КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ D11 МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ГИБРИДОМНОЙ ТЕХНОЛОГИИ Российский патент 2013 года по МПК C12N5/00 

Описание патента на изобретение RU2482181C1

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для гибридомной технологии как партнер для слияния клеток и синтеза моноклональных антител.

Гибридомная технология широко применяется в научных исследованиях для слияния клеток иммунной системы, прежде всего Т-лимфоцитов. Создание опухолевых клеточных линий, пригодных для использования в качестве партнера для слияния при проведении гибридизации, является актуальным. Моноклональные антитела широко используют в иммунодиагностике, иммунотерапии, для выделения различных биологически значимых молекул и с другими исследовательскими целями.

Потребность в человеческих моноклональных антителах, которые можно было бы использовать в иммунотерапии, очень велика. В настоящее время эта проблема решается с помощью молекулярно-генетических подходов [Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. Часть 2. М.: Медицина, 1999 г., с.119-120].

Известны клеточные линии, используемые для гибридомной технологии, которые были получены с помощью молекулярно-генетического метода «гуманизации» мышиных антител, суть которого состоит в создании «слитых» генетических комплексов, объединяющих V-ген мышиных моноклональных антител и С-гены иммуноглобулинов человека желаемого изотипа.

Известны также клеточные линии, полученные в результате объединения гипервариабельных частей V-генов мыши с генами, кодирующими каркасную последовательность V-гена человека, и человеческими С-генами [Martinsson-Niskanen Т., Riisbro R., Larsson L., et al. Monoclonal Antibody TB-403: A First-in-Human, Phase I, Double-Blind, Dose Escalation Study Directed Against Placental Growth Factor in Healthy Male Subjects. / Clin Ther. 2011 Sep; 33(9): 1142-1149].

Недостатками вышеперечисленных клеточных линий являются: трудоемкость, сложность технического исполнения и дороговизна их получения.

В качестве прототипа заявляемого изобретения использовали клеточные линии миеломы мыши P3X63Ag8.653 и P3-NS1-Ag4-1, устойчивые к 8-азагуанину не продуцирующие иммуноглубулины партнеры для получения гибридом [Zanella I, Verardi R, Negrini R. et al. New heteromyeloma cell lines for the production of human monoclonal antibodies. / J Immunol Methods. 1992 Dec 8; 156(2): 205-215]. Они происходят от продуцирующей IgG к-типа [Hancock R.J., Martin A., Laundy G.J. et al. Production of monoclonal human antibody to HLA-DR5 (DRw11) by mouse/human heterohybridomas. / Hum Immunol. 1988 Jun; 22(2): 135-142; Suzuki S, Masuko T, Takanashi К et al. Assay of cell surface-bound immunoliposomes using monoclonal antibody reactive with a cross-linking reagent. / Chem Pharm Bull (Tokyo). 1992 Jul; 40 (7): 1893-1896].

Недостаток: клеточные линии, представленные миеломными клетками мыши, не могут быть использованы для создания гибридом «человек-человек».

Задачей настоящего изобретения является получение новой клеточной линии множественной миеломы человека, пригодной в качестве партнера для слияния клеток с целью получения гибридом.

Поставленная задача решается тем, что получена новая генетически и фенотипически стабильная клеточная линия D11, сохраняющая гистогенетический фенотип множественной миеломы человека и адаптированная для роста в среде с 8-азагуанином.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками.

Клеточная линия множественной миеломы человека D11 находится на хранении в Банке криоконсервированных биоматериалов РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН под номером 1.2.6-3/D11.

Заявляемую клеточную линию множественной миеломы человека D11 получали из клеток исходной линии U-266, имеющих воспроизводимый фенотип клеток множественной миеломы человека.

Клеточную линию D11 получали в несколько этапов путем культивирования на питательной среде RPMI (ПанЭко, РФ), с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС), производство HyClone, США, гентамицина в концентрации 10 мг/мл (ПанЭко, РФ) и 8-азагуанина в концентрации 20 мкг/мл. Выращивание клеточной линии D11 проводили в культуральных флаконах объемом 25 см3 при температуре 37°C и 5%-ном содержании СО2 в инкубаторе. Пассаж проводили 1 раз в 2-3 суток.

