ПРИМЕНЕНИЕ ПАРА-НИТРОАМИНОПРОИЗВОДНЫХ В КОРМЕ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ МЕТАНА У ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2017 года по МПК A23K50/10 A23K20/111 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению, по меньшей мере, одного соединения, принадлежащего к классу пара-нитроаминопроизводных, для снижения образования метана, выделяющегося при пищеварительной деятельности у жвачных животных и/или для улучшения продуктивности жвачных животных.

Настоящее изобретение также относится к корму для животных или кормовым композициям для животных и кормовым добавкам, включающим указанные выше соединения. Термин «корм» или «кормовая композиция» обозначает любое соединение, препарат, смесь или композицию, подходящие для или предназначенные для потребления животным.

Уровень техники

В данном контексте жвачное животное представляет собой млекопитающее отряда парнокопытных, которое переваривает корм на растительной основе, сначала смягчая его в первом отделе желудка, известном как рубец, затем отрыгивая полупереваренную массу, теперь известную как жвачка, и снова ее пережевывая. Процесс повторного жевания жвачки для дополнительного разрушения растительного вещества и стимуляции переваривания, называется «жеванием».

Ферментация в рубце несет с собой некоторые недостатки. Образуется метан как естественное следствие анаэробной ферментации, что представляет собой потерю энергии для животного-хозяина. Углеводы дают до 70-80% сухого вещества в типичном рационе молочного скота, и несмотря на это, всасывание углеводов из желудочно-кишечного тракта обычно весьма ограничено. Причиной этого является экстенсивная ферментация углеводов в рубце, приводящая к образованию ацетата, пропионата и бутирата как основных продуктов. Такие продукты являются частью так называемых летучих жирных кислот (VFA).

Кроме уноса энергии, метан также является парниковым газом, который во много раз сильнее, чем CO₂. Его концентрация в атмосфере удвоилась за последнее столетие и продолжает возрастать, что вызывает тревогу. Жвачные животные являются основными «вкладчиками» в образование биогенного метана, и согласно оценке, предотвращение образования метана от жвачных животных могло бы почти стабилизировать концентрации метана в атмосфере.

Кроме того, оценка Киотского протокола и затем саммит по вопросам климата в Копенгагене в 2009 устанавливают повышенный приоритет снижения выделений метана как часть стратегии по ряду газов. Наиболее эффективные добавки, используемые в настоящее время для снижения образования метана, содержат антибиотики, которые уменьшают пролиферацию микроорганизмов, поставляющих водород (H₂) для метаногенеза (Sauer et al., 1998, American Society of Animal Science; 76:906-914). Однако действие антибиотиков на образование метана имеет некоторые недостатки из-за быстрой адаптации микрофлоры и/или развития резистентности, ведущие к полной потере предполагаемого действия за короткий период времени (2-3 недели), и из-за запрещения в Европе применения антибиотиков для нелечебного использования.

Недавно описаны неантибиотические продукты (производные желчных кислот), ведущие к уменьшению выделения метана при испытании in vitro на модели стимуляции рубца (WO 2010072584). Однако количество, требуемое для получения умеренного снижения выделения метана, несовместимо с ограничениями по стоимости в производстве кормов для жвачных животных.

В таких обстоятельствах еще существует потребность в разработке новых веществ, которые уменьшают образование метана и которые находятся в согласии с достоверной и общепринятой практикой и не являются лекарственными по природе. Кроме уменьшения выделения метана такие вещества также могут вносить вклад в улучшение продуктивности жвачных животных путем улучшения коэффициента конверсии корма, снижения потребления корма, улучшения прироста массы и/или улучшения туши или выхода молока.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что соединения, описанные в данном описании далее, имеют высокий потенциал для использования в корме для животных в плане существенного уменьшения образования метана без воздействия на ферментацию микроорганизмами способом, который мог бы быть вредным для животного-хозяина. Более того, соединения по настоящему изобретению также весьма полезны с точки зрения общей продуктивности животного при измерении по коэффициенту конверсии корма, потреблению корма, приросту массы, выходу туши или выходу молока. Указанные соединения также более устойчивы, чем соединения, описанные на известном уровне техники, безопаснее для животного и человека, ведут к устойчивому эффекту снижения метана, они не влияют на вкусовые качества, их можно получать в промышленном масштабе с затратами, совместимыми с производством кормов для животных, и, всего важнее, они не вызывают накопления какого-либо метаболита в молоке или мясе получающего их животного, и они являются активными при весьма низкой концентрации в рубце.

В частности, авторы настоящего изобретения наблюдали, что скармливание жвачным животным, по меньшей мере, одного пара-нитроаминопроизводного является весьма эффективным для уменьшения образования выделений метана при пищеварительной деятельности у жвачных животных без отрицательного влияния на общее образование VFA, и/или для улучшения продуктивности жвачных животных. Кроме того, авторы настоящего изобретения показывают, что когда заменяется аминофункция или когда пара-положение нитрогруппы изменяется на мета-, методическое воздействие на образование метана теряется.

