СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ОСТРОГО И ХРОНИЧЕСКОГО ТИПОВ ЛИМФОБЛАСТНОГО ЛЕЙКОЗА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Способ прогнозирования течения острого и хронического типов лимфобластного лейкоза относится к области экспериментальной биологии и медицины, в частности гематологии, и может быть использован при диагностике функционального состояния больного, а также составлении дальнейшего прогноза течения заболевания.

В современной медицине известны различные способы прогнозирования течения лейкозов, основанные на определении плоидности и кинетики клеток методом проточной цитометрии с последующим выявлением анеуплоидии и индекса ДНК (RU №2416795, опубл. 20.04.2011), подсчете в крови количества CD20 позитивных B-лимфоцитов методом иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител (RU №2256921, опубл. 20.07.2005), выделении ДНК из периферической венозной крови с последующим анализом полиморфизма гена рецептора фактора некроза опухоли 2-го типа (RU №2458349, опубл. 10.08.2012). Недостатками вышеперечисленных способов является отсутствие универсальности, т.е. невозможности применить их к различным формам лейкоза. В частности, спрогнозировать развитие заболевания по количеству анеуплоидных клеток периферической крови возможно только в случае развития острого лейкоза, в то же время оценить течение хронического лейкоза возможно путем подсчета CD20 положительных B-лимфоцитов, а также путем анализа полиморфизма гена рецептора фактора некроза опухоли 2-го типа.

Наиболее близкий по своей сущности к заявляемому является способ оценки тяжести лейкоза (RU №2052203, опубл. 10.01.1996), включающий выделение лимфоцитов крови, определение их естественной цитотоксичности, дополнительное определение антителозависимой цитотоксичности, опосредованную лимфоцитами и нейтрофиллами, рассчет суммарной естественной и антителозависимой цитотоксичности клеток и при величине снижения ее относительно нормальных величин ниже 50% для острых лейкозов и хронического лимфолейкоза и ниже 40% для хронических миелопролиферативных лейкозов оценивают тяжелое течение лейкозного процесса.

Недостатками заявленного способа являются трудоемкость процесса, использование радиоактивных меток, сложность и трудоемкость выделения клеток, в частности для больных хроническим миелолейкозом лимфоциты можно выделить только после удаления из образцов крови зрелых и созревающих миелоидных клеток, длительность исследования одного образца.

Задачей изобретения является расширение арсенала средств прогнозирования течения острого и хронического типов лимфобластного лейкоза.

Техническим результатом способа является ранняя диагностика прогноза и исхода течения острого и хронического типов лимфобластного лейкоза.

Для достижения указанного технического результата предлагается способ, включающий выделение лимфоцитов крови, причем отбирают верхнее кольцо лейкоцитов, которое разделяют на две части: по одной определяют поверхностный потенциал и модуль упругости не менее 15 клеток из каждой пробы на атомно-силовом микроскопе, а по другой оценивают индекс торможения миграции лимфоцитов (ИТМЛ) с митогеном в сравнении со спонтанной (без митогена) миграцией, после чего прогнозируют течение острого и хронического типов лимфобластного лейкоза. Неблагоприятным исходом течения острого типа лимфобластного лейкоза считают повышение значения поверхностного потенциала клетки от -30,7±0,7 до -28,8±2,1 mV, снижение модуля упругости от 1,9±0,2 до 2,8±0,1 µПа и значение индекса торможения миграции лимфоцитов в интервале от 15 до 95%, что указывает на увеличение инвазивности в ткани опухолевых лимфоцитов и метастазирование. Неблагоприятным исходом течения хронического типа лимфобластного лейкоза считают повышение значения поверхностного потенциала клетки от -9,5±0,7 до -6,7±0,2 mV, повышение модуля упругости от 7,8±0,5 до 9,6±0,3 µПа и значение индекса торможения миграции лимфоцитов в интервале 38-65%, что указывает на нарушение микроциркуляции крови в сосудах и как следствие их закупорку.