При выращивании клеток в указанной культуральной среде добавляли 8-азагуанин в концентрации 20 мкг/мл. По истечении третьих суток наблюдали гибель 80-90% клеток и единичные клоны опухолевых клеток, устойчивых к 8-азагуанину, то есть имеющих альтернативный путь синтеза нуклеатидов. Затем в состав культуральной среды вводили 8-азагуанин в концентрации 10 мкг/мл, а концентрацию ТЭС увеличили до 20% с целью восполнения популяции при более мягких условиях культивирования. В течение последующих 10 пассажей пул клеток с альтернативным путем синтеза нуклеатидов восстановился полностью, что позволило применить исходные условия культивирования. Концентрация ТЭС была снижена до исходных 10% от состава культуральной среды, при этом гибель клеток не превышала 7%, скорость роста оставалась стабильной. Спустя 5 пассажей при данных условиях концентрацию 8-азагуанина вновь увеличили до 20 мкг/мл, гибель клеток составила не более 20%, скорость роста оставалась стабильной. В течение последующих 10 пассажей наблюдали дальнейший рост и жизнеспособность клеточной популяции. При обзорной микроскопии и динамическом наблюдении фенотипических изменений клеток не выявлено. Оценку скорости роста клеток и их подсчет осуществляли в инвертированном световом микроскопе DMIL (Leica Microsystems, Германия). Стабильно растущая клеточная линия получена на 20-м пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии D11: В-лимфоциты. Клетки имели суспензионный тип роста. На Фиг.1 представлена картина микроскопии клеток множественной миеломы человека D11 в период экспоненциальной фазы роста: клетки округлой правильной формы, свободно расположены в среде в виде отдельных клеток или конгломератов по типу «гроздьев винограда». Клетки имели четко очерченную цитоплазму и хорошо выраженное ядро. Клетки D11 стабильно сохраняли свои свойства в течение всего периода наблюдения и культивирования.

Маркерные признаки клеточной линии D11: устойчива к 8-азагуанину.

Устойчивость клеточной линии D11 к 8-азагуанину означает, что у клеток блокирован запасной путь синтеза нуклеотидов из гипоксантина и гуанина, используемых в качестве предшественников.

Основной путь новообразования нуклеотидов, звеньев, входящих в состав нуклеиновых кислот, включает несколько этапов и блокируется противоопухолевым препаратом аминоптерином (А). Однако гибели клеток при этом не происходит, так как они обладают резервным путем синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот, реутилизируя продукты распада ранее синтезированных нуклеиновых кислот: гипоксантина и тимидина. Добавление гипоксантина и тимидина в питательную среду, содержащую аминоптерин (среда HAT), снимает токсический эффект последнего. Аминоптерин блокирует основной путь биосинтеза нуклеотидов, гипоксантин и тимидин - субстраты для реализации запасных путей, заблокированных в миеломных клетках (о чем свидетельствует устойчивость к 8-азагуанину или 6-тиогуанину), но реализуемых в гибридных клетках, которые наследуют соответствующий ген от родительских клеток. В результате культивирования в среде HAT гибнут неслившиеся опухолевые клетки и естественным образом погибают неслившиеся нормальные клетки, а выживают только гибридные клетки, которые унаследовали бессмертие [Абелев Г.И. Моноклональные антитела / Соросовский Образовательный журнал. 1998 (1): 16-20].

Данное обстоятельство важно в связи с применяемым методом отбора гибридных клеток. Его суть состоит в следующем. Разнородные клетки, у которых слились оболочки, образуют двуядерные гибриды, которые сохраняют способность к клеточному делению. В процессе клеточного деления хромосомы обоих ядер образуют общее ядро. Таким образом, получен истинный гибрид - потомок двух соматических клеток или гибридома. Ее синтетический аппарат обладал способностью синтеза иммуноглобулинов. При соблюдении всех деталей технологии доля слившихся клеток невелика, поэтому их отбор является важной задачей.

Проведен тест выживаемости в среде HAT: гибель клеток зарегистрирована на 6 сутки культивирования в 20%-ной среде HAT, что подтверждает пригодность линии клеток D11 при использовании в качестве партнера для получения гибридом.

Оценка фенотипа линии клеток D11 представлена в таблице. Выявлена экспрессия CD10+ (31,3±1%).

Контаминация: бактерии и грибы в культуре клеток не обнаружены за весь период наблюдения и культивирования. Тест на микоплазму отрицателен.

Условия криоконсервации:

Линии клеток D11 ресуспендировали в среде для замораживания, содержащей полиглюкин (Биохимик, РФ) (95%), DMSO (ПанЭко, РФ) (5%). Криоконсервацию проводили в криопробирках в концентрации 1×105 клеток/мл среды в жидком азоте при снижении температуры на ГС в минуту до минус 25°C. Затем осуществляли быстрое замораживание до минус 70°C. Клетки хранили в жидком азоте при температуре минус 196°C. Размораживание проводили в течение 3-5 минут при t=37°C. Клетки разводили в 10 мл бессывороточной среды и осаждали центрифугированием при скорости 4000 об/мин в течение 2 минут. Супернатант удаляли, а осевшие клетки ресуспендировали в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносили в культуральный флакон. Жизнеспособность клеток оценивали по включению трипанового синего, после размораживания она составила 90%.