Раскрытие изобретения

Следовательно, настоящее изобретение относится к применению, по меньшей мере, одного соединения, определяемого формулой (I), или его соли в качестве активного соединения при кормлении животных для уменьшения образования выделения метана при пищеварительной деятельности у жвачных животных и/или для улучшения продуктивности жвачных животных.

В указанной формуле R¹ и R² представляют собой, независимо один от другого, H, -CH₃ или -CH₂R³, и при этом R³ представляет собой насыщенную или ненасыщенную линейную, разветвленную или циклическую углеводородную группу C₁-C₈, необязательно замещенную 1-3 группами, выбранными из -OH, -NH₂, -COOH, и при этом один или два атома углерода в углеводороде C₁-C₈ необязательно заменены атомом азота или атомом кислорода.

Изобретение также относится к способу уменьшения образования выделения метана при пищеварительной деятельности у жвачных животных и/или для улучшения продуктивности жвачных животных, включающему пероральное введение животному достаточного количества, по меньшей мере, одного пара-нитроаминопроизводного или его соли, определяемых формулой (I). Под пероральным введением следует понимать простое кормление или ручное введение болюса.

Во всех воплощениях настоящего изобретения соединение формулы (I) или его соль определяются следующим соединением формулы (I)

при этом R¹ и R² представляют собой, независимо один от другого, H, -CH₃ или -CH₂R³, и при этом R³ представляет собой насыщенную или ненасыщенную линейную, разветвленную или циклическую углеводородную группу C₁-C₈, необязательно замещенную 1-3 группами, выбранными из -OH, -NH₂, -COOH, и при этом один или два атома углерода в углеводороде C₁-C₈ необязательно заменены атомом азота или атомом кислорода.

В другом воплощении предпочтительные соединения формулы (I) по настоящему изобретению представляют собой соединения, в которых R¹ представляет собой H или -CH₃. Более предпочтительными соединениями формулы (I) являются соединения, в которых R¹ представляет собой H или -CH₃, R² представляет собой H, -CH₃ или -CH₂R³, и R³ представляет собой насыщенную или ненасыщенную линейную или разветвленную углеводородную группу C₁-C₄. Еще более предпочтительными соединениями формулы (I) являются соединения, в которых R¹ представляет собой H или -CH₃, R² представляет собой H, -CH₃ или -CH₂R³, и R³ представляет собой насыщенную линейную или разветвленную углеводородную группу C₁-C₃.

Наиболее предпочтительные соединения по настоящему изобретению выбирают из группы соединений, включающей (4-нитрофенил)амин, метил(4-нитрофенил)амин, этил(4-нитрофенил)амин, диметил(4-нитрофенил)амин, (4-нитрофенил)пропиламин, изопропил(4-нитрофенил)амин, 2-(4-нитрофениламино)этанол, 3-(4-нитрофениламино)пропан-1-ол, 4-нитро-N-(пиридин-2-илметил)анилин, 4-((4-нитрофениламино)метил)бензойную кислоту и 3-((4-нитрофениламино)метил)бензойную кислоту, перечисленные и отображенные в таблице 1.

Следует иметь в виду, что для всех воплощений настоящего изобретения соединения формулы (I) могут находиться в любой изомерной форме.

Соединения по настоящему изобретению также включают соли соединений формулы (I). Предпочтительные катионы для получения солей можно выбрать из группы, состоящей из натрия (Na+), калия (K+), лития (Li+), магния (Mg2+), кальция (Ca2+), бария (Ba2+), стронция (Sr2+) и аммония (NH4+). Соли также можно получить из щелочного металла или щелочноземельного металла.

Соединения по настоящему изобретению можно получить в принципе согласно синтетическим методам, само по себе известным в технике, и/или на основе способов, описанных в примерах.

Во всех указанных случаях соответствующие способы очистки продукта (соединений формулы (I)), например, колоночная хроматография, могут быть выбраны специалистом в данной области техники, или соединение формулы (I) можно выделить и очистить способами, само по себе известными.

Выделение метана жвачными животными можно легко измерить у отдельных животных в обменной камере способами, известными в технике (Grainger et al., 2007, J. Dairy Science; 90:2755-2766). Кроме того, его также можно оценить на уровне скотного двора методом выявления с использованием лазерного луча (McGinn et al., 2009, Journal of Environmental Quality; 38:1796-1802). С другой стороны, метан, выработанный молочным жвачным животным, также можно оценить путем измерения профилей VFA молока согласно WO 2009/156453.

Продуктивность жвачного животного можно оценить методами, хорошо известными в технике, и обычно ее характеризуют коэффициентом конверсии корма, потреблением корма, приростом массы, выходом туши или выходом молока.

Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) или его соли по настоящему изобретению в комбинации с, по меньшей мере, одним дополнительным активным веществом, которое показывает подобные действия в отношении образования метана в рубце, и которое выбирают из группы, включающей диаллилдисульфид, чесночное масло, аллилизотиоцианат, дезоксихолевую кислоту, хенодезоксихолевую кислоту и их производные.

Другими компонентами, которые могут предоставляться вместе с соединением по настоящему изобретению, являются, например, дрожжи, эфирные масла и ионофоры, подобные моненсину и руменсину.

