СОЕДИНЕНИЕ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИНГИБИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ В ОТНОШЕНИИ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ 5 ТИПА, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2015 года по МПК C07D487/04 A61K31/519 A61P15/10 A61P7/02 A61P9/00 A61P11/06 A61P1/00 A61P3/10 

Описание патента на изобретение RU2547465C2

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к соединению, обладающему ингибирующим действием в отношении фосфодиэстеразы 5 типа, его солям, способам его получения и фармацевтическим композициям, содержащим указанное соединение или его соли.

Предшествующий уровень техники

Циклический аденозин монофосфат (цАМФ) и циклический гуанозин монофосфат (цГМФ) являются важными вторичными мессенджерами в клетке, и уровень цАМФ и цГМФ в клетке важен для регулирования различных клеточных функций.

Ферменты, участвующие в регуляции клеточного уровня цАМФ и цГМФ, включают аденилатциклазы (АЦ), гуанилатциклазы (ГЦ) и фосфодиэстеразы (ФДЭ). Баланс этих ферментов поддерживает уровень цАМФ и цГМФ в клетке в пределах нормы. При некоторых болезненных состояниях (например, гипертония, стенокардия и т.д.) обнаружено, что уровень цАМФ и цГМФ в клетке падает. Для повышения уровня цАМФ и цГМФ в клетке могут быть использованы две возможности: 1) активировать АЦ и ГЦ, и 2) ингибировать ФДЭ, из которых вторая возможность имеет лучший эффект. В последние годы существует большой интерес к изучению и разработке ингибиторов ФДЭ, и клиническое применение селективных в отношении изоферментов ингибиторов ФДЭ достигло революционного прогресса. В настоящее время результаты экспериментов по клонированию молекулы кДНК доказали, что существует по крайней мере 10 семейств генов ФДЭ у млекопитающих. Для каждого семейства генов ФДЭ существует множество подтипов изоферментов ФДЭ (сплайсинг-вариантов), из которых фосфодиэстераза 5 типа (ФДЭ-5) может селективно гидролизовать цГМФ и широко распространена в отдельных органах тела.

Ингибитор ФДЭ-5 имеет следующие фармакологические функции и клинические применения:

(1) Ингибирование агрегации тромбоцитов и борьба с тромбозом:

идеальные антитромботические препараты должны подавлять агрегацию тромбоцитов без релаксации гладкой мускулатуры сосудов, чтобы избежать возникновения участка ишемии с дальнейшим развитием ишемии. Как ингибиторы ФДЭ-3, так и ингибиторы ФДЭ-5 ингибируют агрегацию тромбоцитов. Однако учитывая, что ингибитор ФДЭ-5 в меньшей степени расслабляет гладкую мускулатуру сосудов, он имеет существенное преимущество в лечении артериальных тромботических заболеваний. Типичный ингибитор ФДЭ-5, представляющий собой дипириамол, имеет хороший антитромботический эффект.

(2) Снижение легочной гипертензии и лечение сердечно-сосудистых заболеваний: аномалия легочного сосудистого сопротивления часто является важным фактором, вызывающим сердечно-сосудистые заболевания. В экспериментах на животных моделях селективный ингибитор ФДЭ-5, представляющий собой запринаст, может существенно увеличить эффективное время и интенсивность оксида азота и оказывает относительно сильное действие на снижение легочной гипертензии. Клинически это используется для лечения стенокардии, гипертонии и инфаркта миокарда. В последнем докладе ингибитор ФДЭ-5, представляющий собой Е-4010, может увеличить выживаемость крыс, имеющих гипертонию, индуцированную монокроталином.

(3) Противоастматическое действие: Сообщается, что эксперименты с использованием свиней в качестве животной модели показывают, что ингибитор ФДЭ-5, представляющий собой SR-265579, имеет терапевтический эффект для гистамининдуцированных бронхоэктазов;

(4) Лечение диабетического гастропареза: Сообщается, что у крыс, имеющих диабет, ингибитор ФДЭ-5, представляющий собой силденафила цитрат, может устранить задержку опорожнения желудка и обладает определенными терапевтическими и положительными эффектами на автономную нейропатию пищеварительной системы, осложненную диабетом.

