Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для диагностики и лечения инфекций, вызываемых вирусом иммунодефицита человека.
Существует потребность в разработке новых методов для диагностики присутствия ВИДЧ-частици ВИДЧ-инфицированных клеток в образцах биологических жидкостей и тканей. Значительной способностью к нейтрализации in vitro ВИДЧ-инфекционности множества штаммов ВИДЧ обладают моноклональные анти-ОКТ4А-антитела.
Настоящее изобретение описывает способ получения моноклонального антитела к моноклональному антителу против белка Т4 лимфоцита человека (ОКТ4-А) и используемые при этом новые линии гибридомных клеток мышей. Новые линии гибридомных клеток мышиного происхождения обозначены JTI-IF3 (депонирована ЕАСС 87062501
IW
25.06.87), JTI-IF3-E5 (депонировала ЕСАСС 87062502 25.06.87), JTI-ID7 (PERM BP-1685 29.01.88), JT2-N15 (депонирована PERM ВР- 1684 29.01.88). JTI-IF3-E5 и JTI-ID7 получают путем субклонирования JTI-IF3.
Линии гибридомных клеток имеют следующую характеристику:
х) JT2-N15 - продуцент моноклонально- го антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека.
1). Родословная:
а) родительские клетки гибридом: NS I/I клетки миеломы мыши и клетки селезенки мыши;
б) антиген: антитело ОКТ4А;
в) сливающий агент: полиэтиленгликоль (ПЭГ) 1500;
г) процент позитивных клонов: 65%. 2). Стандартные условия выращивания:
а) состав питательной среды: RM1 1640/GIBCO/, 15%-ная инактиви- рованная лошадиная сыворотка, 2 мМ - глу- тамин, 1 мМ L пируват натрия, 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина;
б) температура 37°С;
в) рН питательной среды: 7,4;
г) прочее: 5% С02, 95% воздуха, 100% влажности, 1x10 клеток/на пробирку.
3) Культуральные свойства:
а) способ культивирования: методы кле- точных культур Manmalian;
6J посевная доза: следует поддерживать 1x10 кл./мл;
в) кратность рассева: 15-20 х,
г) время субклонирования: до того, как количество клеток не превысит 1x10 - 2хЮ6/мл.
4) Характеристика культивирования гибридом в организме животных:
а) вид животного: ВА LB/c мышь. Стар- ше 5 недель;
б) доза клеток при прививке: 2x10 гибридных клеток.
в) метод сенсибилизации животного: инъекция 0,5 мл Pristane за 2-4 недели до прививки гибридных клеток;
г) время образования асцита или забора сыворотки: 2-3 недели после прививки клеток;
д) прививаемость: хорошо вызывает у мыши асцит;
ж) данные по видовой принадлежности: мышь, BAL В/с;
з) Контроль контаминации: добавление антибиотиков в культуральную среду.
5. Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом:
а) группа иммуноглобулинов IgGi
б) специфичность продуцируемых иммуноглобулинов и методы оценки продуциру:
емых иммуноглобулинов: анализируют реакционную способность по отношению к антигену (ОКТ4А) с помощью методики FLiS Assay/Horescence-Linked Immunosorbent - флуоресцентная методика, включающая использование иммуносор- бента.
6). Характеристика биосинтеза полезных продуктов in vitro:
а) выход антител: in vitro 1 мкг/мл;
6) уровень активности: 2000 ITC/10 мкг/мл;
в) титр антител: 1000 х7). Способ криоконсервации:
а) температура хранения 198°С;
б) среда: R РМ 1640 (GIBСО), 15% лошадиная сыворотка;
в) криопротектор: 10% ДМЗО (диметил- сульфоксид);
г) условия замораживания и отогрева: замораживание: -20°С в течение 2 ч, -80°С в течение 1 дня, затем перенести пробирки в жидкий азот.
Отогрев: вытащить пробирку. Затем быстро на водяную баню при 37°С до превращения в жидкость. Взять клетки пипеткой Пастера и перенести их в 50 мл холодной среды и промыть;
д) жизнеспособность гибридных клеток после криоконсервации: после одного месяца более чем 80% клеток остаются живыми;
е) метод оценки жизнеспособности: Trypam blue Staing (окрашивание Trypam blue).