Полученная линия клеток множественной миеломы человека D11 обладала рядом качеств: устойчивостью к 8-азагуанину, отсутствием роста в среде HAT, пригодностью для осуществления гибридомной технологии.

Изобретение иллюстрировано следующим примером.

Пример.

Для получения человеческих гибридом путем слияния использовали линии клеток множественной миеломы человека D11 и лимфоцитов человека. В качестве реагента, используемого для слияния клеток, применяли раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ).

В процессе гибридизации обнаружено 3 типа клеток: гибридомные клетки (гибридомы), родительские клетки множественной миеломы человека D11 и лимфоциты человека.

Родительские миеломные клетки погибали при росте в селективной среде HAT. Неслившиеся с миеломными клетками лимфоциты погибали в течение 6-7 суток.

Выявлено, что 50% гибридных клеток имели ожидаемые характеристики обоих родительских клеток: неограниченную пролиферацию в культуре клеток, способность активно синтезировать антитела от миеломных родительских клеток и специфичность антител от родительских лимфоцитов.

На Фиг.2 представлена обзорная микроскопия проведенной гибридизации, где указаны 3 типа клеток: 1 - гибридомы - крупные полиядерные клетки, полученные путем слияния клеток множественной миеломы человека D11 с лимфоцитами, 2 - свободно расположенные в среде клетки множественной миеломы человека D11, 3 - свободно расположенные в среде лимфоциты человека. Микрофотосъемка произведена с помощью оборудования Nikon (Nikon digital camera DXM1200F, инвертированный световой микроскоп Nikon Eclipse TE2000-u, Япония).

Показано, что клетки множественной миеломы человека D11 могут быть использованы в качестве партнера для слияния с лимфоцитами с целью получения гибридом.

Технический результат состоит в расширении арсенала клеточных линий, используемых для гибридомной технологии.

Клеточная линия D11 множественной миеломы человека, используемая для гибридомной технологии. Антигены Линия клеток U-266 Линия клеток-D11 CD45 0,15±0,1% 3,7±0,1% CD3 0,3±0,1% 0,1±0,1% CD20 1,4±0,1% 2,2±0,1% CD10 14,0±1% 31,3±1% CD13 1,0±0,1% 1,7±0,1% CD15 0,2±0,1% 0,4±0,1% CD33 1,2±0,1% 0,3±0,1% CD34 0,1±0,1% 0,1±0,1% CD24 2,8±0,2% 3,2±0,2% CD133 1,9±0,1% 2,1±0,1% CD116 3,4±0,2% 5,5±0,2% CD38 0,8±0,1% 1,2±0,1% HLA-AB1 2,6±0,1% 1,9±0,1% HLA-DR 6,1±0,2% 4,3±0,2%

