Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 631 611

(13)

(51)

МПК

A61K31/4412(2006-01-01)

A61K31/136(2006-01-01)

A61P35/00(2006-01-01)

(21) (22)

Заявка

2014127753, 2012-12-21

(24)

Дата начала отсчета патента

2012-12-21

(22)

дата подачи заявки

2012-12-21

(45)

опубликовано

2017-09-25

(72)

авторы

Радтке ФреддиЛехал РайвиндерРейнмюллер ВикторияЧжу Джипин

(73)

патентообладатели

Эколь Политекник Федераль Де Лозанна

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

HSIAO S-Het alElectroactive aromatic polyamides and polyimides with adamantylphenoxy-substituted triphenylamine unitsSARMENTO LM et alTherapeutic potential of Norch inhibition in T-cell acute lymphoblastic leukemia: rationale caveats and promisesExpert Rewv.Anticancer TherJP 2001089412 A, 03.04.2001

ИНГИБИТОРЫ ПУТИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА NOTCH И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАКА Российский патент 2017 года по МПК A61K31/4412 A61K31/136 A61P35/00

Описание патента на изобретение RU2631611C2

Область техники

Настоящее изобретение относится к применению ингибиторов пути передачи сигнала Notch, в частности, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) (номер CAS 218457-67-1) и его производных при лечении и/или предотвращении раковых опухолей.

Уровень техники

Путь передачи сигнала Notch является критически важным компонентом в молекулярных циклах, которые контролируют судьбу клеток во время развития, выживаемость клеток и пролиферацию клеток (Shih IeM, Wang TL в Cancer Res 2007; 67 (5): 1879-82). Аберрантная активация данного пути вносит вклад в онкогенез. Члены семейства Notch выявляют в качестве онкогенов в постоянно растущем числе раковых опухолей. Недавно была подчеркнута роль Notch в раковой опухоли человека присутствием активирующих мутаций и амплификации генов Notch в раковой опухоли человека, и путем демонстрации того, что гены в пути передачи сигнала Notch могли бы являться потенциальными мишенями для терапевтического воздействия. Стало очевидно, что одними из основных мишеней для терапевтического воздействия в пути Notch являются рецепторы Notch, при этом ингибиторы γ-секретазы предотвращают образование онкогенного (внутриклеточного) домена молекул Notch и подавляют активность Notch.

Хотя был достигнут значительный прогресс в анализе сложной работы данного пути передачи сигнала, доступны очень ограниченные варианты ингибиторов Notch. Однако новаторский класс ингибиторов Notch для нескольких видов рака уже проходит клинические исследования, например, ингибиторы γ-секретазы MK0752 от Merck Sharp & Dohme Corp. MK0752 и RO4929097 (Roche), синтетическая малая молекула, ингибируют путь передачи сигнала Notch, что может приводить к индукции остановки роста и апоптозу клеток опухоли, в которых путь передачи сигнала Notch чрезмерно активирован.

Одним из недостатков применения ингибиторов γ-секретазы для блокирования передачи сигнала Notch, в настоящее время присутствующих на рынке или находящихся на стадии исследования, является их широкий диапазон дополнительных мишеней, таких как белок-предшественник амилоида, а также неселективность блокирования передачи сигнала Notch через все четыре лиганда (Notch1, 2, 3 и 4). Вследствие их способности блокировать передачу сигнала Notch через все четыре рецептора известно, что ингибиторы γ-секретазы вызывают метаплазию бокаловидных клеток в кишечнике. Кроме того, некоторые из гематологических злокачественных опухолей и солидных опухолей содержат мутации рецепторов Notch (такие как хромосомные транслокации), приводящие к конститутивной экспрессии доминантной активной формы внутриклеточного домена Notch1 (NICD), независящей от расщепления комплексом γ-секретазы. Поэтому данные опухоли не отвечают на лечение ингибиторами γ-секретазы.

Соответственно, по-прежнему существует необходимость в идентификации и разработке дополнительных специфичных и селективных ингибиторов пути передачи сигнала Notch, подходящих для лечения и/или предотвращения рака.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амину (I3) формулы I

или одному из его производных, обладающему ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, его солям, сольватам, таутомерам, изомерам для применения в лечении и/или предотвращении рака.