(5) Лечение эректильной дисфункции: Поскольку ФДЭ5 широко распространен в пещеристых телах полового члена, ингибитор ФДЭ5 может вызвать увеличение уровня цГМФ в пещеристых телах полового члена. Вследствие ряда физиологических и биохимических реакций гладкая мускулатура сосудов пениса расслабляется и происходит эрекция пениса. В отличие от простагландина Е1 ингибитор ФДЭ-5 не будет вызывать патологическую эрекцию; ее функция все еще будет нуждаться в сексуальные стимулах.

В свете вышеизложенных фармакологических функций ингибитора ФДЭ5 авторы изобретения модифицировали химическую структуру силденафила методом химической молекулярной модификации и получили новые соединения и их цитраты, т.е. 5-[2-этоксифенил-5-(3,4,5-триметилпиперазинил)-сульфонил]-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-кетон и его цитрат (ZTH). Установлено, что ZTH может эффективно подавлять активность фермента ФДЭ-5. Таковы предпосылки изобретения.

Краткое описание изобретения

Первой задачей настоящего изобретения является создание нового соединения, которое может ингибировать активность фосфодиэстеразы 5 типа и его соли, такой как цитрат. Второй задачей настоящего изобретения является разработка способа получения нового соединения и его цитрата. Третьей задачей настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции, которая содержит новое соединение или его соль, такую как цитрат.

Настоящее изобретение предлагает соединение формулы I и его фармацевтический цитрат формулы II:

Химическое название соединения, представленного формулой I: 5-[2-этоксифенил-5-(3,4,5-триметилпиперазинил)-сульфонил]-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразоло[4,3-D]пиримидин-7-он. Для иллюстрации его структуры использован метод ядерного магнитного резонанса и для вычисления молекулярной массы использована масс-спектрометрия:

[013]1H-NMR (400MHz, MeOD) δ 8,180-8,185 (d, J=2Hz, 1H), 7,880-7,908 (dd, J1=2,4Hz, J2=8,8Hz, 1H), 7,356- 7,379 (d, J=9,2Hz, 1H), 4,284- 4,337 (q, J=14Hz, 2H), 4,234 (s, 3H), 3,575-3,603 (d, J=11,2Hz, 2H), 2,865-2,902 (t, J=7,2Hz, 2H), 2,377 (br, 2H), 2,261 (s, 3H), 2,112-2,168 (t, J=11,2Hz, 2H), 1,795-1,851 (m, 2H), 1,465-1,500 (t, J=7,2Hz, 3H), 1,090-1,105 (d, J=6Hz, 6H), 0,978-1,015 (t, J=7,2Hz, 3H). MS 503 [M+H]+

Цитрат формулы II получают в результате реакции соединения формулы I и лимонной кислоты. Химическое название цитрата, представленного формулой II: 5-[2-этоксифенил-5-(3,4,5-триметилпиперазинил)-сульфонил]-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразоло[4,3-D]пиримидин-7-онацитрат. Анализ выполнен с помощью ядерного магнитного резонанса: 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ8,164-8,170 (d, J=2,4Hz, 1H), 7,914-7,942 (dd, J1=2,4Hz, J2=8,8Hz, 1H), 7,363-7,385 (d, J=8,8Hz, 1H), 4,276-4,329 (q, J=14Hz, 2H), 4,231 (s, 3H), 3,746-3,776 (d, J=11,2Hz, 2H), 2,986 (br, 2H), 2,858-2,895 (t, J=7,2Hz, 2H), 2,792 (s, 2H), 2,739 (s, 2H), 2,590 (s, 3H), 2,406-2,464 (t, J=11,6Hz, 2H), 1,784-1,839 (m, 2H), 1,448-1,483 (t, J=7,2Hz, 3H), 1,253-1,269 (d, J=6,4Hz, 6H), 0,972-1,009 (t, J=7,2Hz, 3H).

Соединение формулы I получают главным образом, используя цис-2, 6-диметилпиперазин и 5-(2-этоксифенил)-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразоло[4,3-е]пиримидин-7-кетон в качестве исходных материалов и синтезируют в несколько этапов. Путь синтеза выглядит следующим образом:

В 2,6-диметилпиперазин и ди-трет-бутилдикарбонат добавляют тетрагидрофуран, проводят реакцию при комнатной температуре, а затем максимально концентрируют тетрагидрофуран и получают 3,5-диметил-1-трет-бутоксикарбонил-пиперазин (ZTH-1). По данным ядерно-магнитного резонанса и масс-спектрометрии: 1H-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ3,8-4,1 (br, 2H), 2,75-2,80 (м, 2Н), 2,2-2,5 (br, 2H), 1,45 (с, 9H), 1,052-1,067 (d, J=6 Гц, 6H). MS 215 [M+H]+.