В данном случае предполагается, что диаллилдисульфид, чесночное масло, аллилизотиоцианат, дезоксихолевая кислота, хенодезоксихолевая кислота и их производные вводятся независимо в дозировочных интервалах, например, 0,01-500 мг активного вещества на кг корма (ч/млн). Такие соединения или доступны коммерчески или могут быть легко получены специалистом с использованием процессов и способов, хорошо известных на известном уровне техники.

Жвачные млекопитающие согласно настоящему изобретению включают крупный рогатый скот, коз, овец, жирафов, американского бизона, зубра, яков, азиатского буйвола, оленя, верблюдов, альпак, лам, гну, антилопу, вилорога и нильгау.

Для всех воплощений настоящего изобретения крупный рогатый скот, козы, овцы, американский бизон, яки и азиатский буйвол являются предпочтительными видами. Более предпочтительными видами являются домашний крупный рогатый скот, овцы и козы, наиболее предпочтительным видом является домашний крупный рогатый скот. Термин включает все породы домашнего крупного рогатого скота и все продуктивные виды крупного рогатого скота, в частности, молочных коров и мясной скот.

Настоящее изобретение также относится к применению, по меньшей мере, одного соединения формулы (I) или его соли по настоящему изобретению, при этом образование метана у жвачных животных, вычисленное в литрах на килограмм потребленной сухой массы, снижается, по меньшей мере, на 10% при измерении в обменных камерах. Предпочтительно уменьшение метана составляет, по меньшей мере, 15%, предпочтительнее, по меньшей мере, 20%, даже предпочтительнее, по меньшей мере, 25%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 30%. Также можно использовать другие методы измерения выделения метана, подобные использованию лазерного луча или, в случае молочных жвачных животных, корреляции образования метана с профилем VFA в молоке.

Настоящее изобретение также относится к применению, по меньшей мере, одного соединения формулы (I) или его соли по настоящему изобретению, при этом коэффициент конверсии корма у жвачного животного снижается, по меньшей мере, на 1% при измерении в обычном испытании на продуктивность. Предпочтительно коэффициент конверсии корма снижается, по меньшей мере, на 2%, предпочтительнее, по меньшей мере, на 2,5%, даже предпочтительнее, по меньшей мере, на 3%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 3,5%.

Настоящее изобретение также относится к применению, по меньшей мере, одного соединения формулы (I) или его соли по настоящему изобретению, при этом количество соединения формулы (I), вводимое жвачному животному, составляет 1 мг-10 г на кг корма, предпочтительно, от 10 мг до 1 г на кг корма, предпочтительнее, от 50 мг до 500 мг на кг корма. Однако для применения в корме для животных соединения формулы (I) или их соли не требуют очистки; они могут включать, например, другие соединения и производные.

Как указано выше, соединения по настоящему изобретению применимы в качестве соединений для кормовых добавок и кормовых композиций для жвачных животных и соответственно, применимы в качестве активных ингредиентов в таком корме для уменьшения образования метана в пищеварительном тракте животного и/или улучшения продуктивности животного. Для реализации их применения в качестве таких ингредиентов для корма жвачных животных соединения могут быть включены в корм способами, известными сами по себе в области получения и переработки кормов.

Поэтому другими аспектами настоящего изобретения являются композиции, т.е., кормовые добавки и кормовые композиции для животных, содержащие соединения, определенные в данном описании выше. Поэтому настоящее изобретение также относится к кормовой композиции или кормовой добавке, включающей, по меньшей мере, одно соединение формулы (I) или его соль. В предпочтительном воплощении композиция представляет собой минеральный премикс, витаминный премикс, включающий витамины или минералы или болюс.

Обычная суточная дозировка соединения по изобретению, получаемая животным с потребляемым кормом, зависит от вида животного и его состояния. Обычно дозировка должна находиться в интервале от примерно 1 мг до примерно 10 г, предпочтительно, от примерно 10 мг до примерно 1 г, предпочтительнее, 50 мг-500 мг соединения на кг корма.

Соединение формулы (I) или его соль можно использовать в комбинации с обычными ингредиентами, присутствующими в кормовой композиции (питании) для животных, такими как карбонат кальция, электролиты, такие как хлорид аммония, белки, такие как соевая мука, пшеница, крахмал, жмых подсолнечника, кукуруза, мясная и костная мука, аминокислоты, животный жир, витамины и микроэлементы.

Отдельные примеры композиций по изобретению представляют собой следующее:

- кормовая добавка для животных, включающая (a), по меньшей мере, одно соединение, выбранное из таблицы 1, и (b), по меньшей мере, один жирорастворимый витамин, (c), по меньшей мере, один водорастворимый витамин, (d), по меньшей мере, один микроэлемент и (e), по меньшей мере, один макроэлемент;

- кормовая композиция для животных, включающая, по меньшей мере, одно соединение, выбранное из таблицы 1, и содержание сырого белка 50-800 г/кг корма.

Так называемые премиксы являются примерами кормовых добавок для животных по изобретению. Премиксом называют предпочтительно однородную смесь одного или нескольких микроингредиентов с разбавителями и/или носителем. Премиксы используют для облегчения равномерного распределения микроингредиентов в большем объеме смеси.