Другой задачей настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, включая фармацевтическую композицию, содержащую 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) формулы I или одно из его производных, обладающее ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, или его фармацевтически приемлемые соли, сольваты, таутомеры, изомеры и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также предусматривает набор, содержащий одну или более доз 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) или одного из его производных, обладающего ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, для применения в способе лечения и/или предотвращения рака, возможно с реагентами и/или инструкциями по применению.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение применения 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) формулы I или одного из его производных, обладающего ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, для ингибирования пути передачи сигнала Notch в клетках in vitro или in vitro.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения субъекта от зависимого от Notch рака.

Описание фигур

На фиг. 1 показано, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) (номер CAS 218457-67-1) блокирует опосредуемую NICD активацию передачи сигнала Notch. А) Клетки N1-HeLa котрансфицировали экспрессионной плазмидой pcDNA3.Notch1, плазмидами pGL426-12×CSL-люцифераза и Renilla SV40. Клетки DL4- и N1-HeLa совместно культивировали в 96-луночном планшете в соотношении 1:1 (20000:20000 клеток/лунка) и обрабатывали ДМСО или 2, 5 и 10 мкМ соединения I3 и DAPT в течение 24 часов. Активацию пути Notch измеряли путем количественного анализа репортерного гена люциферазы, регулируемого передачей сигнала Notch. Обработка анализируемого образца совместной культуры DL4:N1 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) и DAPT вызывала зависимое от концентрации уменьшение активации передачи сигнала Notch. В) Клетки HeLa трансфицировали NICD и обрабатывали ДМСО или 2, 5, 10, 20 и 40 мкМ 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3). В качестве контроля совместно культивированные клетки также обрабатывали 5, 10, 20 и 40 мкМ DAPT. Активацию пути измеряли с использованием анализа репортерного гена люциферазы, регулируемого Notch. Обработка клеток, экспрессирующих NICD, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) приводила к ослаблению передачи сигнала, тогда как обработка DAPT не оказывала влияния на активацию передачи сигнала Notch, опосредуемую NICD. С) Анализируемый образец совместной культуры DL4:N1 и DL4:N2 обрабатывали соединением I3 и DAPT (10 мкМ каждого) в течение 24 часов. Влияние 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) и DAPT на активацию пути, регулируемую DL4-N1 и DL4-N2, измеряли по активности люциферазы, регулируемой Notch. Обработка как соединением I3, так и DAPT блокировала активацию пути, индуцируемую Notch1 и Notch2. D) 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) ингибирует активацию пути через внутриклеточные домены Notch1 (NICD) и Notch2 (N2-ICD).

На фиг. 2 показано, что опосредованное 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) ингибирование передачи сигнала Notch может быть отменено увеличивающейся концентрацией MAML1. Клетки HeLa котрансфицировали векторами экспрессии 800 нг NICD +3 мкг pCDNA3.1 или 800 нг NICD +1 мкг MAML1-FLAG, или 800 нг NICD +3 мкг MAML1-FLAG. Для измерения активации пути Notch в клетки также вводили плазмиду pCL4.26-12×CSL-люцифераза. Renilla SV40 использовали в качестве внутреннего контроля. Клетки, трансфицированные различными комбинациями и количествами плазмиды, обрабатывали ДМСО или увеличивающейся концентрацией 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) (1, 2,5, 5 и 10 мкМ) в течение 24 часов. Активность люциферазы, регулируемой 12×CSL, измеряли с использованием набора Dual Luciferase Assay System. В отсутствии MAML1, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) мог блокировать активацию передачи сигнала Notch, но ингибирующее действие 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) в отношении Notch ослаблялось с увеличением количества MAML1.

На фиг. 3 показано, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) ингибирует передачу сигнала Notch и понижающе регулирует целевые гены в линиях раковых клеток человека. А) Клетки RPMI 8402 обрабатывали ДМСО, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) и DAPT (10 мкМ) в течение 24 часов, и анализировали на предмет экспрессии целевых генов Notch, Hes1, cMyc и Dtx1, путем количественной ОТ-ПЦР. Данные приводили к HPRT в качестве гена «домашнего хозяйства». В) Цельноклеточный лизат клеток, обработанных 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), анализировали путем вестерн-блоттинга. С использованием антител к NICD (Val1744), Hes1 и сМус, определяли белковые уровни NICD и целевых генов Notch. С и D) Линии клеток Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (T-ALL) человека НРВ ALL и KOPTK1 обрабатывали ДМСО или 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) в течение 24 часов. Анализы методом вестерн-блоттинга выполняли с использованием антител, специфичных к NICD (Val1744) и Hes1. Тубулин служил в качестве контроля загрузки. Е) Цельноклеточный лизат клеток PANC1 (линия клеток рака поджелудочной железы), обработанных ДМСО, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), анализировали путем вестерн-блоттинга. Белковые уровни Hes1 определяли с использованием антител, специфичных к Hes1. Статистические анализы выполняли с использованием двустороннего t-критерия Стьюдента. *=значение p<0,05.

