СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИОНИЗИРОВАННОГО КАЛЬЦИЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2014 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности ионизированного кальция в сыворотке крови человека.

Проблема оценки состояния иммунной системы организма человека остается в настоящее время актуальной в связи с тем, что многие соматические заболевания характеризуются иммунодефицитом и соответствующая иммунокорригирующая терапия позволит более рационально и эффективно проводить терапию этих состояний.

Известен способ определения нарушений иммунного статуса организма человека путем проведения лизиса эритроцитов барана 0,8% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при (37,0±0,5)°C в течение 30 мин с последующим выявлением степени лизиса эритроцитов по соответствующей формуле, а также титра гетерофильных антител. Определение нарушений иммунного статуса проводят сопоставлением коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител с уровнем содержания циркулирующих иммунных комплексов [1].

Недостатком этого способа является длительность, трудоемкость, недостаточная точность в связи с тем, что не отражается участие компонента C1q комплемента, связывающего циркулирующие иммунные комплексы.

Известен также экспресс-способ определения нарушений иммунного статуса организма человека путем проведения лизиса эритроцитов барана 25% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител в присутствии 0,29 M NaCl в буферном растворе. При наличии ингибирования лизиса эритроцитов менее 35% оценивают повышенную реакцию иммунной системы организма человека, 35-70% нормальную, более 70% - пониженную [2].

Недостатком этого экспресс-способа является недостаточная точность, связанная с тем, что используется нефизиологическая концентрация 0,29 M NaCl в гемолитической системе в качестве «нагрузки».

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности способа за счет исследования функциональной активности системы комплемента человека в условиях искусственного дефицита ионов кальция, сокращение длительности процедуры исследования, упрощение, удешевление.

Указанный результат достигается тем, что лизис эритроцитов барана проводят 10% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при температуре 37,0±0,5°C в присутствии 0,55 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты (ЭГТУК) в буферном растворе в течение 10 мин, определяют степень ингибирования лизиса эритроцитов, при наличии ингибирования активности комплемента менее 30% оценивают повышенную функциональную активность ионизированного кальция в организме человека, от 31% до 70% - нормальную, более 71% - пониженную.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, приготовление сыворотки, проведение гемолитического теста и расчет степени ингибирования лизиса. Гемолитический тест проводят с использованием стандартизованных эритроцитов барана (1,5×10⁸ кл/мл) (ЭБ) в вероналовом солевом буфере (ВСБ), содержащем 0,55 мМ MgCl₂, 0,15 М CaCl₂ (ВСБ²⁺) и 0,5 мМ ЭГТУК. Время проведения экспресс-способа 10 мин.

Пример 1. Определение оптимальной концентрации ЭГТУК для 50% ингибирования гемолитической активности системы комплемента сыворотки крови человека.

К 100 мкл суспензии ЭБ с концентрацией 1,5×10⁸ кл/мл добавляют 20 мкл пулированной сыворотки крови человека от 10 здоровых доноров и 5-50 мкл 10 мМ ЭГТУК в ВСБ (концентрации ЭГТУК в пробах от 0,25 мМ до 0,75 мМ) и в общем объеме 200 мкл, доведенном буфером ВСБ²⁺, инкубируют 10 мин при 37°C. Одновременно ставят контроль на спонтанный (100 мкл ЭБ + 100 мкл ВСБ²⁺) и полный лизис ЭБ (100 мкл ЭБ + 100 мкл H₂O). После инкубации в течение 10 мин останавливают реакцию гемолиза добавлением 1,3 мл холодного 0,15 М раствора NaCl, центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин и определяют степень гемолиза по величине A₄₀₅ супернатанта. Степень лизиса эритроцитов (Y) определяют по формуле

Y(%)=[(X-R)/(H-R)]×100,

где H, R и X - величины оптической плотности A₄₀₅ супернатанта в гемолитических системах при полном лизисе, в контроле спонтанного лизиса E и в опытной пробе соответственно.

Степень ингибирования (СИ) определяют как разность показателей лизиса в контрольных и в опытных пробах, содержащих возрастающие концентрации ЭГТУК, по формуле

СИ(%)=(100-Y),

где 100 - степень лизиса в контрольной пробе, Y - степень лизиса в опытных пробах. Полученные данные приведены ниже (таблица 1).