К ZTH-1 последовательно добавляют тетрагидрофуран, углекислый калий и йодистый метил, и проводят реакцию при комнатной температуре в течение ночи; затем фильтруют и концентрируют, добавляют воду и дихлорметан в осадок и промывают дихлорметаном, соединяют органические слои, промывают насыщенным раствором соли и сушат над безводным сульфатом натрия, концентрируют и остаток очищают колоночной хроматографией (метанол:дихлорметан = 1:20) и получают 3,4,5-триметил-1-трет-бутил-карбонилпиперазидин (ZTH-2). По данным спектрометрии ядерно-магнитного резонанса и масс-спектрометрии: 1H-NMR (400MHz, MeOD), 54,505-4,533 (m, 2H), 4,110-4,134 (m, 2H), 2,943 (s, 3H), 2,779 (br, 2H), 2,196 (s, 9H), 1,782-1,797 (d, J=6Hz, 6H). MS 229 [M+H]+.

ZTH-2 растворяют в диоксане, охлаждают, медленно по каплям добавляют концентрированный раствор соляной кислоты в диоксане, перемешивают при комнатной температуре и затем выпаривают растворитель при пониженном давлении и получают 1,2,6-триметилпиперазин (ZTH-3). По данным спектрометрии ядерно-магнитного резонанса и масс-спектрометрии: 1Н- NMR (400MHz, MeOD) δ4,505-4,533 (m, 2Н), 3,722 (br, 2Н), 3,611-3,644 (m, 2Н), 3,310-3,423 (m, 2Н), 2,937 (s, 3Н), 1,493-1,506 (d, J=5,2Hz, 6H). MS 129 [M+H]+.

По каплям добавляют 5-(2-этоксифенил)-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразол[4,3-D]пиримидин-7-он в хлорсульфоновую кислоту, поддерживая температуру реакционного раствора не выше 25°C, проводят реакцию при комнатной температуре, а затем заливают реакционный раствор в колотый лед, механически перемешивают при комнатной температуре, поддерживая температуру не выше 25°C, а затем фильтруют и сушат и получают 5-(2-этоксифенил-5-хлорсульфонил)-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-он (ZTH-4). По данным спектрометрии ядерно-магнитного резонанса и масс-спектрометрии: 1H-NMR (400MHz, DMS0) δ 7,871-7,876 (s, 1Η), 7,700-7,727 (dd, J1=2Hz, J2=8,4Hz, 1H), 7,098-7,119 (d, J=8,4Hz, 1H), 4,125-4,161 (m, 5H), 2,778-2,816 (t, J=7,6Hz, 2H), 1,700-1,756 (m, 2H), 1,303- 1,337 (t, J=6,8Hz, 3H), 0,919-0,956 (t, J=7,6Hz, 3H). MS 411 [M+H]+.

В тетрагидрофуран добавляют ZTH-4, ZTH-3 и триэтиламин, перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, затем выпаривают растворитель, в остаток добавляют воду и метиленхлорид, отделяют и последовательно промывают слой метиленхлорида насыщенным раствором бикарбоната натрия в воде, насыщенным раствором соли, и затем сушат и концентрируют, после перекристаллизации образовавшегося остатка из этанола получают соединение формулы I (ZTH-5).

В ZTH-5 добавляют безводный метанол, перемешивают, нагревая до растворения, добавляют лимонную кислоту после осветления раствора; по окончании реакции растворения, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют, промывают метанолом и сушат и получают соединение формулы II (ZTH).

ZTH-5, соли ZTH-5, такие как ZTH, являются пиразоло-пиримидино-кетоновыми соединениями, химическая структура которых схожа с химической структурой цГМФ и они могут конкурировать с цГМФ за связывание каталитического домена ФДЭ-5 и, таким образом, препятствовать деградации цГМФ на ФДЭ-5, увеличивать концентрацию цГМФ и поддерживать концентрацию цГМФ в пределах нормы. ZTH-5, соли ZTH-5, такие как ZTH, могут эффективно ингибировать активность фосфодиэстеразы 5 типа и, таким образом, могут быть использованы как ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа или в качестве эффективного компонента депрессанта фосфодиэстеразы 5 типа. ZTH-5, соли ZTH-5, такие как ZTH, потенциально могут быть основой для разработки препаратов нового поколения для лечения эректильной дисфункции, для ингибирования агрегации тромбоцитов и лечения тромбоза, для снижения легочной гипертензии и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, для лечения астмы и лечения диабетического гастропареза.