На фиг. 4 показано, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) индуцирует блокирование пролиферации раковых клеток человека. Линии клеток T-ALL человека RPMI 8402 и KOPTK1, и линию клеток рака поджелудочной железы PANC1, а также клетки меланомы, регулируемые nRas, высевали в 96-луночный планшет и обрабатывали 10 мкМ концентрацией 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) и DAPT в течение нескольких дней. Их ингибирующее действие в отношении роста сравнивали с клетками, обработанными равным количеством ДМСО. С использованием анализа с аламаровым синим следили за кинетикой роста RPMI 8402 и KOPTK1 в течение до 6 дней, тогда как за клетками PANC1 и меланомы nRas наблюдали в течение 4 дней. Обработка клеток RPMI 8402, KOPTK1, PANC1 и меланомы nRas 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) вызывала значительное снижение потенциала роста. Статистические анализы выполняли с использованием t-критерия Стьюдента. *=значение p<0,05. ns=незначимый.

На фиг. 5 показано, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) блокирует зависимый от NICD рост раковых клеток человека. А) Родительские клетки DND41 и клетки DND41-NICD обрабатывали 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) и DAPT в течение 24 часов. Анализы методом вестерн-блоттинга проводили на предмет белка Hes1 с использованием антител, специфичных к Hes1. Как DAPT, так и 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) вызывали понижающую регуляцию Hes1 в родительских клетках DND41. Клетки DND41-NICD демонстрировали понижающую регуляцию Hes1 только при обработке 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3). В) Пять тысяч родительских клеток DND41 высевали и обрабатывали ДМСО, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) и DAPT в 96-луночном планшете. За кинетикой роста родительской линии клеток наблюдали в течение 5 дней с использованием индикатора аламарового синего. Обработка родительской линии клеток DND41 как 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), так и DAPT вызывала остановку пролиферации. С) Подобным образом, за клетками DND41-NICD, обработанными ДМСО, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) и DAPT, и кинетикой их роста наблюдали с использованием индикатора аламарового синего в течение 5 дней. Обработка клеток DND41-NICD DAPT не оказывала значительного влияния на их пролиферацию, тогда как обработка 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) индуцировала остановку пролиферации. D) Линия клеток рака молочной железы человека НСС1187 содержит хромосомную транслокацию SEC22B-Notch2, что таким образом приводит к экспрессии конститутивно активной формы NICD, независящей от расщепления комплексом γ-секретазы. Эта мутация делает данную линию клеток нечувствительной к обработке ингибитором γ-секретазы. Е) Две тысячи клеток НСС1187 на лунку высевали в 96-луночный планшет. Клетки обрабатывали ДМСО, ингибитором γ-секретазы DAPT и соединением I3 в течение 6 дней. Анализ с индикатором аламаровым синим проводили в 0 день, 2 день, 4 день и 6 день. Для каждой обработки и каждого момента времени использовали восемь повторов. Обработка линии клеток рака молочной железы человека НСС1187 ингибитором γ-секретазы DAPT не меняла кинетику роста по сравнению с аналогами, обработанными ДМСО, тогда как обработка соединением I3 вызывала статистически значимое ингибирование пролиферации клеток. Значения p рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента. *=значение p<0,05. ns=незначимый.

На фиг. 6 показано, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) индуцирует остановку клеточного цикла G0/G1 и апоптоз в линиях клеток Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза человека и линии клеток рака молочной железы человека НСС1187. А) Линии лейкозных клеток человека (RPMI8402, CUTL1, KOPTK1, TALL1 и HPBALL) обрабатывали соединением I3 (10 мкМ). Процент Аннексии V-положительной (апоптотической) клеточной популяции измеряли с использованием проточной цитометрии. В) Анализы клеточного цикла: линии клеток RPMI8402, KOPTK1 и TALL1 обрабатывали соединением I3 (10 мкМ) и окрашивали Ki67 и красителем Хехст (Hoechst) для определения состояния клеточного цикла. Анализы клеточного цикла позволяли предположить, что обработка соединением I3 вызывала 20-30% увеличение клеток с остановкой фазы G0/G1 клеточного цикла. С) Клетки НСС1187 обрабатывали ДМСО или 10 мкМ соединения I3 и процент апоптотической популяции измеряли с использованием красителя Аннексина V. D) Клетки НСС1187, обработанные соединением I3, анализировали на предмет состояния клеточного цикла. Ki67 и краситель Хехст показали, что соединение I3 индуцировало остановку G0/G1 в клетках НСС1187.