Следующие примеры иллюстрируют изобретение.
Пример Мышей линии BALB/c в возрасте 5-6 недель иммунизируют антигеном ОКТ4А (коммерческий препарат моноклональ- ного анти-человеческо-лимфоцито-Т4-антите- ла) в дозе 15 мкм очищенного препарата на мышь с помощью иглы, которую вводят в селе- зекку через разрез на коже брюшка. Вторую иммунизацию поводят через 7 дней после первой путем введения 10 мкг препарата, третью иммунизацию проводят через 13 дней, вводя 5 мкг антитела в селезенку.
Спустя 4 суток после последней бустер- ной инъекции мышей забивают и в асептических условиях извлекают селезенки и их помещают на чашки Петри (на льду), содержащие модифицированную по Дульбекко среду Игла. Селезенки очищают от жира и соединительной ткани, пропускают через сетку из нержавеющей стали калибра 100. Результирующие индивидуальные клетки селезенки центрифугируют 10 мин при 1000 об./мин с образованием осадка. Клеточный осадок дважды промывают средами (аналогично описанному выше) и повторно суспендируют в RPM 1640 и концентрацию клеток оНределяют подсчетом на гемоцитометре в присутствии 0,2% трипан-синего.
Клетки миеломы мышей NS1/1 Ад 4.1, полученные на расе Balb/c, выращивают в среде RPM1 1640, содержащей 15% инакти- вЦрованной тепловой обработкой сыворотки лошади (Пел-Фриз). Клетки центрифугируют 10 мин при 1000 об./мин с оЙразованием осадка и промывают средой RFJM1 1640, не содержащей антибиотика. Концентрацию клеток определяют подсче- то после повторного суспендирования в TOЈI же среде.
Клетки селезёнки и NSI/1-комбиниру- ют в соотношении 4:1 и центрифугируют 10 при 1000 об./мин . Надосадочнуюжид- коЈть отсасывают и слияние клеток проводят при 37°С с использованием по иэтйленгликоля (ПЭГ) 1500, мол.м. 500- 60р. Процедуру проводят при постоянном осторожном перемешивании и добавлении следующего: 1 мл 50% ПЭГ в RPM1 1640, содержащем 15% лошадиную сыворотку, в течение минуты; 1 мл RPM1 1640, содержа- ще|го 15% лошадиную сыворотку, в течение ми|нуты; 1 мл RPM1 1640, содержащего 15% лошадиную сыворотку, добавляемого в те- че(ние 1 мин; 8мкл RPM1 1640, содержащего 15% лошадиной сыворотки, добавляемого в течение 2 мин.
Результирующие клетки слияния цент- ри|} угируют 10 мин при 1000 об./мин, повторно суспендируют в RPM1 1640, содержащей 15% лошадиной сыворотки и пейициллин-G и стрептомицин в количестве Юр ед. и 100 мг на 1 мл соответственно. Клетки помещают в чашки в количестве 0,1 мл;на ячейку в 96-ячеечных чашках, предварительно уравновешенных в 5% СОа. Чашки инкубируют в течение ночи при 37°С в 5% С02.
На вторые сутки в каждую ячейку вводят 0,1 мл среды HAT (13,6 мкг/мл гипоксанти- на, 0,176 мкг/мл аминоптерина и 3,88 мкг/мл тимидина) в RPM1 1640, содержащем 15% лошадиную сыворотку. Эта среда обеспечивает избирательное выживание гибридов клеток сыворотки NC1/1, что создает условия для скрининга неслитых кле- ток NC1/1 или слитых с другими клетками. Неслитые первичные клетки селезенки взрослых мышей не выживают в культуре дольше нескольких суток.
