных растений.

Предлагаемые изобретения не представляют опасности для здоровья персонала и для окружающей среды, так как не связаны с применением токсичных или радиоактивных соединений.

ДНК растительного материала или продуктов на его основе анализируют посредством ПЦР с использованием специфических праймеров и флуоресцентномеченых зондов, комплементарных последовательностям ДНК. Результаты анализа регистрируют с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, причем детекцию продуктов амплификации проводят в закрытых амплификационных пробирках. Это избавляет от необходимости переносить амплификат после проведения ПЦР в ячейки биочипов, а также полностью исключает возможность загрязнения реактивов и оборудования продуктами ПЦР, предотвращая получение ложных результатов анализа. Заранее подготовленные пробирки с запечатанной парафином смесью для амплификации хранятся длительное время при комнатной температуре, что позволяет использовать их в составе готовых диагностических наборов. При необходимости возможно использование дополнительных наборов праймеров и флуоресцентномеченых зондов для исследования более широкого спектра трансгенных последовательностей ДНК, применяемых при создании трансгенных растений. 1 табл.

Способ идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на его основе, включающий анализ ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием набора олигонуклеотидов - специфических праймеров и флуоресцентномеченых зондов, комплементарных этим последовательностям и детекцию результатов ПЦР, отличающийся тем, что ПЦР-амплификацию проводят с использованием набора олигонуклеотидов, показанных в Таблице 1, с детекцией результатов амплификации в закрытых амплификационных пробирках.