На фиг. 7 показано, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) имитирует генетическую утрату фенотипа передачи сигнала Notch2 в селезенке. Утрата передачи сигнала Notch2 в селезенке приводит к уменьшению В-клеток маргинальной зоны (MZB) в селезенке. А) Схемы экспериментального плана. В) Мышей (n=2) лечили маслом или 25 мг/кг 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) в течение 7 последовательных дней. Селезенки анализировали в 8 день. С использованием антител, специфичных к В220, идентифицировали В-клетки в селезенке. Клетки MZB в компартменте В-клеток детектировали с использованием антител к маркерам клеточной поверхности CD23 и CD21. Лечение мышей 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) вызывало значительное уменьшение процента клеток MZB в селезенке. В) Лечение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) вызывало уменьшение абсолютного числа клеток MZB в селезенке по сравнению с животными, которых лечили носителем.

На фиг. 8 показано, что лечение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) увеличивает задержку развития лейкоза у мышей. А) Мышам NOD/SCIDγc^-/- вводили 1×10⁶ клеток НРВ ALL (экспрессирующих люциферазу) путем инъекции. В 15 день лейкозные клетки были сформированы в костном мозге. Мышей лечили маслом или 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) каждый день. Мышей подвергали визуализации в 27 день с использованием системы прямой визуализации Caliper IVIS (Xenogen). Красный и синий цвет показывает интенсивность сигнала люциферазы и коррелирует с количеством лейкозных клеток. В) Лечение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) блокировало рост лейкозных клеток RPMI 8402 в анализе с ксенотрансплантацией. Мышам NOD/SCIDγc^-/- трансплантировали с 5×10⁵ клеток RPMI 8402 (экспрессирующих люциферазу). За развитием лейкоза следили с использованием системы прямой визуализации Caliper IVIS (Xenogen). В 13 день начинали ежедневное лечение с использованием масла (n=3) или 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) (n=4). Животных лечили в течение 27 дней (конечная точка эксперимента).

На фиг. 9 показано, что лечение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) блокирует опухоли молочных желез у мышей MMTV-ErbB2. А) Уровни экспрессии белка Hes1 в опухолях молочных желез MMTV-ErbB2 и нормальных молочных железах (М.Ж.) мышей в соответствующей возрастной группе сравнивали с использованием антитела анти-Hes1. Анализы методом вестерн-блоттинга демонстрировали очень высокий уровень экспрессии белка Hes1 в опухолях молочных желез MMTV-ErbB2. Тубулин служил в качестве контроля загрузки. В) Получали суспензию отдельных клеток опухоли молочных желез MMTV-ErbB2 и 1×10⁶ клеток вводили путем инъекции в свободную от эпителия жировую подушку реципиентных мышей FVB. Образование опухоли регулярно контролировали. После развития опухоли до объема 100-300 мм³, мышей лечили маслом (n=2) или 25 мг/кг 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) (n=2). Объем опухоли измеряли каждые 6-7 дней. Мыши, которых лечили 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), демонстрировали медленное прогрессирование опухоли по сравнению с мышами, которых лечили маслом.

На фиг. 10 показана ингибирующая активность химических производных 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) в отношении Notch. Различные химические производные 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) тестировали в анализе в совместной культуре DL4-N1 и уровни активности Notch измеряли с использованием репортерного гена люциферазы, регулируемого Notch. Производные I3-A, I3-B, I3-C, I3-E, I3-G, I3-H, I3-М и I3-N демонстрировали активность анти-Notch, сопоставимую с 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), тогда как производные I3-F и I3-I, по-видимому, обладали повышенной активностью.