Отличительными признаками заявленного способа являются:

- определение поверхностного потенциала, отражающего активность биоэлектрических процессов и модуля упругости, характеризующего механические свойства одиночной клетки, что является объективным критерием степени выраженности патологического процесса при исследовании функционального статуса лимфоцитов на разных этапах лейкозогенеза;

- оценка индекса торможения миграции лимфоцитов с митогеном в сравнении со спонтанной (без митогена) миграцией, что дает информацию о способности лимфоцитов генерировать лимфокины при взаимодействии с митогеном, а также позволяет сделать вывод о существующей сенсибилизации и клеточном ответе на определенные митогены. Кроме того не требует использования большого количества клеток, позволяет осуществлять быструю постановку проб и минимальное воздействия на клетки, сохраняя их нативность;

- оценка неблагоприятного исхода по ключевым критериям острого типа лимфобластного лейкоза позволяет диагностировать на ранних стадиях предрасположенность организма больного к возникновению очагов метастазирования, в то время как хронического лимфобластного лейкоза - к развитию осложнений в виде нарушения микроциркуляции в сосудах.

Предлагаемый способ может быть использован в клинико-диагностических целях, например при оценке прогноза течения заболевания острого и хронического типов лимфобластного лейкоза, их рецидивах во время стадии ремиссии, дополнительного критерия диагностики острого и хронического типов лимфобластного лейкоза.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Производят забор венозной крови, из которой путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин выделяют лейкоциты в виде кольца. Полученную суспензию делят на две части, одну используют для измерения поверхностного потенциала и модуля упругости клетки на ACM, другую - для оценки индекса торможения миграции лейкоцитов. Из нативной части суспензии готовят препараты для измерения модуля упругости путем помещения на стеклянную подложку капли суспензии с последующим сканированием 15 клеток из каждой пробы на ACM в режиме силовой спектроскопии с использованием модифицированного кантилевера (RU №2466401, опубл. 10.11.2012). Оставшуюся часть суспензии используют для приготовления препаратов с целью измерения поверхностного потенциала клетки. Для этого клетки дважды отмывают в физиологическом растворе, затем фиксируют 0,25% раствором глутарового альдегида в течение 20 мин и по истечении времени инкубации суспензию дважды отмывают изотоничным раствором хлорида натрия по 5 мин. Готовят препараты путем помещения капли суспензии на обезжиренную металлическую подложку. Измеряют поверхностный потенциал не менее 15 клеток из каждой пробы на атомно-силовом микроскопе INTEGRA VITA в режиме Зонда Кельвина, используя кантилевер с токопроводящим титановым покрытием серии NSC03/TiN (Nanoworld, USA).

Из второй части отбирают 1 мл лейкосуспензии, которую делят на три пробы. Каждую из них инкубируют в 5 мл смеси жидких питательных сред №199+RPMI-1640 при температуре 37°C во влажной среде в присутствии 5% CO₂ в течение 48 часов, причем через первые 24 часа осуществляют смену среды с митогеном на среду без него. Первую пробу инкубируют без добавления митогенов, вторую - с добавлением 0,02 мл фитогемагглютинина (ФГА), третью - 0,02 мл конканавалина A (КонА). После инкубации заполняют клеточной суспензией (0,1 мл) стеклянный капилляр, запаянный с одного конца, а другим концом, содержащим клетки, погружают в агарозные лунки, заполненные 1 мл среды №199. Причем для приготовления агарозных лунок используют чистые обезжиренные стекла, которые покрывают гелем, выдерживают их на воздухе для затвердевания в течение некоторого времени. Для каждой суспензионной пробы в затвердевшем геле пробивают не менее 5 лунок (размером 2,5 мм). Капилляры инкубируют при 37°C в течение 24 ч в строго вертикальном положении. Извлекают капилляры из лунок пинцетом, мигрировавшие из них клетки ресуспензируют в 4 мл культуральной среды RPMI-1640. Оценку жизнеспособности клеток осуществляют в камере Горяева после окраски трипановым синим, производя подсчет не менее 100 клеток и определяя среди них процент окрашенных (погибших). Вычисляют индекс подавления миграции лимфоцитов митогеном в сравнении со спонтанной (без митогена) миграцией. Расчет проводят по общеизвестной формуле:

$$ИТМл=\frac{n\left(к\right)-n\left(о\right)}{n\left(к\right)}\cdot 100\%$$ ,

где ИТМЛ - индекс торможения миграции лимфоцитов;

n(к) - количество мигрировавших лимфоцитов без воздействия митогенов (контроль);

n(о) - количество лимфоцитов, мигрировавших под влиянием митогенов ФГА или КонА (опыт) (Новиков Д.К. Медицинская иммунология. - Минск: Выш. Шк., 2005. - 301 с.).