Как видно из данных, представленных в таблице 1, гемолиз эритроцитов барана 10% сывороткой человека ингибируется дозозависимо от концентрации ЭГТУК. 50% ингибирование активности классического пути комплемента пулированной сыворотки крови наблюдается в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК. Ингибирование классического пути активации комплемента ЭГТУК обусловлено избирательным связыванием ионизированного кальция, который участвует в формировании и функционировании C1 компонента. При связывании ионов кальция происходит диссоциация C1r₂ и C1s₂ от субкомпонента C1q, связанного с иммунными комплексами. В данном случае иммунный комплекс представляет собой эритроциты барана, сенсибилизированные гетерофильными антителами человека.

Пример 2. Определение ингибирования гемолиза эритроцитов барана индивидуальной сывороткой человека в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК.

Исследования проведены аналогично выше описанным условиям только при постоянной концентрации ЭГТУК, равной 0,55 мМоль/л в гемолитической системе. Вместо пулированной сыворотки крови человека использовали индивидуальные сыворотки доноров (контрольная группа). Полученные результаты представлены ниже в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, ингибирование лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека (контрольная группа) в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК в гемолитической системе наблюдалось на уровне 35-70%. Ингибирование комплемента 0,55 мМ ЭГТУК на уровне 31-70% у здоровых доноров контрольной группы нами принято за показатель, который характеризует оптимальную функциональную активность ионизированного кальция в сыворотке крови человека.

Пример 3. Определение ингибирования гемолиза в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК в сыворотках крови неврологических больных. Разработанным способом были тестированы сыворотки крови 84 неврологических больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий. Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, только у 18 (21%) из 84 обследованных больных степень ингибирования гемолиза эритроцитов 10% сывороткой крови человека в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК была в пределах референтных величин. В 50 пробах крови (60%) степень ингибирования комплемента была достоверно выше, чем у здоровых людей, и свидетельствовало о низкой функциональной активности ионизированного кальция. В 16 (19%) пробах крови неврологических больных СИ была меньше 30% и свидетельствовала о высокой функциональной активности ионизированного кальция.

Таким образом, из 84 обследованных проб в 66 (79%) сыворотках крови больных с атеросклерозом каротидных артерий наблюдаются сдвиги как в сторону повышения, так и в сторону снижения функциональной активности Ca²⁺.

Пример 4. Определение ионизированного и общего кальция в сыворотке крови неврологических больных.

Содержание общего кальция определяли с использованием коммерческого набора кальций (ЗАО «ЭКОлаб») в группе больных с повышенной и пониженной функциональной активностью кальция. Ионизированный кальций в сыворотке 84 неврологических больных измеряли с использованием ион-селективного электрода на автоматическом биохимическом анализаторе («Конелаб», Финляндия). Полученные результаты представлены в таблице 4.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, содержание общего и ионизированного Ca²⁺ практически не отличается между двумя группами с повышенной и пониженной функциональной активностью Ca²⁺.

Таким образом, низкая и высокая функциональная активность Ca²⁺ в гемолитическом тесте не связана с концентрацией данного катиона в сыворотке крови. Тест с использованием ЭГТУК выявляет аффинность связывания ионов кальция в пентамолекулярном комплексе, C1q(C1r₂C1s₂), C1 компонента системы комплемента. Функционирование данного ферментного комплекса находится под контролем C1-ингибитора, который необратимо связывается с димерным комплексом C1r-C1s и вызывает диссоциацию C1 компонента системы комплемента. От эффективности активации C1 комплекса зависит опсонизация иммунных комплексов активированным компонентом C3b и последующая их солюбилизация и элиминация.

Пример 5. Исследование гемолитической активности системы комплемента и эффекторной, комплемент активирующей функции гетерофильных антител в сыворотках крови неврологических больных с высокой и низкой функциональной активностью Ca²⁺.