Подробное описание изобретения

Несмотря на то, что способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы при практическом применении или тестировании настоящего изобретения, ниже описаны подходящие способы и вещества. Полное содержание всех публикаций, заявок на патент, патентов и других источников, упомянутых в настоящем описании, включено в настоящее описание посредством ссылки. Публикации и заявки, рассмотренные в настоящем документе, приведены исключительно для их описания до даты подачи настоящей заявки. Никакая часть данного документа не может быть рассмотрена как признание того, что настоящее изобретение не подлежит отнесению к более ранней дате указанной публикации на основании предшествующего изобретения. Кроме того, вещества, способы и примеры приведены только в качестве иллюстрации и не являются ограничивающими.

В случае противоречия настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, обычно понятное специалисту в данной области техники, к которой относится объект изобретения, описанный в настоящем документе. В настоящем описании следующие определения приведены для облегчения понимания настоящего изобретения.

В настоящем описании термин «содержать/содержащий», в целом, употребляется в смысле «включать/включающий», то есть допускающий присутствие одного или более признаков или компонентов. Термины «содержать» и «содержащий» также включают более ограниченные термины «состоять» и «состоящий».

В настоящем описании и формуле изобретения формы единственного числа включают множества объектов, если в контексте явным образом не указано иное.

Для удобства чтения термин «соединение (соединения) согласно настоящему изобретению» или «соединение (соединения) в соответствии с настоящим изобретением», употребляемый на протяжении всего описания, относится к соединению 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амину (I3) (номер CAS 218457-67-1), производным указанного соединения I3, солям или сольватам соединения I3 или производных, и к изомерам, включая энантиомеры, стереоизомеры, ротамеры, таутомеры и рацематы, соединения I3, химически модифицированным соединениям I3 и производным указанных соединений I3.

В настоящем описании термин «субъект» является хорошо известным в данной области техники и относится к млекопитающему, включая собаку, кошку, крысу, мышь, обезьяну, корову, лошадь, козу, овцу, свинью, верблюда и наиболее предпочтительно человека. В некоторых вариантах реализации субъектом является нуждающийся в лечении субъект или субъект с заболеванием или нарушением, таким как рак. Однако в других вариантах реализации субъектом может являться здоровый субъект или субъект, который уже прошел лечение от рака. Данный термин не указывает на конкретный возраст или пол. Таким образом, включены субъекты, представляющие собой взрослых, детей и новорожденных как мужского, так и женского пола.

В настоящем описании термины «рак», «раковые клетки», «клеточно-пролиферативные заболевания» и «клеточно-пролиферативные нарушения» относятся к физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом клеток или описывают его. В соответствии с настоящим изобретением термин «рак» относится предпочтительно к солидным опухолям, таким как опухоли головного мозга, молочной железы, предстательной железы, толстой и прямой кишки, почек, легких, саркоме или меланоме, и жидким опухолям, поражающим кровь, таким как лейкоз. Более предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением раковые опухоли представляют собой зависимые от Notch раковые опухоли, выбранные из группы, включающей Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз (T-ALL), хронический миелоидный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), лимфому из клеток мантийной зоны, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, меланому, опухоли головного мозга, ангиогенез опухоли, рак толстой и прямой кишки. В качестве альтернативы, зависимый от Notch рак резистентен к лечению ингибиторами γ-секретазы. Примеры лечения ингибиторами γ-секретазы включают 1) ингибитор гамма-секретазы RO4929097 и Цедираниба малеат в лечении пациентов с распространенными солидными опухолями (NCT01131234), 2) ингибитор гамма-секретазы RO4929097 в лечении молодых пациентов с рецидивирующими или рефрактерными солидными опухолями, опухолями ЦНС, лимфомой или Т-клеточным лейкозом (NCT01088763), 3) Исследование MK-0752 в комбинации с Тамоксифеном или Летрозолом для лечения рака молочной железы на ранней стадии (NCT00756717), 4) GDC-0449 и RO4929097 в лечении пациентов с распространенными раковыми опухолями или метастатической саркомой (NCT01154452), 5) RO4929097 и Эрлотиниба гидрохлорид в лечении пациентов с немелкоклеточным раком легкого, рецидивирующим или на IV стадии (NCT01193881), 6) Бикалутамид и RO4929097 в лечении пациентов с раком предстательной железы, который уже лечили (NCT01200810), 7) RO4929097 в лечении пациентов с рецидивирующими инвазивными глиомами (NCT01269411), 8) ингибитор пути передачи сигнала Notch для пациентов с Т-клеточным острым лимфобластным лейкозом/лимфомой (ALL) (NCT00100152) и 9) RO4929097 в лечении пациентов с метастатическим раком толстой и прямой кишки (NCT01116687).