На 3, 4, 6, 9 и 12 сутки из каждой ячейки отводят 0,1 мл среды и добавляют 0,1 мл свежей HAT в RPM1 1640, содержащей 15% лошадиной сыворотки. На 15, 19, 23 и 27 сутки из каждой ячейки отводят 0,1 мл среды и заменяют с помощью 0,1 мл среды
RPM1 1640, содержащей 15% лошадиную сыворотку и только гипоксантин и тимидин в указанной выше концентрации. На 28 сутки культуральные надосадочные жидкости из всех ячеек подвергают скринингу для выявления антитела, специфичного в отношении ОКТ4А.
Для выявления гибридом, продуцирующих антитела на ОКТ4А используют метод флуоресцентно-связанного иммуносорбен- тного анализа (FLISA). Отобран положительный клон JTI-IF3. Антитела надосадочной жидкости проявляют реактивность по методу анализа пятен по Уэс- терну с ВИДЧ-белком молекулярной массы 60000-80000. Антитело клона JTI-IF3 относится к изотипу IgG.
П р и м е р 2. ВИДЧ-нейтрализация.
Надосадочные жидкости гибридомных культур проверяют на способность к нейтрализации ВИДЧ следующим образом. Надосадочные жидкости трехсуточного роста разбавляют 1:5 в пол ной среде (500 мл RPM1 1640; 6 мл 100 х пенициллин стрептомицин; 6 мл 100 х L-глютамин, 100 мл FCS; и 1,2 мл Polybrene Stock (1 мг/мл). 200 мкл разбавленной средой npo6 tубавляют во все ячейки 24-ячеечной микротитровальной чашки, за исключением двух, а в две ячейки вводят равное количество одной лишь среды. Дополнительную среду добавляют к одной из ячеек с одной лишь средой и в каждую оставшуюся ячейку вводят 200 мкл высоко- титрового ВИДЧ-вирусного материала. Чашки запаивают в пластиковые мешки, инкубируют 1-1,5 ч при 4°С и оставляют доходить до 17°С при стоянии в течение 15 мин. Клетки Н9 инкубируют в полной среде в течение 30 мин при 37°С при плотности 1x10 кл./мл, затем центрифугируют и повторно суспендируют в свежей полной среде при плотности SxlO1 кл./мл. 200 мкл клеточной суспензии добавляют к каждой ячейке (доводят общий объем до 600 мкл) и чашки инкубируют 1 ч при 37°С. после чего 150 мкл переносят на дублирующую чашку, содержащую 2 мл свежей полной среды на ячейку. Культуры инкубируют при 37°С в СОа-инкубаторе. Спустя 4 суток культуры делят и добавляют свежую полную среду. На 7 сутки инкубирования готовят пробы для нейтрализационного скрининга по методикам IFA и обратной транскриптазы (RT).
В табл.1 приведены результаты in vitro -нейтрализирующей активности для антитела JTI-IF3 относительно 3-х испытанных вариантов ВИДЧ (ВИДЧ - вариант HTLV- IIIB, гаитянского ВИДЧ-варианта, обозначенного AL12112C, и африканского ВИДЧ-варианта. 906). Антитело JTI-IF3 распознается как общий эпитоп всех трех ВИДЧ-вариантов. Данные нейтрализацион- ного анализа JTI-IF3, JTI-IF3 - Е5, JTI-ID7 приведены в табл.2.
П р и м е р 3, Процедуры формирования и скрининга гибридом согласно примерам 1 ,и 3 вновь повторяют с использованием ОКТ4А при следующих модификациях процедуры иммунизации. Начальная иммунизация включала внутрибрюшинную инъекцию 10 мкг Monos - очищенного антитела QKT4A, вторая внутрибрюшинная инъекция (7 мкг) делалась спустя 17 суток, а последняя (7 мкг внутривенная доза) вводилась спустя 18 суток. После слияния и скри- нинга для дальнейшего исследования был выбран lgGp-продуцирующий положительный клон, обозначенный JT2-N15. Подобно JTI-IF3 и его субклонам JTI-IF3-E5 и JTI-ID7, клон JT2-N15 продуцировал моноклональ- мое антитело, которое по данным анализа пятен по Уэстерну было реакционноспособ- ным с ВИДЧ-белком молекулярной массой около 65-67.000. Культуральные среды выращивания JT2 N-15 были положительными по данным анализа ELISA и результаты предварительного нейтрализационного анализа относительно HIV-IIIB-инфективно- сти приведены ниже в табл.3.