Подробное описание изобретения

(1) Получение ZTH-5(5-[2-этоксифенил-5-(3,4,5-триметилпиперазинил)-сульфонил]-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразоло[4,3-D]пиримидин-7-он):

1. Получение 3,5-диметил-1-трет-бутоксикарбонил-пиперазина (ZTH-1):

В 250 мл колбу добавляют 2,6-диметилпиперазин (11,4 г, 100 ммоль, 1 экв) и дитретбутилбутилдикарбонат (21,8 г, 100 ммоль, 1 экв), затем добавляют 100 мл тетрагидрофурана, проводят реакцию при комнатной температуре в течение 4 часов и концентрируют тетрагидрофуран (пока тетрагидрофуран не израсходуется полностью) и получают 21,4 г ZTH-1 в виде оранжевого маслянистого вещества, в котором выход целевого вещества составляет 100%.

2. Получение 3,4,5-триметил-1-трет-бутил-карбонильной пиперазидина (ZTH-2):

В 250 мл колбу добавляют ZTH-1 (10,7 г, 50 ммоль, 1 экв); последовательно добавляют 100 мл тетрагидрофурана, карбонат калия (10,35 г, 75 ммоль, 1,5 экв.) и йодистый метил (8,52 г, 60 ммоль, 1,2 экв.), проводят реакцию при комнатной температуре в течение ночи; фильтруют и концентрируют, к осадку добавляют 100 мл воды и 100 мл дихлорметана и промывают дихлорметаном (50 мл×дважды), соединяют органические слои, промывают насыщенным раствором соли, сушат над безводным сульфатом натрия, концентрируют и осадок очищают колоночной хроматографией (метанол: дихлорметан=1:20), и получают 5,7 г ZTH-2 в виде оранжевого маслянистого вещества, в котором выход целевого вещества составляет 50%.

3. Получение 1,2,6-триметилпиперазина (ZTH-3):

ZTH-2 (11,4 г, 50 ммоль, 1 экв) растворяют в 100 мл диоксана, охлаждают до 0°C и медленно по каплям добавляют насыщенный раствор соляной кислоты в диоксане (4М, 25 мл, 2 экв.), перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов и выпаривают растворитель при пониженном давлении и получают ZTH-3 в виде твердого сырого продукта белого цвета, который непосредственно, без очистки используют на следующей стадии.

4. Получение 5-(2-этоксифенил-5-хлорсульфонил)-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразоло[4, 3-е]пиримидин-7-она(ZTH-4):

При температуре -10°C к 100 мл хлорсульфоновой кислоты добавляют по каплям 5-(2-этоксифенил)-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразол[4,3-D]пиримидин-7-он(50 г, 160 ммоль), в процессе капания температуру реакционного раствора поддерживают не выше 25°C, по завершении капания проводят реакцию при комнатной температуре в течение 3 часов; затем заливают реакционный раствор в колотый лед, механически перемешивают, поддерживая температуру не выше 25°C, а затем перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа, фильтруют и сушат и получают 50 г ZTH-4 в виде твердого вещества белого цвета, в котором выход целевого продукта составляет 75,9%.

5. Получение 5-[2-этоксифенил-5-(3,4,5-триметилпиперазинил)-сульфонил]-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразоло[4,3-D]пиримидин-7-она(ZTH-5):

В 500 мл тетрагидрофурана добавляют ZTH-4 (36 г, 10 ммоль, 1 экв), ZTH-3 (17,6 г, 10 ммоль, 1 экв), и триэтиламин (60,6 г, 60 ммоль, 6 экв.), перемешивают при комнатной температуре в течение ночи; выпаривают растворитель, добавляют 200 мл воды и 200 мл метиленхлорида, отделяют и последовательно промывают слой метиленхлорида насыщенным раствором бикарбоната натрия в воде затем насыщенным солевым раствором, а затем сушат и концентрируют, после перекристаллизации из 10-кратного количества этанола получают 32 г ZTH-5 в виде белого кристаллического остатка, затем после перекристаллизации из 50- кратного количества этанола получают 16,5 г белого кристаллического ZTH-5, при этом при этом выход целевого вещества составляет 37%.