Кроме активных ингредиентов по изобретению, премикс по изобретению содержит, по меньшей мере, один жирорастворимый витамин и/или, по меньшей мере, один водорастворимый витамин и/или, по меньшей мере, один микроэлемент и/или, по меньшей мере, один макроэлемент, иными словами, премикс по изобретению включает, по меньшей мере, одно соединение по изобретению вместе с, по меньшей мере, одним дополнительным компонентом, выбранным из группы, состоящей из жирорастворимых витаминов, водорастворимых витаминов, микроэлементов и макроэлементов.

Макроэлементы можно добавлять в корм отдельно. Поэтому в отдельном воплощении премикс включает активные ингредиенты по изобретению вместе с, по меньшей мере, одним дополнительным компонентом, выбранным из группы, состоящей из жирорастворимых витаминов, водорастворимых витаминов и микроэлементов.

Далее приводятся неэксклюзивные перечни примеров таких компонентов.

- Примерами жирорастворимых витаминов являются витамин A, витамин D3, витамин E и витамин K, например, витамин K3.

- Примерами водорастворимых витаминов являются витамин B12, биотин и холин, витамин B1, витамин B2, витамин B6, ниацин, фолиевая кислота и пантотенат, например, Ca-D-пантотенат.

- Примерами микроэлементов являются марганец, цинк, железо, медь, иод, селен и кобальт.

- Примерами макроэлементов являются фосфор и натрия.

Что касается композиций корма для жвачных животных, таких как коровы, а также их ингредиентов, то питание жвачных животных обычно состоит из легко разрушаемой фракции (называемой концентратом) и богатой волокнами труднее разрушаемой фракции (называемой сеном, фуражом или грубым кормом).

Сено получают из сухой травы, бобовых растений или цельных зерновых культур. Травы включают, среди прочего, тимофеевку, плевелы, овсяницы. Бобовые растения включают, среди прочего, клевер, люцерну, горох, сою и вику. Цельные зерновые культуры включают, среди прочего, ячмень, маис (кукурузу), овес, сорго. Другие кормовые культуры включают сахарный тростник, кормовую капусту, рапс и капусту огородную. Также для кормления жвачных животных используют корнеплоды, такие как турнепс, брюква, mangles, свекла кормовая и сахарная свекла (включая пульпу сахарной свеклы и свеклосахарную мелассу). Еще другими культурами являются клубневые, такие как картофель, кассава и сладкий картофель. Силос является засилосованным вариантом богатой волокнами фракции (например, из трав, бобовых или цельных зерновых культур), когда материал с высоким содержанием воды обрабатывают в процессе анаэробного брожения (естественного сбраживания или при дополнительной обработке).

Концентрат в основном изготовляется из зерновых культур (таких как ячмень, включая пивную дробину и сухую барду, маис, пшеница, сорго), но также часто содержит богатые белком ингредиенты корма, такие как соевые бобы, семена рапса, ядро кокосового ореха, семена хлопчатника и подсолнечник.

Коровам также можно скармливать общие смешанные рационы (TMR), когда все компоненты питания, например, фураж, силос и концентрат, смешивают вместе перед раздачей.

Как указано выше, премикс является примером кормовой добавки, которая может включать активные компоненты по изобретению. Предполагается, что соединения можно вводить животному в других различных формах. Например, соединения также можно включить в болюс, который будет помещен в рубец и который будет высвобождать определенное количество активных соединений непрерывно в точно установленных дозировках в течение определенного периода времени.

Настоящее изобретение также относится к способу уменьшения образования выделения метана при пищеварительной деятельности у жвачных животных и/или для улучшения продуктивности жвачных животных, включающему пероральное введение достаточного количества, по меньшей мере, одного соединения формулы (I) или его соли с помощью предпочтительных воплощений, описанных выше.

Кроме того, изобретение также относится к способу, описанному выше, при этом соединение формулы (I) вводят животному в комбинации с, по меньшей мере, одним дополнительным активным веществом, выбранным из группы, включающей диаллилдисульфид, чесночное масло, дезоксихолиевую кислоту, хенодезоксихолиевую кислоту и их производные.

Изобретение также относится к способу, описанному выше, при этом жвачное животное выбирают из группы, включающей крупный рогатый скот, коз, овец, жирафов, американского бизона, зубра, яков, азиатского буйвола, оленя, верблюдов, альпак, лам, гну, антилопу, вилорога и нильгау, и предпочтительнее, из группы, включающей крупный рогатый скот, коз и овец.

Изобретение также относится к способу, описанному выше, при этом количество, по меньшей мере, одного активного соединения, определенного формулой (I), вводимого жвачному животному, составляет от примерно 1 мг до примерно 10 г на кг корма, предпочтительно, от примерно 10 мг до примерно 1 г, предпочтительнее, от 50 мг до 500 мг на кг корма.

Изобретение также относится к способу, описанному выше, при этом образование метана у жвачных животных, вычисленное в литрах на килограмм потребленного сухого вещества, снижается, по меньшей мере, на 10%, когда измеряется в обменных камерах. Предпочтительно образование метана снижается, по меньшей мере, на 15%, предпочтительнее, по меньшей мере, на 20%, даже предпочтительнее, по меньшей мере, на 25%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 30%. Также можно использовать другие способы измерения выделения метана, подобные использованию лазерного луча или, в случае молочных жвачных животных, корреляции образования метана с профилем VFA в молоке.