В дальнейших процедурах скрининга по нейтрализационной активности анти- идиотипных антител, размноженных асци- тическим методом, предварительно было установлено, что нижеследующая методика дает наиболее активный асцитический пре- парат. Мышам возраста 5-8 недель делают затравку введением 0,5-1 мл пристана, а спустя две недели делают инъекцию 2- SxlO6 (предпочтительно SxlO6) гибридом- ных клеток. Сбор асцитических жидкостей начинают, спустя две недели после инокули- рования и собранйые в самом начале жидкости (около 3-5 мл) проявляют наивысшую нейтрализационную активность. Второй сбор асцитической жидкости проводят спу- стя трое суток, что дает 8-10 мл жидкости меньшей активности. Третий сбор у выживших животных в общем дает 3-5 мл жидкости, которая по большей части существенно менее активна, чем любой из материалов
после первого и второго сбора. Нейтрализа- ционные данные, представленные для JTI- IF3 в табл.1 и 2, основаны на асцитических жидкостях, объединенных после трех сборов, тогда как данные для JTI-IF3-E5, JTI-ID7 и JT2-N15 в табл.2 и 3 основаны на асцитических материалах, объединенных только из первого и второго сборов.
Формула изобретения
1. Способ получения моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека, включающий иммунизацию животного антигеном, получение линии гибридомных клеток путем слияния клеток селезенки и клеток миеломы мыши, отбор линии гибридомных клеток, продуцирующих специфическое монокло- нальное антитело, отличающийся тем, что антиген представляет собой ОКТ4А-мо- ноклональное антитело, способное к специфическому связыванию с СД4 белком Т4 лимфоцита человека, а линию гибридомных клеток выбирают из группы, включающей: культивируемую клетку гибридомы (JTI-IF3 ЕСАСС 8706501), или культивируемую клетку гибридомы JTI-IF3-E5 (БСАСС 87062502), или культивируемую клетку гибридомы JTI- ID7 (FERM ВР-1685), или культивируемую клетку гибридомы JT2-N15(FERM BP-1684).
2. Культивируемая клетка гибридомы JTI-IF3 (БСАСС 87062501) - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека.
3. Культивируемая клетка гибридомы JTHF3-E5 (ЕСАСС 87062502) - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека.
4. Культивируемая клетка гибридомы JTI-ID7 (FERM ВР-1685) - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека.
5. Культивируемая клетка гибридомы JT2-N15(FERM BP-1684) - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека.
Приоритет по пунктам и признакам:
19,02.87 по п.1 кроме клеточных линий:
29.06.87 по пп.2 и 3:
03.02.88 по пп.4. 5.
Таблица 1
Использование: иммунология, биотехнология, медицина. Получены моноклональные анти-моноклонально-анти-человеческо-Т4-ли мфоцитные антитела, вырабатываемые новыми линиями клеток гибридом мышей JTI-IF 3, JTI-IF 3-Е5, JTI-ID 7 и JT2-N15. Линии клеток гибридом получены путем слияния NSI/1 клетки миемомы мыши и клетки селезенки мыши, иммунизированной ОКТ4А (монокло- нальное анти-человеческо-лимфоцито-Т4-ан- титело) с помощью полиэтиленгликоля. Линия клеток JTI-IF3 депонирована под номером ЕСАСС 87062501, JTI-IF3-E5 - под номером ЕСАСС 87062502, JTI-ID7 - под номером FERM BP-1685, JT2-N15 - под номером FERM ВР-1684. Моноклональные антитела способны нейтрализовать in vitro ВИДЧ - варианты. 3 табл. Se Ё 00 о
JTI - IF3 - нейтрализация
Таблица 2
Продолжение табл. 2
Таблица 3
| Кипятильник для воды | 1921 |
|
SU5A1 |
| Стрелочный контрольный замок | 1924 |
|
SU421A1 |