(2) Получение ZTH (5-[2-этоксифенил-5-(3,4,5-триметилпиперазинил)-сульфонил]-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразоло[4,3-D]пиримидин-7-онцитрат):

В 500 мл реакционный сосуд (бутылку) добавляют 15 г соединения ZTH-5, 270 мл безводного метанола, перемешивают, нагревая до растворения, добавляют 12,5 г лимонной кислоты после осветления раствора; в ходе реакции растворения в течение примерно 1,5 часов, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют, промывают метанолом (три раза×5 мл) и сушат с получением 15 г ΖΤΗ в виде белого твердого вещества.

(1) и (2) указанные выше являются вариантами получения и (3), указанный ниже является экспериментальным воплощением.

(3) Исследования ингибирующего эффекта ΖΤΗ на ФДЭ-5

1. Ингибирующий эффект ΖΤΗ на действие ФДЭ-5 на цГМФ: Экспериментальный метод:

Для обнаружения in vitro ингибирующих эффектов различных концентраций ZTH на деградацию цГМФ под действием ФДЭ-5 используют иммуноферментный анализ. Концентрацию цГМФ определяют в соответствии с процедурой, предусмотренной для набора для иммуноферментного анализа биотрансформации цГМФ (набор ИФА) (также называемого: cGMP biotrack enzymeimmuoassy system, EIA), изготовленного компанией Amersham (компания). В качестве положительного контроля используют силденафила цитрат.

Получение реагента:

Получение ZTH и силденафил цитрата с различной концентрацией лекарственного средства:

Делают навеску ZTH для растворения в дистиллированной деминерализованной воде, соответственно, добавляют ДМСО для его растворения (препарат: ДМСО=1 моль:1 литр) в 100 мкл микролунки, конечные концентрации: 10-4 моль/литр, 10-5 моль/литр, 10-6 моль/литр, 10-7 моль/литр, 10-8 моль/литр, 10-9 моль/литр, 10-10 моль/литр, 10-11 моль/литр, 10-12 моль/литр.

Препарат сравнения, представляющий собой силденафил цитрат, готовится таким же образом, как описано выше.

Получение рабочего раствора ФДЭ-5:

Отбирают определенное количество ФДЭ-5, разбавленного соответствующим объемом буферного раствора для ИФА, где конечная концентрация составляет 1 Ед/мкл, причем раствор хранится при низкой температуре -80°C для последующего использования.

Получение цГМФ:

Делают навеску цГМФ (цГМФ, Na), растворяют в соответствующем объеме буферного раствора для ИФА, конечная концентрация цГМФ составляет 3200 фемтомоль/50 мкл, раствор хранится при низкой температуре -20°C для последующего использования.

Эксперимент:

Деградирующее действие ФДЭ5 на цГМФ:

ФДЭ-5 и цГМФ смешивают, 100 мкл микролунка содержит 3200 фмоль цГМФ, деградирующее действие ФДЭ5 на цГМФ детектируется в ходе реакции при 30°C в течение 20 минут.

Ингибирующее действие ZTH на ФДЭ5:

ZTH и силденафила цитрат, представляющий собой положительный контроль, смешивают с цГМФ соответственно и хорошо перемешивают (предполагают использование раствора ДМСО в дистиллированной деминирализованной воде в качестве отрицательного контроля) и 3 Ед ФДЭ-5 добавляют и проводят реакцию при 30°C в течение 20 мин. В 100 мкл микролунке содержатся 3200 фмоль цГМФ. Концентрация препарата может быть 10-4 моль/литр, 10-5 моль/литр, 10-6 моль/литр, 10-7 моль/литр, 10-8 моль/литр, 10-9 моль/литр, 10-10 моль/литр, 10-11 моль/литр, 10-12 моль/литр для выявления ингибирующего действия различных концентраций ZTH и положительного контроля на вызываемую ФДЭ-5, деградацию цГМФ. Вышеуказанные образцы добавляют в микролунки, покрытые антителами, а затем 100 мкл антисыворотки добавляют соответственно, чтобы приостановить реакцию, которая осуществляется при 4°C в течение 15-18 ч, а затем добавляют 50 мкл цГМФ, конъюгированного с пероксидазой, чтобы приостановить реакцию, протекавшую в течение 3 часов, а затем промывают, добавляют 200 мкл ТМБ для развития окраски и используют BIORAD 450 ИФА ридер для чтения поглощения при длине волны 630 нм. На основании измеренного значения поглощения цГМФ рассчитывают отношение В/ВО % по формуле поглощения ИФА [(ОП стандарта или образца - ОП NSB)×100/(ОП О стандарта - ОП NSB)] (NSB - фон, характеризующий неспецифическое связывание). IC50 для ZTH, силденафил цитрата, представляющего собой положительный контроль испытуемого препарата ФДЭ-5, рассчитывают с использованием линейной регрессии для аппроксимации S-кривой и кривой регрессии, построенной методом пробит.

