ЭКСПРЕСС-СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРУШЕНИЯ ИММУННОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2011 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской иммунологии, и может быть использовано для определения нарушений иммунного статуса человека.

Проблема оценки состояния иммунной системы организма человека остается в настоящее время актуальной в связи с тем, что многие соматические заболевания характеризуются иммунодефицитом и соответствующая иммунокорригирующая терапия позволит более рационально и эффективно проводить терапию этих состояний.

Известен способ определения нарушений иммунного статуса организма человека путем проведения лизиса эритроцитов барана 0,8% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при 37,0±0,5°C в течение 30 мин с последующим выявлением степени лизиса эритроцитов по соответствующей формуле, а также титра гетерофильных антител. Определение нарушений иммунного статуса проводят сопоставлением коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител с уровнем содержания циркулирующих иммунных комплексов [RU 2347381 C2, 27.02.2005].

Недостатком этого способа является длительность, трудоемкость, недостаточная точность в связи с тем, что не отражается участие компонента C1q, связывающего циркулирующие иммунные комплексы.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности способа за счет исследования функциональной активности субкомпонента C1q комплемента человека, сокращение длительности процедуры исследования, упрощение, удешевление.

Указанный результат достигается тем, что лизис эритроцитов барана проводят 25% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при температуре 37,0±0,5°C в присутствии 0,288 М NaCl в буферном растворе в течение 10 мин, определяют степень ингибирования лизиса эритроцитов, при наличии ингибирования активности комплемента менее 35% оценивают повышенную реакцию иммунной системы организма человека: от 35 до 70% - нормальную, более 70% - пониженную.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, приготовление сыворотки, проведение гемолитического теста и расчет степени ингибирования лизиса. Гемолитический тест проводят с использованием стандартизованных эритроцитов барана (1,5×10⁸ кл/мл) (Е) в вероналовом солевом буфере (VBS), содержащем 0,5 мМ MgCl₂ и 0,15М CaCl₂ (VBS²⁺). Время проведения экспресс-способа 25 мин (в прототипе - 1,5 часа).

Пример 1. Определение оптимальной концентрации NaCl для 50% ингибирования активации системы комплемента. К 200 мкл суспензии эритроцитов барана (Е) (1,5×10⁸ кл/мл) добавляли 100 мкл пулированной сыворотки крови человека от 10 здоровых доноров и 5-50 мкл 1,5М NaCl (интервал концентрации от 0,17 М до 0,32 М NaCl в системе) и в общем объеме 400 мкл, доведенном буфером VBS²⁺, инкубировали 10 мин при 37°С. Одновременно ставили контроль на спонтанный (200 мкл Е+200 мкл VBS²⁺) и полный лизис Е (200 мкл Е+200 мкл H₂O). После инкубации останавливали реакцию гемолиза добавлением 2,6 мл холодного 0,15 М раствора NaCl, центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин и определяли степень гемолиза по величине А₄₀₅ супернатанта. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле:

У(%)=[(X-R)/(H-R)]×100,

где Н, R и X - величины оптической плотности А₄₀₅ супернатанта в гемолитических системах при полном лизисе, в контроле спонтанного лизиса Е и в опытной пробе соответственно.

Степень ингибирования (CI) определяли как разность показателей лизиса в контрольной пробе и в опытных пробах, содержащих возрастающие концентрации NaCl, по формуле:

CI(%)=(100-У),

где 100 - степень лизиса в контрольной пробе, У - степень лизиса в опытных пробах. Полученные данные приведены ниже (таблица 1).

Таблица 1 Ингибирование лизиса эритроцитов барана 0,25% пулированной сывороткой крови человека раствором NaCl Концентрация NaCl в гемсистеме, моль/л 0,150 0,248 0,260 0,274 0,288 0,293 0,310 0,320 Степень ингибирования, CI(%) 0 0 8 17 50 56 90 100

Как видно из данных, представленных в таблице 1, гемолиз эритроцитов барана ингибируется при повышении ионной силы буфера, обусловленной соответствующей концентрацией NaCl. 50% ингибирование активности классического пути комплемента пулированной сыворотки крови наблюдается в присутствии 0,288 М NaCl.

Пример 2. Определение ингибирования гемолиза эритроцитов барана индивидуальной сывороткой человека в присутствии 0,288 MNaCl.

Исследования проведены аналогично вышеописанным условиям только при постоянной концентрации NaCl, равной 0,288 М в гемолитической системе. Вместо пулированной сыворотки крови человека использовали индивидуальные сыворотки доноров (контрольная группа). Полученные результаты представлены ниже в таблице 2.