Похожие патенты RU2482181C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ, СТАБИЛЬНО ПРОДУЦИРУЮЩИХ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА КЛАССА IGG 2018
  • Алиев Теймур Кантамирович
  • Ильина Екатерина Николаевна
  • Кирпичников Михаил Петрович
  • Ларина Мария Викторовна
  • Свешников Петр Георгиевич
  • Солопова Ольга Николаевна
RU2741095C2
ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ mus musculus α-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ГРАНУЛОЦИТАРНОМУ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕМУ ФАКТОРУ (GCSF) ЧЕЛОВЕКА 2013
  • Давыдов Михаил Иванович
  • Барышников Анатолий Юрьевич
  • Барышников Кирилл Анатольевич
  • Голубцова Наталья Валерьевна
  • Манина Ирина Владимировна
  • Молодык Альвина Альфредовна
  • Иванов Павел Константинович
RU2542381C2
МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ПОЛУЧЕННОЕ С ПОМОЩЬЮ ИНТЕГРИНАССОЦИИРОВАННОГО БЕЛКА, ЕГО ФРАГМЕНТ FAB, FAB' ИЛИ F(AB'), ГИБРИДОМА, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО (ВАРИАНТ), АНТИЛЕЙКЕМИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО 1998
  • Фукусима Наоси
  • Уно Синсуке
RU2212413C2
Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus α - продуцент моноклональных антител, специфичных к раково-тестикулярному антигену человека GAGE 2017
  • Финашутина Юлия Павловна
  • Голубцова Наталья Валерьевна
  • Барышникова Мария Анатольевна
  • Мисюрин Андрей Витальевич
  • Шпрах Зоя Сергеевна
RU2652885C1
Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к реассортанту вируса гриппа 1987
  • Варавикова Ольга Ивановна
  • Созина Ирина Анатольевна
  • Вакин Владимир Сергеевич
  • Зазимко Любовь Александровна
SU1482943A1
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS MUScULUS L. - продуцент моноклональных антител к I @ Е человека 1990
  • Климович Владимир Борисович
  • Самойлович Марина Платоновна
  • Гервазиева Валентина Борисовна
  • Крутецкая Ирина Юрьевна
  • Овсянникова Инна Геннадиевна
  • Пашкова Светлана Федоровна
  • Полищук Татьяна Борисовна
SU1752763A1
СЛИТЫЕ КЛЕТКИ-ПАРТНЕРЫ 2007
  • Ямамото Наомаса
  • Канеда Мизухо
RU2431667C9
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛО- НАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К МОНОКЛОНАЛЬНОМУ АНТИТЕЛУ К БЕЛКУ Т4 ЛИМФОЦИТА ЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРУЕМАЯ КЛЕТКА ГИБРИДОМЫ JTHFS-ПРО- ДУЦЕНТМОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К МОНОКЛОНАЛЬНОМУ АНТИТЕЛУ К БЕЛКУ Т4 ЛИМФОЦИТА ЧЕЛО- ВЕКА, КУЛЬТИВИРУЕМАЯ КЛЕТКА ГИБРИДОМЫ JTI-IF3-F5 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К МОНОКЛОНАЛЬНОМУ АНТИТЕЛУ К БЕЛКУ Т4 ЛИМФОЦИТАЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРУЕМАЯ КЛЕТКА ГИБРИДОМЫ JTI-ID7 - ПРО- ДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К МОНОКЛОНАЛЬНОМУ АНТИТЕЛУ К БЕЛКУ Т4 ЛИМФОЦИТА ЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРУЕМАЯ КЛЕТКА ГИБРИДОМЫ JT2-N15 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К МОНОКЛОНАЛЬНОМУ АНТИТЕЛУ К БЕЛКУ Т4 ЛИМФОЦИТАЧЕЛОВЕКА 1988
  • Цунея Охно
SU1801117A3
Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый для получения моноклональных антител к гемагглютинину вируса гриппа А /Краснодар/ 101/59(Н @ N @ ) 1987
  • Нагиева Фирая Галиевна
  • Агеева Ольга Николаевна
  • Никулина Вера Григорьевна
  • Эткинд Галина Владимировна
  • Кузнецова Елена Ивановна
  • Кусельтан Игорь Владимирович
  • Анджапаридзе Отар Георгиевич
SU1446156A1
Способ получения перманентно растущих животных и человеческих клеток 1983
  • Херберт Юнгфер
  • Хайнрих Бархет
  • Винфрид Альберт
SU1424744A3

Иллюстрации к изобретению RU 2 482 181 C1

Реферат патента 2013 года КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ D11 МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ГИБРИДОМНОЙ ТЕХНОЛОГИИ

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению клеточных линий, используемых для гибридомной технологии. Получена генетически и фенотипически стабильная клеточная линия D11 множественной миеломы человека, сохраняющая гистогенетический фенотип множественной миеломы человека, пригодная для культивирования в среде, содержащей 8-азагуанин. Изобретение позволяет эффективно использовать клеточную линию D11 в качестве партнера для слияния клеток и синтеза моноклональных антител. 2 ил., 1 табл., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 482 181 C1

Клеточная линия множественной миеломы человека D11, используемая для гибридомной технологии, находится на хранении в Банке криоконсервированных биоматериалов РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН под номером 1.2.6-3/D11.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2013 года RU2482181C1

US 20090232736 A1, 17.09.2009
АЛЕКСЕЕВА Л.П
и др
Способ подпочвенного орошения с применением труб 1921
  • Корнев В.Г.
SU139A1
Способ селекции популяции клеток IN VIVo 1991
  • Кравцов Вячеслав Юрьевич
  • Яковлев Александр Федорович
  • Федорова Елена Викторовна
  • Вахтин Юрий Борисович
SU1806195A3

RU 2 482 181 C1

Авторы

Давыдов Михаил Иванович

Барышников Анатолий Юрьевич

Бурова Ольга Семеновна

Голубцова Наталья Валерьевна

Манина Ирина Владимировна

Даты

2013-05-20Публикация

2011-12-07Подача