Изобретение также относится к способу, описанному выше, при этом коэффициент конверсии корма для жвачного животного уменьшается, по меньшей мере, на 1%, когда измеряется в обычном испытании на продуктивность. Предпочтительно коэффициент конверсии корма уменьшается, по меньшей мере, на 2%, предпочтительнее, по меньшей мере, на 2,5%, даже предпочтительнее, по меньшей мере, на 3%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 3,5%.

Настоящее изобретение также описывается с помощью приведенных далее примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.

Осуществление изобретения

Примеры

Пример 1. Испытание in vitro на образование метана

Используют модифицированную версию «Hohenheim Forage value Test (HFT)» для проверки действия определенных соединений на функции рубца, имитированные такой системой in vitro.

Основы

Корм загружают в шприц с композицией из жидкости рубца и соответствующей смеси буферов. Раствор инкубируют при 39°C. Через 8 часов измеряют количество (и состав) образовавшегося метана и вставляют в формулу для конверсии.

Реагенты

Раствор массовых элементов:

- 6,2 г дигидрофосфата калия (KH₂PO₄),

- 0,6 г гептагидрата сульфата магния (MgSO₄•7H₂O),

- 9 мл концентрированной фосфорной кислоты (1 моль/л),

- все растворено в дистиллированной воде до 1 л (pH примерно 1,6).

Буферный раствор:

- 35,0 г гидрокарбоната натрия (NaHCO₃),

- 4,0 г гидрокарбоната аммония ((NH₄)HCO₃),

- все растворено в дистиллированной воде до 1 л.

Раствор микроэлементов:

- 13,2 г дигидрата хлорида кальция (CaCl₂•Н₂О),

- 10,0 г тетрагидрата хлорида марганца (II) (MnCl₂•4Н₂О),

- 1,0 г гексагидрата хлорида кобальта (II) (CoCl₂•6Н₂О),

- 8,0 г хлорида железа (III) (FeCl₃•6H₂O),

- все растворено в дистиллированной воде до 100 мл.

Раствор натриевой соли:

- 100 мг натриевой соли

- растворены в дистиллированной воде в количестве до 100 мл.

Раствор для восстановления:

- сначала 3 мл раствора гидроксида натрия (c=1 моль/л), затем 427,5 мг гидрата сульфида натрия (Na₂S•H₂O) добавляют к 71,25 мл H₂O,

- раствор необходимо получать незадолго до его добавления к раствору среды.

Процедура

Взвешивание образцов

Корм просеивают до 1 мм - обычно TMR (44% концентрата, 6% сена, 37% кукурузного силоса и 13% силоса из злаковых трав) - и точно взвешивают в 64 шприца. Из таких шприцов 4 являются субстратными контролями, которые отображают образование газа в отсутствие действия испытываемых соединений. Другие 4 шприца являются положительным контролем, и в них добавляют бромэтансульфонат до 0,1 мМ. При необходимости 4 шприца содержат контроль носитель (если для испытываемых соединений требуется носитель). Остальные шприцы содержат испытываемые вещества группами по 4 шприца.

Получение раствора среды

Компоненты смешивают в склянке Вульфа в следующем порядке:

- 711 мл воды,

- 0,18 мл раствора микроэлементов,

- 355,5 мл буферного раствора,

- 355,5 мл раствора массовых элементов.

Полный раствор нагревают до 39°C, затем добавляют 1,83 мл раствора натриевой соли, и при 36°C добавляют раствор для восстановления. Жидкость рубца добавляют, когда индикатор изменит цвет.

Экстрагирование жидкости рубца

К приблизительно 1400 мл раствора среды при непрерывном перемешивании и выделении CO₂ добавляют 750 мл жидкости рубца.

Наполнение шприцов, инкубация и определение объемов газа и величин VFA

В стеклянный шприц загружают жидкость рубца (24 мл). Затем шприцы инкубируют в течение 8 часов при 39°C при легком перемешивании. Через 8 часов измеряют объем образовавшегося газа, и определяют процент метана в газовой фазе методом газовой хроматографии.

Результаты

Ферментированный корм представляет собой искусственный TMR (44% концентрата, 6% сена, 37% кукурузного силоса и 13% силоса из злаковых трав). В шприцы для ферментации добавляют соединения, полученные так, как описано в примерах 3-11, в концентрации от 1 до 0,1% на сухое вещество (DM). Результаты действия in vitro представлены в следующей таблице.

Пример 2. Пример для сравнения: испытания in vitro на образование метана

Такой же анализ, как описанный в примере 1, выполняют с рядом молекул, при этом или аминогруппа заменена или аминогруппа находится не в пара-положении. Данные показывают, что существенное снижение активности образования метана наблюдается только тогда, когда присутствует аминогруппа, и когда она находится в пара-положении (сравните таблицу 2 с таблицей 3).