Таблица 2 Показатели ингибирования лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека в присутствии 0,288 М NaCl № сыворотки                     1 2 3 4 5 6 7 8 9 10                     CI,% 42 51 70 46 58 44 62 35 66 54

Как видно из данных, представленных в таблице 2, ингибирование лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека (контрольная группа) в присутствии 0,288 М NaCl в гемолитической системе наблюдалось на уровне 35-70%. Ингибирование комплемента 0,288М NaCl на уровне 35-70% у здоровых доноров контрольной группы нами принято за показатель, который характеризует нормальное состояние иммунной системы организма.

Пример 3. Определение ингибирования гемолиза в присутствии 0,288 М NaCl в сыворотках крови больных алкоголизмом. Предлагаемым способом были тестированы сыворотки крови 16 больных с хроническим алкоголизмом, характеризующихся пониженным иммунитетом. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 Показатели ингибирования лизиса эритроцитов барана сывороткой крови больных хроническим алкоголизмом в присутствии 0,288 М NaCl № сыв 1 2 3 4 5 6 7 8 CI, % 100 79 74 85 52 55 53 100 № сыв 9 10 11 12 13 14 15 16 CI, % 2 100 70 62 100 76 100 100

Как видно из данных, представленных в таблице 3, в 11 из 16 исследованных образцов сывороток больных хроническим алкоголизмом степень ингибирования составила от 70 до 100%, что свидетельствует о сниженной функции иммунной системы организма.

Исследование состояния иммунного статуса больных с хроническим алкоголизмом показало, что у 69% (p<0,05) больных наблюдается пониженная функция иммунного статуса, у 25% больных данный показатель был в пределах нормы и только у 5% наблюдается повышенная функция иммунного статуса. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости иммуностимулирующей терапии у 70% больных с хроническим алкоголизмом. Коррекция иммунного статуса позволит у таких больных стимулировать регенеративные процессы в органах и тканях, особенно в печени. Эффективность иммунокорригирующей терапии также можно контролировать предлагаемым экспресс-способом.

Пример 4. Определение ингибирования гемолиза в присутствии 0,288 М NaCl в сыворотках крови женщин с воспалительными заболеваниями придатков. Предлагаемым способом были тестированы сыворотки крови 15 женщин с данной патологией, обычно сопровождающейся повышенной реакцией иммунитета. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 Показатели ингибирования лизиса эритроцитов барана сывороткой крови женщин с воспалительными заболеваниями придатков в присутствии 0,288 М NaCl № сыв 1 2 3 4 5 6 7 8 CI,% 0 25 34 21 15 29 33 0 № сыв 9 10 11 12 13 14 15   CI,% 3 40 60 62 0 46 30

Как видно из данных, представленных в таблице 4, в 11 из 15 исследованных образцов (73%), p<0,05 сывороток крови женщин с воспалительными заболеваниями придатков степень ингибирования составила от 0 до 34%, что свидетельствует о повышенной реакции иммунной системы организма, характерной для воспалительных процессов.

Таким образом, как показывают результаты проведенных исследований (примеры 2, 3 и 4), совпадение клинических и лабораторных данных имеет место в 71% случаев (p<0,05).

Предлагаемый способ имеет преимущества по сравнению с известными, заключающиеся в повышении точности диагностики нарушений иммунного статуса, упрощении, сокращении длительности процедуры исследования до 25 минут (экспресс-способ), удешевлении, возможности использования в рутинных исследованиях. Реализация изобретения позволит контролировать эффективность проводимого лечения и выявлять доклинические состояния вторичных иммунодефицитов, аутоиммунных и опухолевых процессов.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской иммунологии. Для определения нарушения иммунного статуса человека проводят реакцию лизиса эритроцитов барана 25% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при температуре 37,0±0,5°С в течение 10 мин в присутствии 0,288М NaCl в буферном растворе. При наличии ингибирования лизиса эритроцитов менее 35% оценивают повышенную реакцию иммунной системы организма человека, 35-70% нормальную, более 70% - пониженную. Использование способа позволяет повысить эффективность выявления доклинического состояния иммунодефицита, провести углубленное исследование патогенеза аутоиммунных заболеваний, дает возможность провести раннюю профилактику и позволяет контролировать эффективность проводимой терапии. 4 табл.

Экспресс-способ определения нарушений иммунного статуса организма человека путем проведения реакции лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при температуре 37,0±0,5°С с последующим выявлением лизиса эритроцитов, отличающийся тем, что лизис эритроцитов барана проводят 25% сывороткой крови человека в присутствии 0,288 М NaCl в буферном растворе в течение 10 мин, определяют степень ингибирования лизиса эритроцитов, при наличии ингибирования активности комплемента менее 35% оценивают повышенную реакцию иммунной системы организма человека, от 35% до 70% - нормальную, более 70% - пониженную.