В группах с повышенной и пониженной функциональной активностью ионизированного Ca²⁺ проведены исследования комплемент активирующей функции гетерофильных антител, как описано в работе [3], и реактивность системы комплемента в условиях «нагрузки» в виде 0,288% NaCl в гемолитической системе, как описано в работе [4]. Полученные результаты представлены в таблицах 5 и 6.

Как видно из данных, представленных в таблице 5, повышенная функциональная активность в 100% совпадает с повышенной комплемент активирующей функцией гетерофильных антител (КАФГА) и в 91% - с повышенной реактивностью системы комплемента. Высокий титр гетерофильных антител в сыворотке крови наблюдается у 64% тестированных пробах и соответственно низкий коэффициент эффекторной, комплемент активирующей функции гетерофильных антител у 8 больных (73%). Только в одной сыворотке выявлен К_ЭФГА на уровне референтных величин (5,3±0,2 ЕД), в двух сыворотках К_ЭФГА в 4 раза выше.

Как видно из данных, представленных в таблице 6, КАФГА только в 5 сыворотках больных (36%) была в пределах референтных значений (лизиса на уровне 30-70%), в 2 сыворотках (14%) повышенной и в 7 (50%) - пониженной. Причем титр гетерофильных антител во всех 14 исследованных сыворотках с пониженной функциональной активностью ионизированного кальция была в пределах нормы (от (1:4) до 1:32). Расчетный коэффициент эффекторной функции гетерофильных антител (К_ЭФГА) в этой группе только у одного больного находился в референтной области (5,3±0,2 ЕД). У 8 больных (57%) К_ЭФГА был низкий, а у 5 (36%) - высокий. Реактивность системы комплемента у троих больных (21%) в пределах нормы, у 11 (79%) данный показатель был пониженный.

Таким образом, способ определения функциональной активности ионизированного кальция является более чувствительным тестом оценки иммунного статуса, чем определение К_ЭФГА и РСК.

Предлагаемый способ имеет преимущества по сравнению с известными, заключающиеся в повышении точности диагностики нарушений иммунного статуса, упрощении, сокращении длительности процедуры исследования до 10 мин, удешевлении, возможности использования в рутинных исследованиях. Реализация изобретения позволит контролировать эффективность проводимого лечения и выявлять доклинические состояния вторичных иммунодефицитов, аутоиммунных и опухолевых процессов.

Литература

1. Шойбонов Б.Б., Хайбулин В.Р., Сониев В.М., Онтобоев А.Н., Зинченко А.А., Алешкин В.А. Способ определения нарушения иммунного статуса // Патент РФ №2247381 от 27.02.2005.

2. Шойбонов Б.Б., Хайбулин В.Р., Панченко Л.Ф., Зинченко А.А. Кубатиев А.А. Экспресс-способ определения нарушения иммунного статуса организма человека // Патент РФ №2422831 от 27.06.2011 г. Бюл. №18.

3. Шойбонов Б.Б. и др. Хайбулин В.Р., Баронец В.Ю., Осипов А.В., Панченко Л.Ф. Коэффициент эффекторной функции антител (К_ЭФГА) - новый показатель состояния гуморального иммунитета // Патогенез. - 2011. - Т.9, №1. - С.43-49.

4. Панченко Л.Ф., Шойбонов Б.Б., Тахаров И.Г., Зинченко А.А. Способ оценки состояния иммунной системы организма человека // Патент РФ №2314529 от 10.01.2008 г.

Таблица 1 Ингибирование лизиса эритроцитов барана 10% пулированной сывороткой крови человека раствором ЭГТУК ЭГТУК в гемсистеме, мМоль/л 0,35 0,45 0,55 0,65 0,7 0,75 0 СИ, % 16 32 50 71 82 92 0 Таблица 2 Показатели степени ингибирования (СИ) лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК № сыворотки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 СИ,% 42 51 70 46 58 44 62 31 66 54 Таблица 3 Показатели степени ингибирования (СИ) лизиса эритроцитов барана сывороткой крови неврологических больных в присутствии 0,55 мМ ЭГТУК   Количество обследованных, n Степень ингибирования гемолиза, % <30 31-70 >71 сыворотка крови больных 84 16 18 50 M±m 15±12 58±9 92±8