Таблица 3. Эффект уменьшения метана, являющийся средним из результатов двух экспериментов с указанными ниже соединениями, в которых аминогруппа заменена, или в которых положение аминогруппы изменено. (Целое число в колонке, отражающей влияние на изменение метаногенеза (%), обозначает уменьшение образования метана по сравнению с контролем; отсутствие величины означает, что концентрацию не испытывали).

Для данного примера для сравнения соединения в таблице 3 закупают у поставщиков химических продуктов или получают согласно описанным далее способам.

Соединение B: 3-нитрофениламин

3-Нитрофениламин закупают у Lancaster. CAS [99-09-2]. Каталожный # 4063. Партия # 000084111Н. ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6): δ 5,79 (уширенный с, 2H), 6,89-6,96 (м, 1H), 7,19-7,31 (м, 2H), 7,35 (т, J=2,0 Гц, 1H). МС: 139,0 [C6H6N2O2+H]⁺.

Соединение D: синтез 4-(4-нитрофеноксиметил)бензойной кислоты

Метиловый эфир 4-(4-нитрофеноксиметил)бензойной кислоты 2

К суспензии гидроксида калия (1,70 г, 1,0 экв.) в безводном диметилформамиде (100 мл) добавляют 4-нитрофенол (2,53 г, 1,2 экв.) и метил-4-(бромметил)бензоат 1 (3,48 г, 1,0 экв.). Реакционную смесь перемешивают при 100°C в течение 18 часов. После добавления воды (200 мл) смесь экстрагируют этилацетатом (3×100 мл), экстракты сушат над сульфатом магния, и растворители выпаривают в вакууме. Остаточную суспензию (в диметилформамиде) отфильтровывают, и остаточные растворители выпаривают в вакууме, и получают соединение 2 в виде желтоватого порошка; выход 2,98 г (10,37 ммоль, 68%).

4-(4-Нитрофеноксиметил)бензойная кислота 3

К раствору соединения 2 (2,98 г, 1,0 экв.) в ацетонитриле (200 мл) добавляют 3 N соляную кислоту (200 мл). Реакционную смесь перемешивают при 100°C в течение 72 часов. Полученное выпавшее в осадок вещество отфильтровывают, и получают соединение 3 в виде белого порошка; выход 1,33 г (4,87 ммоль, 47%).

1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6): δ 5,35 (с, 2H), 7,22 (д, J=9,3 Гц, 2H), 7,56 (д, J=8,4 Гц, 2H), 7,96 (д, J=8,4 Гц, 2H), 8,21 (д, J=9,3 Гц, 2H), 12,97 (уширенный с, 1H). МС: 274.1 [C14H11NO5+H]⁺.

Соединение F: 4-(4-нитрофенил)морфолин

4-(4-Нитрофенил)морфолин закупают у ABCR. CAS [10389-51-2]. Каталожный # AV24933/AB146794. Партия # 1196165.

Пример 3. Синтез метил(4-нитрофенил)амина

Метил(4-нитрофенил)амин закупают у Alfa Aesar. CAS [100-15-2]. Каталожный # А15548. Партия # А6950А. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6): δ 2,77 (д, J=5,0 Гц, 3H), 6,58 (д, J=9,3 Гц, 2H), 7,27 (уширенный с, 1H), 7,98 (д, J=9,3 Гц, 2H). МС: 153,0 [C7H8N2O2+H]⁺.

Пример 4. Синтез этил(4-нитрофенил)амина

Этил-(4-нитрофенил)амин закупают у Sigma-Aldrich. CAS [3665-80-3]. Каталожный # 328499. Партия # 1061МС. 1H ЯМР (300 МГц, CHCl3-d): δ 1,16 (т, J=7,2 Гц, 3H), 3,07-3,22 (м, 2H), 6,60 (д, J=9,3 Гц, 2H), 7,15-7,25 (м, 1H), 7,97 (д, J=9,3 Гц, 2H). МС: 167,0 [C8H10N2O2+H]⁺.

Пример 5. Синтез диметил(4-нитрофенил)амина

Диметил(4-нитрофенил)амин закупают у Alfa Aesar. CAS [100-23-2]. Каталожный # L0040G. Партия # 10107319. 1H ЯМР (300 МГц, CHCl3-d): δ 3,07 (с, 6H), 6,75 (д, J=9,5 Гц, 2H), 8,03 (д, J=9,5 Гц, 2H). МС: 167,0 [C8H10N2O2+H]⁺.

Пример 6. Синтез (4-нитрофенил)пропиламина

К раствору 4-нитроанилина 1 (3,00 г, 1,0 экв.) в 70 мл абсолютного этанола добавляют пропиональдегид (1,90 г, 1,2 экв.) и ледяную уксусную кислоту (2,48 мл, 2,0 экв.). Реакционную смесь греют при 70°C в течение 24 часов в запаянной пробирке. После охлаждения до комнатной температуры добавляют по частям цианоборогидрид натрия (2,18 г, 1,6 экв.), и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. После добавления воды (50 мл) смесь экстрагируют этилацетатом (3×100 мл), экстракты сушат над сульфатом натрия, и растворители выпаривают в вакууме. Остаток абсорбируют на силикагеле и очищают флэш-хроматографией (циклогексан/этилацетат от 100/0 до 100/0 и затем циклогексан/этилацетат от 100/0 до 80/20), и получают 0,87 г соединения 2 в виде желтого порошка; выход 0,78 г (4,33 ммоль, 22%).