Путь передачи сигнала Notch является эволюционно консервативным, и основными молекулярными «участниками» данного пути являются лиганды (Delta и Jagged), рецепторы Notch и факторы транскрипции (Shih IeM, Wang TL в Cancer Res 2007; 67 (5): 1879-82). Notch представляет собой трансмембранный гетеродимерный рецептор, и существует четыре различных элемента (Notch1, Notch2, Notch3 и Notch4) у людей и грызунов. В физиологическом состоянии связывание лиганда Notch с его рецептором инициирует передачу сигнала Notch путем высвобождения внутриклеточного домена рецептора Notch (Notch-ICD) через каскад протеолитического расщепления под действием как α-секретазы (также называемой «фактор некроза опухоли-альфа-превращающий фермент»), так и γ-секретазы. Затем высвобожденный внутриклеточный Notch-ICD транслоцируется в ядро, где модулирует экспрессию генов главным образом путем связывания с убиквитарным фактором транскрипции, CBF1, супрессором Hairless, Lag-1 (CSL). Данное связывание привлекает активаторов транскрипции в комплекс CSL и превращает его из репрессора транскрипции в активатор, который «включает» несколько нижележащих эффекторов. Физиологические функции передачи сигнала Notch многогранны и включают поддержание стволовых клеток, определение судьбы клеток и регуляцию дифференцировки в развитии, а также в онкогенезе.

В раковых опухолях молекулярно-генетические изменения, такие как хромосомная транслокация, точечные мутации и хромосомная амплификация в локусах рецепторов Notch, представляют собой известные механизмы конститутивной активации пути Notch. Несмотря на различные механизмы, они все приводят к повышенным уровням внутриклеточного Notch-IC. Онкогенный потенциал Notch был впервые обнаружен при Т-клеточном остром лимфобластном лейкозе (T-ALL) человека. Тогда как передача сигнала Notch1 необходима для нормального развития предшественников Т-клеток, конститутивная активация передачи сигнала Notch1 вследствие молекулярно-генетических изменений связана с T-ALL. Например, интерстициальные делеции внеклеточной части Notch1 человека вследствие (7; 9) хромосомной транслокации связаны с ~1% случаев T-ALL, и активирующие точечные мутации Notch1 присутствуют в примерно 50% случаев T-ALL. Возникновение Т-клеточного лейкоза/лимфомы наблюдали в модели у трансгенных мышей Notch-ICD, что указывает на причинную роль активации Notch в развитии T-ALL. При немелкоклеточном раке легкого хромосомная транслокация (15; 19) была идентифицирована в подгруппе опухолей и считается, что указанная транслокация увеличивает транскрипцию Notch3 в опухолях. При раке яичников было обнаружено, что амплификация гена Notch3 происходила примерно в 19% опухолей, а сверхэкспрессию Notch3 обнаруживали в более половины серозных карцином яичников. Подобным образом, была продемонстрирована активация передачи сигнала Notch в развитии рака молочной железы. В моделях у животных конститутивно активная экспрессия Notch4 вызывает опухоли молочных желез у мышей, и мутации, активирующие Notch1, вносят вклад в развитие T-ALL. Недавнее исследование также показывает, что сверхэкспрессия активированного Notch1 и Notch3 у трансгенных мышей блокирует развитие молочных желез и индуцирует опухоли молочных желез у мышей. Активация передачи сигнала Notch также вовлечена в метастазирование клеток рака молочной железы в легкие и кости. Сверхэкспрессии Notch3 достаточно для индуцирования образования опухоли хориоидного сплетения в модели у мышей, что позволяет предположить роль Notch3 в развитии некоторых видов опухолей головного мозга.