Таблица 4 Содержание общего и ионизированного кальция в сыворотке крови неврологических больных   Сыворотки 84 больных Сыворотки с высокой функциональной активностью Ca²⁺ (17 проб) Сыворотки с низкой функциональной активностью Ca²⁺ (18 проб) Ионизированный Ca²⁺, мМоль/л 1,24±0,075 (N=1,15-1,27) 1,21±0,05 1,24±0,09 Общий Ca²⁺, мМоль/л 2,22±0,12 (N=2,15-2,5) 2,20±0,09 2,23±0,14

Таблица 5 Сравнительные данные показателей в сыворотках с повышенной функциональной активностью ионизированного Ca²⁺ (ФАИ Ca²⁺), комплемент активирующей функции гетерофильных антител (КАФГА), титра ГА, коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител (К_ЭФГА) и реактивности системы комплемента (РСК) в сыворотках крови 11 больных с атеросклерозом каротидных артерий № сыв. ФАИ Ca²⁺, % инг. КАФГА, % лизиса Титр ГА 1: … К_ЭФГА, ЕД РСК, % инг. 4 12 78 64 1,2 20 23 5 90 512 0,2 1 36 7 91 512 0,2 0 38 4 81 64 1,3 2 42 2 90 4 22,5 0 43 12 77 16 4,8 16 45 2 78 64 1,2 8 66 17 86 64 1,3 24 70 17 85 4 21,3 60 73 2 87 64 1,4 0 74 25 84 32 2,6 16 M±m 9,5±7,7 84±5 1:(127±192) 5,3±8,3 13±18

Таблица 6 Сравнительные данные в сыворотках с пониженной функциональной активностью ионизированного Ca²⁺ (ФАИ Ca²⁺), комплемент активирующей функции гетерофильных антител (КАФГА), титра ГА, коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител (К_ЭФГА) и реактивности системы комплемента (РСК) в сыворотках крови 14 больных с атеросклерозом каротидных артерий № сыв. ФАИ Ca²⁺, % инг. КАФГА, % лизиса Титр ГА 1: … К_ЭФГА, Ед РСК, % инг. 3 90 51 16 3,2 48 6 97 29 4 7,3 97 8 100 7 8 0,9 100 9 100 71 4 17,8 51 10 100 47 8 5,9 86 11 100 79 8 9,9 37 12 100 23 8 2,9 100 13 100 58 4 14,5 90 14 100 28 4 7,0 98 15 100 6 4 1,5 99 17 100 61 32 1,9 92 18 100 59 32 1,8 72 20 100 5 8 0,6 100 22 97 27 16 1,8 90 M±m 99±3 39±25 11±10 5,5±5,3 83±22

Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности ионизированного кальция (ФАИ Ca²⁺) в сыворотке крови человека. Способ определения ФАИ Ca²⁺ основан на проведении реакции лизиса эритроцитов барана 10% сывороткой крови человека при температуре 37°C в течение 10 мин в присутствии 0,55 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты в буферном растворе в течение 10 мин. После инкубации определяют степень ингибирования лизиса эритроцитов, при наличии ингибирования активности комплемента менее 30% оценивают повышенную функциональную активность ионизированного кальция в организме человека, от 31% до 70% - нормальную, более 71% - пониженную. Использование простого и быстрого в осуществлении способа позволяет выявлять доклинические состояния иммунодефицита, может служить специфическим маркером для иммуномодулирующей терапии, проводить углубленное исследование патогенеза аутоиммунных заболеваний, дает возможность их ранней профилактики и позволяет контролировать эффективность проводимой терапии. 5 пр., 6 табл.

Способ определения функциональной активности ионизированного кальция в сыворотке крови человека путем проведения реакции лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека при температуре 37°C с последующим выявлением лизиса эритроцитов, отличающийся тем, что лизис эритроцитов барана проводят 10% сывороткой крови человека в присутствии 0,55 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты в буферном растворе в течение 10 мин, определяют степень ингибирования лизиса эритроцитов, при наличии ингибирования активности комплемента менее 30% оценивают повышенную функциональную активность ионизированного кальция в организме человека, от 31% до 70% - нормальную, более 71% - пониженную.