1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6): δ 0,89 (т, J=7,3 Гц, 3H), 1,56 (секст, J=7,3 Гц, 2H), 3,02-3,15 (м, 2H), 6,61 (д, J=9,3 Гц, 2H), 7,20-7,32 (м, 1H), 7,96 (д, J=9,3 Гц, 2H). МС: 181,0 [C9H12N2O2+H]⁺.

Пример 7. Синтез изопропил(4-нитрофенил)амина

Изопропил(4-нитрофенил)амин закупают у Alfa Aesar. CAS [25186-43-0]. Каталожный # Н52375. Партия # А05Х026. 1H ЯМР (300 МГц, CHCl3-d): δ 1,15 (д, J=6,4 Гц, 6H), 3,58-3,77 (м, 1H), 6,60 (д, J=9,3 Гц, 2H), 7,13 (д, J=7,5 Гц 1H), 7,96 (д, J=9,3 Гц, 2H). МС: 191,0 [C9H12N2O2+H]⁺.

Пример 8. Синтез 2-(4-нитрофениламино)этанола

4-Нитроанилин 1 (2,00 г, 1,0 экв.) смешивают с 2-бромэтанолом (0,71 мл, 0,7 экв.) в запаянной пробирке. Реакционную смесь перемешивают при 90°C в течение 72 часов. После разбавления этилацетатом (50 мл) и раствором (1 N) гидроксида натрия (50 мл) смесь экстрагируют этилацетатом (3×100 мл), экстракты промывают раствором (1 N) гидроксида натрия (2×50 мл), промывают водой (50 мл), сушат над сульфатом натрия, и растворители выпаривают в вакууме. Остаток абсорбируют на силикагеле и очищают флэш-хроматографией (циклогексан/этилацетат от 100/0 до 100/0 и затем циклогексан/этилацетат от 100/0 до 30/70), и получают соединение 2 в виде желтого порошка; выход 1,13 г (6,2 ммоль, 61%).

1Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6): δ 3,15-3,27 (м, 2H), 3,49-3,60 (м, 2H), 4,78 (т, J=5,3 Гц, 1H), 6,64 (д, J=9,3 Гц, 2H), 7,20-7,35 (м, 1H), 7,96 (д, J=9,3 Гц, 2H). МС: 183,0 [C8H10N2O3+H]⁺.

Пример 9. Синтез 3-(4-нитрофениламино)пропан-1-ола

4-Нитроанилин 1 (5,00 г, 1,0 экв.) смешивают с 3-бромпропанолом (2,61 мл, 0,7 экв.) в запаянной пробирке. Реакционную смесь перемешивают при 90°C в течение 18 часов. После разбавления этилацетатом (50 мл) и раствором (1 N) гидроксида натрия (50 мл) смесь экстрагируют этилацетатом (3×100 мл), экстракты промывают водой (50 мл), сушат над сульфатом натрия, и растворители выпаривают в вакууме. Остаток абсорбируют на силикагеле и очищают флэш-хроматографией (циклогексан/этилацетат от 100/0 до 100/0 и затем циклогексан/этилацетат от 100/0 до 30/70), и получают соединение 2 в виде желтого порошка; выход 3,29 г (16,76 ммоль, 58%).

1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6): δ 1,69 (квинт, J=6,3 Гц, 2H), 3,12-3,24 (м, 2H), 3,41-3,53 (м, 2H), 4,51 (т, J=5,1 Гц, 1H), 6,61 (д, J=9,3 Гц, 2H), 7,24 (т, J=5,2 Гц, 1H), 7,96 (д, J=9,3 Гц, 2H). МС: 197,0 [C9H12N2O3+H]⁺.

Пример 10. Синтез 4-нитро-Н-(пиридин-2-илметил)анилина

4-Нитро-N-(пиридин-2-илметил)анилин закупают у AURORA FINE CHEMICALS. CAS [408365-67-3]. Каталожный # A00.198.769. Партия # 1108894.

Пример 11. Синтез 3-((4-нитрофениламино)метил)бензойной кислоты

К раствору 3-карбоксибензальдегида 1 (2,17 г, 1,0 экв.) в 100 мл этанола (сухого) добавляют 4-нитроанилин (2,00 г, 1,0 экв.) и ледяную уксусную кислоту (1,66 мл, 2,0 экв.). Реакционную смесь греют при 50°C в течение 18 часов. После охлаждения до комнатной температуры добавляют по частям цианоборогидрид натрия (1,46 г, 1,6 экв.), и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. После выпаривания растворителя в вакууме остаток растирают в воде (100 мл), отфильтровывают и промывают смесью дихлорметан/метанол (95/5, 10 мл), и получают соединение 2 в виде желтого твердого вещества; выход 2,18 г (8,0 ммоль, 55%).