С целью проведения высокопроизводительного скрининга (HTS) для идентификации новых модуляторов (ингибиторов) передачи сигнала Notch, заявители разработали анализ в совместной культуре для индуцирования активации данного пути, опосредуемой лигандом-рецептором. Анализ в совместной культуре разрабатывали с использованием, в частности, лиганда Notch DL4 и рецептора Notch1, поскольку активация пути, опосредуемая лигандом-рецептором DL4-N1, играет важную роль в патофизиологических состояниях, таких как ангиогенез опухоли, и роль рецептора Notch1 в индуцировании Т-клеточного лейкоза. Поскольку данный анализ зависит от экспрессии и взаимодействия между лигандом DL4 и рецептором Notch1, он дает возможность исследовать передачу сигнала Notch, индуцируемую взаимодействиями лиганд-рецептор, контролируемым образом. Миниатюризация данного анализа до формата 96-луночного планшета и 384-луночного планшета помогла заявителям адаптировать этот анализ для проведения HTS. Использование данного анализа в совместной культуре для скрининга библиотек малых интерферирующих РНК (siPHK) или малых молекул может привести к идентификации белков или химических соединений, которые способны модулировать передачу сигнала Notch на различных этапах по всему пути. Например, HTS с использованием библиотек siPHK или малых молекул может позволить получить модуляторы пути, способные действовать в клетках, посылающих сигнал или принимающих сигнал. Опосредуемые малой молекулой или белком изменения рециклинга или миграции лигандов и рецепторов к плазматической мембране теоретически могут блокировать путь Notch и могут быть изучены с использованием данного анализа. Кроме того, данный анализ также может помочь идентифицировать белки или химические соединения, способные блокировать взаимодействия лиганд-рецептор, опосредуемое ADAM 10/17 расщепление S2 или катализируемое γ-секретазой расщепление S3 рецептора Notch, ядерную транслокацию активной формы Notch или соединений, способных блокировать комплекс активации транскрипции.

Заявители также смогли провести скрининг трех различных библиотек химических соединений (Microsource NIMDS, Prestwick и Maybridge Hit finder), который привел к идентификации нескольких химических соединений, способных блокировать передачу сигнала Notch на разных уровнях по всему пути.

Использование независимой от Notch системы renilla в качестве внутреннего контроля позволило заявителям исключить цитотоксические химические соединения, тем самым ограничивая число ложных находок. Кроме того, данный анализ на основе клеток также помог обойти проблемы, связанные с клеточной проницаемостью химических соединений для дополнительного подтверждения находки.

Разработка системы анализа в совместной культуре DL4:N1 заложила основу для «кампании» HTS. Данный анализ обеспечил надежную и чувствительную систему считывания для идентификации новых модуляторов (ингибиторов) пути Notch.

Заявители идентифицировали несколько химических соединений по их способности блокировать активацию пути Notch. Среди них они идентифицировали соединение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) (номер CAS 218457-67-1) по его способности блокировать активацию пути Notch.

Таким образом, настоящее изобретение относится к 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амину (I3) формулы I

для применения в лечении и/или предотвращении рака.

Настоящее изобретение также включает химические модификации 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) (номер CAS: 218457-67-1) для продления циркулирующего времени жизни. Неограничивающие примеры способов временного, или обратимого, пегилирования лекарственных средств, включая лекарственные средства на основе полипептидов, приведены в патенте США №4935465 (выданном 19 июня 1990 года) и №6342244 (выданном 29 января 2002 года); и в опубликованных заявках США номер US 2006/0074024. Специалист в данной области техники, как правило, найдет более подробную информацию о реагентах на основе ПЭГ, например, в опубликованных заявках WO 2005047366, US 2005171328 и тех, которые перечислены в NEKTAR PEG Reagent Catalog® 2005-2006 (Nektar Therapeutics, Сан-Карлос, Калифорния).

Настоящее изобретение также включает химические производные указанного соединения I3, обладающие ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch. Заявители показали, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) и его производные прицельно воздействуют на передачу сигнала Notch в комплексе активации транскрипции в ядре; ожидается, что опухоли человека, резистентные к ингибиторам γ-секретазы из-за вышеупомянутых мутаций, будут отвечать на лечение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3). Кроме того, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3), по-видимому, селективно прицельно воздействует на передачу сигнала Notch, что таким образом ограничивает его нецелевые токсические эффекты.

Все данные производные имеют следующую общую структуру:

Предпочтительно, в указанных производных X представляет собой O, и положение 3 (или пара) представляет собой NH2.