Возникновение очагов метастазирования вследствие повышения инвазивного потенциала клеток развивается при повышении значения поверхностного потенциала клетки от -30,7±0,7 до -28,8±2,1 mV, снижение модуля упругости от 1,9±0,2 до 2,8±0,1 µПа и значение ИТМЛ в интервале от 15 до 95% у больных острым лимфобластным типом лейкоза.

Развитие осложнения в виде нарушения микроциркуляции в сосудах развивается при повышении значения поверхностного потенциала клетки от -9,5±0,7 до -6,7±0,2 mV и модуля упругости от 7,8±0,5 до 9,6±0,3 µПа, значение ИТМЛ в интервале 38-65% у больных хроническим лимфобластным лейкозом.

Пример способа прогноза течения острого и хронического типов лимфобластного лейкоза.

Больной 1. Диагноз острый лимфобластный лейкоз.

Больной 2. Диагноз хронический лимфобластный лейкоз.

Отбирают 5 мл венозной крови, из которой путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин выделяют лейкоциты в виде кольца. Полученную суспензию делят на две части: одну используют для измерения поверхностного потенциала и модуля упругости клетки на ACM, другую - для оценки индекса торможения миграции лейкоцитов. Из нативной части суспензии готовят препараты для измерения модуля упругости путем помещения на стеклянную подложку капли суспензии, с последующим сканированием 15 клеток из каждой пробы на ACM в режиме силовой спектроскопии с использованием модифицированного кантилевера (RU №2466401, опубл. 10.11.2012). Оставшуюся часть суспензии используют для приготовления препаратов с целью измерения поверхностного потенциала клетки. Для этого клетки дважды отмывают в физиологическом растворе, затем фиксируют 0,25% раствором глутарового альдегида в течение 20 мин и по истечении времени инкубации суспензию дважды отмывают изотоничным раствором хлорида натрия по 5 мин. Готовят препараты путем помещения капли суспензии на обезжиренную металлическую подложку. Измеряют поверхностный потенциал не менее 15 клеток из каждой пробы на атомно-силовом микроскопе INTEGRA VITA в режиме Зонда Кельвина, используя кантилевер с токопроводящим титановым покрытием серии NSG03/TiN (Nanoworld, USA).

Из второй части отбирают 3 мл лейкосуспензии, которую делят на три пробы по 1 мл. Каждую из них инкубируют в 5 мл смеси жидких питательных сред №199 + RPMI-1640 при температуре 37°C во влажной среде в присутствии 5% CO₂ в течение 48 часов, причем через первые 24 часа осуществляют смену среды с митогеном на среду без него. Первую пробу инкубируют без добавления митогенов, вторую - с добавлением 0,02 мл фитогемагглютинина (ФГА), третью - 0,02 мл конканавалина A (КонА). После инкубации заполняют клеточной суспензией (0,1 мл) стеклянный капилляр, запаянный с одного конца, а другим концом, содержащим клетки, погружают в агарозные лунки, заполненные 1 мл среды №199. Причем для приготовления агарозных лунок используют чистые обезжиренные стекла, которые покрывают гелем, выдерживают их на воздухе для затвердевания в течение некоторого времени. Для каждой суспензионной пробы в затвердевшем геле пробивают не менее 5 лунок (размером 2,5 мм). Капилляры инкубируют при 37°C в течение 24 ч в строго вертикальном положении. Извлекают капилляры из лунок пинцетом, мигрировавшие из них клетки ресуспензируют в 4 мл культуральной среды RPMI-1640. Оценку жизнеспособности клеток осуществляют в камере Горяева после окраски трипановым синим, производя подсчет не менее 100 клеток и определяя среди них процент окрашенных (погибших). Вычисляют индекс подавления миграции лимфоцитов митогеном в сравнении со спонтанной (без митогена) миграцией. Расчет проводят по общеизвестной формуле:

$$ИТМл=\frac{n\left(к\right)-n\left(о\right)}{n\left(к\right)}\cdot 100\%$$ ,

где ИТМЛ - индекс торможения миграции лимфоцитов;

n(к) - количество мигрировавших лимфоцитов без воздействия митогенов (контроль);

n(о) - количество лимфоцитов, мигрировавших под влиянием митогенов ФГА или КонА (опыт) (Новиков Д.К. Медицинская иммунология. - Минск: Выш. Шк., 2005. - 301 с.).