1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6): δ 4,48 (д, J=6,1 Гц, 2H), 6,66 (д, J=9,3 Гц, 2H), 7,46 (т, J=7,7 Гц, 1H), 7,58 (д, J=7,7 Гц, 1H), 7,77-8,00 (м, 5H), 12,95 (с, 1H). МС: 273,1 [C14H12N2O4+H]⁺.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и кормопроизводству, а именно к способу уменьшения образования выделения метана при пищеварительной деятельности у жвачного животного и/или улучшения продуктивности жвачного животного путем использования активного соединения, принадлежащего к классу пара-нитроаминопроизводных, или его соли, которые вводят животному вместе с кормом. Изобретение также относится к применению таких соединений при кормлении жвачных животных в составе кормовых композиций и кормовых добавок, таких как премикс, концентраты и общий смешанный рацион, или в форме болюса. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 3 табл., 11 пр.

1. Применение, по меньшей мере, одного соединения, определенного формулой (I)

при этом R¹ и R² представляют собой, независимо один от другого, H, -CH₃ или -CH₂R³, и при этом R³ представляет собой насыщенную или ненасыщенную линейную, разветвленную или циклическую углеводородную группу C₁-C₈, необязательно замещенную 1-3 группами, выбранными из -ОН, -NH₂, -СООН, и при этом один или два атома углерода в углеводороде C₁-C₈ необязательно заменены атомом азота или атомом кислорода,

или его соли в качестве активного соединения при кормлении животных для уменьшения образования выделения метана при пищеварительной деятельности у жвачных животных и/или для улучшения продуктивности жвачных животных.

2. Применение по п. 1, при этом R¹ представляет собой Н или -СН₃.

3. Применение по п. 1, при этом R¹ представляет собой Н или -СН₃, R² представляет собой Н, -СН₃ или -CH₂R³, и R³ представляет собой насыщенную линейную или разветвленную углеводородную группу С₁-С₃.

4. Применение по п. 1, при этом соединение формулы (I) выбирают из группы соединений, включающей (4-нитрофенил)амин, метил(4-нитрофенил)амин, этил(4-нитрофенил)амин, диметил(4-нитрофенил)амин, (4-нитрофенил)пропиламин, изопропил(4-нитрофенил)амин, 2-(4-нитрофениламино)этанол, 3-(4-нитрофениламино)пропан-1-ол, 4-нитро-N-(пиридин-2-илметил)анилин, 4-((4-нитрофениламино)метил)бензойную кислоту и 3-((4-нитрофениламино)метил)бензойную кислоту.

5. Применение по п. 1, при этом, по меньшей мере, одно соединение формулы (I) или его соль объединяют с, по меньшей мере, одним дополнительным активным веществом, выбранным из группы, состоящей из диаллилдисульфида, чесночного масла, аллилизотиоцианата, дезоксихолевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты и их производных.

6. Применение по п. 1, при этом жвачное животное выбирают из группы, включающей крупный рогатый скот, коз, овец, американского бизона, зубра, яков и азиатского буйвола.

7. Применение по п. 1, при этом образование метана у жвачных животных, вычисленное в литрах на килограмм потребленной сухой массы, снижается, по меньшей мере, на 10% при измерении в обменных камерах.

8. Применение по п. 1, при этом количество, по меньшей мере, одного активного соединения, определенного формулой (I), вводимого жвачному животному, составляет от 1 мг до 10 г на кг корма.

9. Кормовая композиция или кормовая добавка, включающая, по меньшей мере, одно соединение формулы (I) по любому из пп. 1-4.

10. Композиция по п. 9, которая представляет собой минеральный премикс, витаминный премикс или премикс, включающий витамины и минеральные вещества, или болюс.

11. Способ уменьшения образования выделения метана при пищеварительной деятельности у жвачных животных и/или для улучшения продуктивности жвачных животных, включающий пероральное введение животному достаточного количества, по меньшей мере, одного соединения формулы (I)

при этом R¹ и R² представляют собой, независимо один от другого, Н, -СН₃ или -CH₂R³, и при этом R³ представляет собой насыщенную или ненасыщенную линейную, разветвленную или циклическую углеводородную группу C₁-C₈, необязательно замещенную 1-3 группами, выбранными из -ОН, -NH₂, -СООН, и при этом один или два атома углерода в углеводороде C₁-C₈ необязательно заменены атомом азота или атомом кислорода,

или его соли.

12. Способ по п. 11, при этом, по меньшей мере, одно соединение формулы (I) вводят животному в комбинации с, по меньшей мере, одним дополнительным активным веществом, выбранным из группы, состоящей из диаллилдисульфида, чесночного масла, аллилизотиоцианата, дезоксихолевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты и их производных.

13. Способ по п. 11, при этом жвачное животное выбирают из группы, включающей крупный рогатый скот, коз, овец, жирафов, американского бизона, зубра, яков, азиатского буйвола, оленя, верблюдов, альпак, лам, гну, антилопу, вилорога и нильгау.

14. Способ по п. 11, при этом количество, по меньшей мере, одного соединения формулы (I), вводимого жвачному животному, составляет от 1 мг до 10 г на кг корма.

15. Способ по п. 11, при этом образование метана у жвачных животных, вычисленное в литрах на килограмм потребленной сухой массы, снижается, по меньшей мере, на 10% при измерении в обменных камерах.