Результаты эксперимента:

Деградирующее действие ФДЭ-5 на цГМФ

ФДЭ-5 реагирует с цГМФ при 30°C в течение 20 минут и затем ФДЭ-5 мог разрушать 3200 фмоль цГМФ до 1600 фмоль.

Ингибирующее действие ZTH на вызываемую ФДЭ-5 деградацию цГМФ:

Сравнивают ингибирующее действие различных концентраций (10-4 моль/литр, 10-5 моль/литр, 10-6 моль/литр, 10-7 моль/литр, 10-8 моль/литр, 10-9 моль/литр, 10-10 моль/литр, 10-11 моль/литр, 10-12 моль/литр), соответствующих групп ZTH, контроля испытуемого препарата и раствора ДМСО в дистиллированной деминерализованной воде на деградирующее действие ФДЭ-5 на цГМФ.

Значение IC50 препарата рассчитывают на основе различий в поглощении (значения ОП) при разных концентрациях препарата ZTH, подавляющего способность ФДЭ-5 деградировать цГМФ, используя формулу поглощения ИФА для расчета % В/ВО [(ОП стандарта или образца - ОП NSB)×100/(ОП 0 стандарта - ОП NSB)]. Данные могут быть аппроксимированы S кривой (p<0,05) с использованием линейной регрессии; IC50 рассчитывают с помощью регрессии, построенной методом пробит. Значение IC50 для ZTH составляет 2,12×10-9, и силденафил цитрата, представляющего собой положительный контроль испытуемого препарата, составляет 6,958×10-9 М.

2. Действие ZTH на вызываемый ФДЭ 5 распад цГМФ:

Экспериментальный метод:

Для обнаружения in vitro эффектов различных концентраций ZTH на деградацию цГМФ под действием ФДЭ-5 используют иммуноферментный анализ. Концентрацию цГМФ определяют в соответствии с процедурой, предусмотренной для набора для иммуноферментного анализа биотрансформации цГМФ (набор ИФА) (также называемого: cGMP biotrack enzymeimmuoassy system, EIA), сделанного Amersham. В качестве контроля используют силденафила цитрат.

Получение реагента:

Получение цАМФ:

Определенное количество цАМФ (цАМФ, Na) взвешивают и растворяют в соответствующем объеме буферного раствора для ИФА, соответственно. Конечная концентрация цАМФ составляет 1600 фмоль/50 мкл. Продукт хранят при низкой температуре -20°C для последующего использования.

Получение ZTH и силденафил цитрата и получение рабочего раствора ФДЭ-5 представляют собой такие же, как описано выше.

Эксперимент:

Деградирующее действие ФДЭ-5 на цАМФ:

ФДЭ-5 и цАМФ смешивают, 100 мкл микролунка содержит 1600 фмоль цАМФ. Деградирующее действие ФДЭ-5 на цАМФ обнаруживается в ходе реакции при 30°C в течение 20 минут.