Возникновение очагов метастазирования вследствие повышения инвазивного потенциала клеток развивается при повышении значения поверхностного потенциала клетки от -30,7±0,7 до -28,8±2,1 mV, снижении модуля упругости от 1,9±0,2 до 2,8±0,1 µПа и значении ИТМЛ в интервале от 15 до 95% у больных острым лимфобластным типом лейкоза.

Развитие осложнения в виде нарушения микроциркуляции в сосудах, развивается при повышении значения поверхностного потенциала клетки от -9,5±0,7 до -6,7±0,2 mV и модуля упругости от 7,8±0,5 до 9,6±0,3 µПа, значение ИТМЛ в интервале 38-65% у больных хроническим лимфобластным лейкозом.

Результаты полученных исследований представлены в таблице 1.

Параметр Больной 1 Больной 2 Здоровый донор Модуль упругости, µПа 2,5±0,1 8,3±0,7 5,2±0,1 Поверхностный потенциал клеток, mV -23±0,9 -6,1±0,2 -38,3±0,6 ИТМЛ с ФГА, % 15 54,5 70 ИТМЛ с КонА, % 93,5 38 80

Как видно из данных таблицы, у больного хроническим лимфобластным лейкозом повышен модуль упругости и поверхностный потенциал на 232% и 277% (p<0,5) соответственно, при этом ИТМЛ клетки снижено по сравнению с показателями больного острым лимфобластным лейкозом, что приводит к нарушению микроциркуляции и развитию застойных явления в сосудах. У больного острым лимфобластным лейкозом, наблюдается обратная картина, снижен модуль упругости и поверхностный потенциал клетки на 70% и 73,5% (p<0,5) соответственно, ИТМЛ клетки повышен, что указывает на способность клеток образовывать очаги метастазирования.

Таким образом, предлагаемый способ высоко информативен, позволяет получить достоверную информацию о функциональном состоянии организма и осложнениях течения лейкозов, скорректировать длительную терапию у больных хроническим лимфобластным лейкозом и использовать более четкие критерии для диагностики типов лейкоза.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования течения острого и хронического типов лимфобластного лейкоза. Для этого выделяют лимфоциты крови, определяют поверхностный потенциал и модуль упругости не менее 15 клеток из каждой пробы на атомно-силовом микроскопе и оценивают индекс торможения миграции лимфоцитов с митогеном в сравнении со спонтанной (без митогена) миграцией. При повышении значения поверхностного потенциала клетки от -30,7±0,7 до -28,8±2,1 mV, снижении модуля упругости от 1,9±0,2 до 2,8±0,1 µПа и значении индекса торможения миграции лимфоцитов в интервале от 15 до 95% прогнозируют неблагоприятный исход течения острого типа лимфобластного лейкоза. При повышении значения поверхностного потенциала клетки от -9,5±0,7 до -6,7±0,2 mV, повышении модуля упругости от 7,8±0,5 до 9,6±0,3 µПа и значении индекса торможения миграции лимфоцитов в интервале 38-65% прогнозируют неблагоприятный исход течения хронического типа лимфобластного лейкоза. Использование данного способа позволяет прогнозировать течение заболевания острого и хронического типов лимфобластного лейкоза, развитие их рецидивов во время стадии ремиссии, а также скорректировать длительную терапию у больных хроническим лимфобластным лейкозом. 2 пр., 1 табл.

Способ прогнозирования течения острого и хронического типов лимфобластного лейкоза, включающий выделение лимфоцитов крови, отличающийся тем, что отбирают верхнее кольцо лейкоцитов, которое разделяют на две части - по одной определяют поверхностный потенциал и модуль упругости не менее 15 клеток из каждой пробы на атомно-силовом микроскопе, а по другой оценивают индекс торможения миграции лимфоцитов с митогеном в сравнении со спонтанной (без митогена) миграцией, и при повышении значения поверхностного потенциала клетки от -30,7±0,7 до -28,8±2,1 mV, снижении модуля упругости от 1,9±0,2 до 2,8±0,1 µПа и значении индекса торможения миграции лимфоцитов в интервале от 15 до 95% прогнозируют неблагоприятный исход течения острого типа лимфобластного лейкоза, а при повышении значения поверхностного потенциала клетки от -9,5±0,7 до -6,7±0,2 mV, повышении модуля упругости от 7,8±0,5 до 9,6±0,3 µПа и значении индекса торможения миграции лимфоцитов в интервале 38-65% прогнозируют неблагоприятный исход течения хронического типа лимфобластного лейкоза.