СПОСОБ ПРОДУКЦИИ 4-ГИДРОКСИ-L-ИЗОЛЕЙЦИНА Российский патент 2010 года по МПК C12P7/00 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения 4-гидроксиизолейцина или его соли, включающий стадию получения 4-гидроксиизолейцина гидроксилированием изолейцина или его соли в присутствии L-изолейциндиоксигеназы, полученной из бактерии, принадлежащей к роду Bacillus, и продуцирующей 4-гидроксиизолейцин из изолейцина. Изобретение относится также к L-изолейциндиоксигеназе, фрагменту ДНК, ее кодирующему, способу ее получения и применению в способе получения 4-гидроксиизолейцина. Изобретение позволяет получать 4-гидроксиизолейцин с высокой степенью эффективности. 9 н. и 10 з.п. ф-лы, 20 ил., 14 табл.

1. Способ получения 4-гидроксиизолейцина или его соли, включающий стадию получения 4-гидроксиизолейцина гидроксилированием изолейцина или его соли в присутствии L-изолейциндиоксигеназы, полученной из бактерии, принадлежащей к роду Bacillus, и продуцирующей 4-гидроксиизолейцин из изолейцина.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что бактерия, принадлежащая к роду Bacillus, выбрана из группы, состоящей из Bacillus thuringiensis, Bacillus licheniformis, Bacillus sphaericus, Bacillus cereus, и Bacillus weihenstephanensis.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакция гидроксилирования осуществляется в присутствии лизата клеток, приготовленного из микробных клеток в логарифмической фазе роста.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидроксилаза обладает следующими свойствами:
(a) в качестве кофакторов требуются Fe²⁺, аскорбиновая кислота и α-кетоглутаровая кислота,
(b) имеет оптимальный рН реакции от 5 до 8,
(c) имеет оптимальную температуру реакции 45°С и ниже,
(d) инактивируется при 50°С и выше, и
(e) ингибируется ЭДТА, Cu²⁺ и Zn²⁺.

5. L-изолейциндиоксигеназа, обладающая следующими свойствами и выделяемая из бактерии, принадлежащей к роду Bacillus:
(a) в качестве кофакторов требуются Fe²⁺ аскорбиновая кислота и α-кетоглутаровая кислота,
(b) имеет оптимальный рН реакции от 5 до 8,
(c) имеет оптимальную температуру реакции 45°С и ниже,
(d) инактивируется при 50°С и выше,
(e) ингибируется ЭДТА, Cu²⁺ и Zn²⁺,
(f) включает субъединицы, имеющие молекулярную массу 29,000±2,000, что определяется при электрофорезе в SDS-полиакриламидном геле, и
(g) имеет на N-конце аминокислотную последовательность SEQ ID N_о:5.

6. L-изолейциндиоксигеназа по п.5, отличающаяся тем, что бактерией, принадлежащей к роду Bacillus является бактерия Bacillus thuringiensis.

7. Фрагмент ДНК, кодирующий белок, обладающий активностью L-изолейциндиоксигеназы, выбранный из группы, состоящей из:
(a) фрагмента ДНК, включающего нуклеотидную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 1 (SEQ ID No:1);
(b) фрагмента ДНК, который гибридизуется в жестких условиях с фрагментом ДНК, имеющим нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности SEQ ID No:1;
(c) фрагмента ДНК, который кодирует белок, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 2 (SEQ ID No:2);
(d) фрагмента ДНК, который кодирует белок с аминокислотной последовательностью, которая содержит замену, делецию, вставку, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No:2; и
(e) фрагмента ДНК, который кодирует белок с аминокислотной последовательностью, которая по крайней мере на 98% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID No:2.

8. Рекомбинантный экспрессирующийся фрагмент ДНК, полученный путем лигирования фрагмента ДНК по п.7 в ДНК вектора.

9. Бактериальная клетка, трансформированная рекомбинантным фрагментом ДНК по п.8 и обладающая способностью к продукции L-изолейциндиоксигеназы по п.5.

10. Способ получения белка, обладающего активностью L-изолейциндиоксигеназы, включающий: выращивание клеток по п.9 в питательной среде; и накопление белка, обладающего активностью L-изолейциндиоксигеназы, в культуральной среде, в клетках, либо в них обоих.

11. Белок, обладающий активностью L-изолейциндиоксигеназы, выбранный из группы, состоящей из:
(h) белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No:2;
(i) белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая содержит замену, делецию, вставку, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No:2,; и
(j) белка, который по крайней мере на 98% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ID No:2.

12. Способ получения (2S,3R,4S)-4-гидpoкcи-L-изoлeйцинa или его соли, включающий стадии;
взаимодействия L-изолейцина в водном растворе в присутствии по крайней мере одной L-изолейциндиоксигеназы, выбранной из группы, состоящей из:
(f) белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No:2, 8, 13, 17, или 21;
(g) белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая содержит замену, делецию, вставку, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No:2, 8, 13, 17, или 21, и обладающего активностью L-изолейциндиоксигеназы; и (h) белка, который по крайней мере на 70% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ID No:2, 8, 13, 17, или 21, и обладает активностью L-изолейциндиоксигеназы; и
выделения полученного (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина.

13. Способ получения (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина или его соли, включающий стадии:
взаимодействия L-изолейцина в водном растворе в присутствии бактерии, содержащей L-изолейциндиоксигеназу, выбранную из группы, состоящей из:
(f) белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No:2, 8, 13, 17, или 21;
(g) белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая содержит замену, делецию, вставку, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No:2, 8, 13, 17, или 21, и обладающего активностью L-изолейциндиоксигеназы; и (h) белка, который по крайней мере на 70% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ID No:2, 8, 13, 17, или 21, и обладает активностью L-изолейциндиоксигеназы;
и выделения полученного (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что бактерия модифицирована таким образом, что активность L-изолейциндиоксигеназы в такой бактерии увеличена.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что активность L-изолейциндиоксигеназы увеличена путем усиления экспрессии гена, кодирующего указанную L-изолейциндиоксигеназу.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что экспрессия L-изолейциндиоксигеназы усилена путем изменения последовательности, контролирующей экспрессию гена, кодирующего L-изолейциндиоксигеназу, или путем увеличения количества копий гена, кодирующего L-изолейциндиоксигеназу.

17. Способ по п.13, отличающийся тем, что бактерия принадлежит к роду Escherichia, Pseudomonas, Corynebacterium, Arthrobacter, Aspergillus или Bacillus.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанной бактерией является бактерия Escherichia coli, Arthrobacter simplex, Corynebacterium glutamicum, Arthrobactor globiformis, Arthrobactor sulfureus, Arthrobactor viscosus или Bacillus subtilis.

19. Способ по п.13, отличающийся тем, что бактерией является культура бактериальных клеток, бактериальные клетки, обработанные бактериальные клетки или клеточный лизат.