Эффект ZTH на действие ФДЭ-5 по отношению к цАМФ:

ZTH и положительный контроль испытуемого препарата соединяют с цАМФ и тщательно перемешивают (в качестве отрицательного контроля используют раствор ДМСО в дистиллированной деминерализованной воде), и добавляют 3 Ед ФДЭ-5 и проводят реакцию при 30°C в течение 20 мин. 100 мкл микролунка содержит 1600 фмоль цАМФ. Концентрация препарата может быть 10-4 моль/литр, 10-5 моль/литр, 10-6 моль/литр, 10-7 моль/литр, 10-8 моль/литр, 10-9 моль/литр, 10-10 моль/литр, 10-11 моль/литр, 10-12 моль/литр. Перечисленные выше образцы добавляют в тестовые лунки, покрытые антителами, затем добавляют 100 мкл антисыворотки, чтобы приостановить реакцию, длившуюся при 4°C в течение 2 часов, а затем добавляют 50 мкл цАМФ, конъюгированного с пероксидазой, чтобы приостановить реакцию, осуществлявшуюся в течение 1 ч, а затем промывают, добавляют 150 мкл ТМВ для развития окраски и результаты спектрофотометрируют при длине волны 630 нм на ИФА планшет-ридере. Основываясь на измеренной величине поглощения цАМФ отношение %В/ВО рассчитывают, используя формулу поглощения ИФА [(ОП стандарта или образца - ОП NSB)×100/(ОП 0 стандарта - ОП NSB)]. Значение IC50 для ZTH, силденафил цитрата, являющегося положительным контролем испытуемого препарата, по отношению к ФДЭ-5 рассчитывают с использованием линейной регрессии для аппроксимации S кривой и регрессии, построенной методом пробит.

Результаты эксперимента:

Деградирующее действие ФДЭ-5 на цАМФ:

ФДЭ-5 не разрушает цАМФ.

Эффект ZTH на действие ФДЭ-5 по отношению к цАМФ:

Не наблюдается существенного различия в значениях ОП между ZTH группой, контрольной медицинской группой и отрицательной контрольной группой, представляющей собой дистиллированную деминерализованную воду (р>0,05), и данные не могут быть аппроксимированы S кривой (р>0,05).

Выводы:

ZTH является пиразоло-пиримидино-кетоновым соединением, химическая структура которого похожа на цГМФ и которое может конкурировать с цГМФ за связывание каталитического домена ФДЭ-5 и, таким образом, подавлять деградирующее действие ФДЭ-5 на цГМФ и увеличивать концентрацию цГМФ.

В ходе изучения ингибирующего эффекта ZTH на вызываемую ФДЭ-5 деградацию цГМФ, IC50 для ZTH (концентрация ZTH, необходимая для ингибирования ФДЭ5 на 50%) определена как 2,12 х 10-9 моль, а для положительного контроля испытуемого препарата IC50 определена как 6,958 х 10-9 моль. Результат показывает, что ZTH может подавлять деградирующее действие ФДЭ-5 на цГМФ, имеет зависимость доза-эффект и является очень хорошим ингибитором ФДЭ-5. Его ингибирующая активность по отношению к ферменту ФДЭ-5 значительно лучше, чем ингибирующая активность силденафил цитрата. Таким образом, ZTH потенциально может быть основой для разработки препаратов нового поколения для лечения эректильной дисфункции, для ингибирования агрегации тромбоцитов и борьбы с тромбозом, для снижения легочной гипертензии и борьбы с сердечно-сосудистыми заболеваниями, для борьбы с астмой и лечения диабетического гастропареза.

В приведенных выше экспериментальных воплощениях изобретения, хотя раскрыты только экспериментальные данные, касающиеся ZTH, ввиду того, что ZTH является цитратом ZTH-5 и ZTH-5 имеет схожую структуру с ZTH (т.е. ZTH-5 и соли ZTH-5, кроме цитрата, имеют структуру, аналогичную ZTH, и имеют общую пиразоло-пиримидин-кетоновую структуру), из экспериментальных эффектов ZTH может быть сделано заключение, что ZTH-5, соли ZTH-5, кроме цитрата, обладают ингибирующим действием на вызываемую ФДЭ-5 деградацию цГМФ и являются ингибитором ФДЭ-5 и потенциально могут быть основой для разработки препаратов нового поколения для лечения эректильной дисфункции, для ингибирования агрегации тромбоцитов и лечения тромбоза, для снижения легочной гипертензии и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, для лечения астмы и лечения диабетического гастропареза.

Похожие патенты RU2547465C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИРАЗОЛОПИРИМИДИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ ИЛИ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫХ СОЛЕЙ 1991
  • Эндрю Саймон Белл[Gb]
  • Дэвид Браун[Gb]
  • Николас Кеннет Терретт[Gb]
RU2047617C1
ПИРАЗОЛОПИРИМИДИНОНЫ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ ЦИКЛИЧЕСКОГО ГУАНОЗИН-3',5'-МОНОФОСФАТА 1992
  • Эндрю Симон Белл
  • Николас Кеннет Терретт
RU2114113C1
ПИРАЗИЛПИРИМИДИНОНЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИМПОТЕНЦИИ 1994
  • Эллис Питер
  • Терретт Николас Кеннет
RU2373938C9
ПИРАЗОЛОПИРИМИДИНОНОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ 1991
  • Эндрю Симон Белл
  • Дэвид Браун
  • Николас Кеннет Терретт
RU2114114C1
ПИРАЗОЛПИРИМИДИНОНЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИМПОТЕНЦИИ 1994
  • Питер Эллис
  • Николас Кеннет Терретт
RU2130776C1
ПРОИЗВОДНЫЕ БЕТА-КАРБОЛИНА, ОБЛАДАЮЩИЕ ДЕЙСТВИЕМ ИНГИБИТОРОВ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ДЕЙСТВИЯ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЦГМФ 2001
  • Суи Зихуа
  • Макайлэг Марк Дж.
RU2271358C2
ПИРАЗОЛОПИРИМИДОНОВОЕ СОЕДИНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЭРЕКТИЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ 2012
  • Ван Цзяньпин
  • Ван Цзяньго
RU2555364C2
ИНГИБИТОРЫ ФДЭ И ИХ КОМБИНАЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ УРОЛОГИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ 2006
  • Ульбрих Эрнст
  • Занднер Петер
  • Тинель Ханна
  • Хюттер Йоахим
RU2435588C2
КРИСТАЛЛ ПИРРОЛОПИРИМИДИНА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ JAK-ИНГИБИТОРА 2017
  • Чжоу Чжоу
  • Чжан Аймин
  • Чжан Сицюань
  • Яо Хуадун
RU2746045C2
НОВЫЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СЕКСУАЛЬНЫХ РАССТРОЙСТВ 2005
  • Мендла Клаус
  • Пайк Роберт
  • Айзенрайх Вольфрам
  • Фридль Томас
RU2445095C2

Реферат патента 2015 года СОЕДИНЕНИЕ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИНГИБИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ В ОТНОШЕНИИ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ 5 ТИПА, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к цитрату соединения, имеющему приведенную ниже формулу (II), и фармацевтической композиции, содержащей заявленный цитрат. Экспериментальные результаты настоящего изобретения доказывают, что заявленный цитрат может подавлять активность фосфодиэстеразы 5 типа и может быть использован для лечения эректильной дисфункции, для ингибирования агрегации тромбоцитов и лечения тромбозов, для снижения легочной гипертензии и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, лечения астмы и диабетического гастропареза. 2 н.п. ф-лы.

Формула изобретения RU 2 547 465 C2

1. Соединение, представляющее собой 5-[2-этоксифенил-5-(3,4,5-триметилпиперазинил)-сульфонил]-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-он цитрат формулы II:

2. Фармацевтическая композиция для ингибирования фосфодиэстеразы 5 типа, включающая 5-[2-этоксифенил-5-(3,4,5-триметилпиперазинил)-сульфонил]-1-метил-3-пропил-1,6-дигидро-7Н-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-он цитрат по п.1 в качестве эффективного компонента и общеизвестный носитель лекарственного средства и/или эксципиент.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2015 года RU2547465C2

СN 1517349 A, 04.08.2004;
Разъемный контейнер 1972
  • Богрец Герман Николаевич
  • Дудкин Вячеслав Федорович
  • Зубов Станислав Павлович
  • Павлюченко Аза Тимофеевна
  • Галяс Рита Андреевна
SU463756A1
Способ обработки целлюлозных материалов, с целью тонкого измельчения или переведения в коллоидальный раствор 1923
  • Петров Г.С.
SU2005A1
Соединительное устройство для подвода охлаждающей жидкости к полым проводникам или для ее отвода от полых проводников стержней статорной обмотки электрической машины 1985
  • Эрнст Брем
SU1400522A3
Транспортер для перевозки товарных вагонов по трамвайным путям 1919
  • Калашников Н.А.
SU102A1

RU 2 547 465 C2

Авторы

Чжан Нань

Чжун Жун

Даты

2015-04-10Публикация

2010-07-30Подача