Наиболее предпочтительно, производное, обладающее ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, выбрано из неограничивающей группы, включающей

где m представляет собой целое число, выбранное из 1-4;

W выбран из Η и галогенов; указанный галоген выбран из F-, Cl-, Br- или Ι-;

R1, R2, R3, R4 каждый независимо выбран из группы, состоящей из Н, фенила, 2-, 3- или 4-замещенного фенила, 2- или 3-нафтила, пирролила, фуранила, тиофуранила, пиримидинила, имидазолила, бензила, изопропила, трет-бутила, (CH₂)_nCH₃ алкенила, алкинила; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

X представляет собой O, S, CR5R6, NR7, NHCOR8 или NHSO2R9; где R5, R6, R7, R8, R9 каждый независимо выбран из группы, состоящей из Н, фенила, 2-, 3- или 4-замещенного фенила, 2- или 3-нафтила, пирролила, фуранила, тиофуранила, пиримидинила, имидазолила, бензила, изопропила, трет-бутила или (CH₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

Y представляет собой N или CH;

Z представляет собой Η, NO₂, OH, NR10R11, где R10 и R11 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H и (CH₂)_nCH₃, NHCOR12, где R12 выбран из группы, состоящей из (CH₂)_nCH₃, ароматических и гетероароматических радикалов, таких как фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, COOR13, где R13 выбран из группы, состоящей из H, (CH₂)_nCH₃, ароматических и гетероароматических радикалов, таких как фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, NHSO₂R14, где R14 выбран из группы, состоящей из фенила, 2-, 3- или 4-замещенного фенила, нафтила, гетероароматических радикалов, таких как пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, (CH₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

где m представляет собой целое число, выбранное из 1-4;

W выбран из H и галогенов; указанный галоген выбран из F-, Cl-, Br- или Ι-;

R4, R15 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, фенила, 2-, 3- или 4-замещенного фенила, 2- или 3-нафтила, пирролила, фуранила, тиофуранила, пиримидинила, имидазолила, бензила, изопропила, трет-бутила, (CH₂)_nCH₃ алкенила, алкинила; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

X представляет собой O, S, CR5R6, NR7, NHCOR8 или NHSO₂R9; R5, R6 и R7 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, фенила, 2-, 3- или 4-замещенного фенила, 2- или 3-нафтила, пирролила, фуранила, тиофуранила, пиримидинила, имидазолила, бензила, изопропила, трет-бутила, (CH₂)_nCH₃; R8 и R9 каждый независимо выбран из группы, состоящей из фенила, 2-, 3- или 4-замещенного фенила, 2- или 3-нафтила, или гетероароматических радикалов, выбранных из группы, включающей пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, (CH₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

Y представляет собой N или CH;

Z представляет собой H, NO₂, ОН, NR10R11, где R¹⁰ и R¹¹ каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, (CH₂)_nCH₃, NHCOR¹², где R12 представляет собой (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, COOR13, где R13 представляет собой H, (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, NHSO₂R14, где R14 представляет собой фенил, 2-, 3- или 4-замещенный фенил, нафтил, гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, (CH₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

где m представляет собой целое число, выбранное из 1-4;

W выбран из H и галогенов; указанный галоген выбран из F-, Cl-, Br- или I-;

R4 представляет собой H, фенил, 2-, 3- или 4-замещенный фенил, 2- или 3-нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, изопропил, трет-бутил, (CH₂)_nCH₃ алкенил, алкинил; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

Y представляет собой N или CH;

Z представляет собой H, NO₂, OH, NR10R11, где R¹⁰ и R¹¹ каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, (CH₂)_nCH₃, NHCOR¹², где R12 представляет собой (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, COOR13, где R13 представляет собой H, (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, NHSO₂R14, где R14 представляет собой фенил, 2-, 3- или 4-замещенный фенил, нафтил, гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, (CH₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

где m представляет собой целое число, выбранное из 1-4;

W выбран из H и галогенов; указанный галоген выбран из F-, Cl-, Br- или I-;

R1, R2, R3, R4 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, фенила, 2-, 3- или 4-замещенного фенила, 2- или 3-нафтила, пирролила, фуранила, тиофуранила, пиримидинила, имидазолила, бензила, изопропила, трет-бутила, (CH₂)_nCH₃ алкенила, алкинила; нижний индекс η представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

Z представляет собой H, NO₂, OH, NR10R11, где R10 и R11 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, (CH₂)_nCH₃, NHCOR12, где R12 представляет собой (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, COOR13, где R13 представляет собой H, (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, NHSO₂R14, где R14 представляет собой фенил, 2-, 3- или 4-замещенный фенил, нафтил, гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, (CH₂)nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

где m представляет собой целое число, выбранное из 1-4;

W выбран из H и галогенов; указанный галоген выбран из F-, Cl-, Br- или I-;

R4, R15 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, фенила, 2-, 3- или 4- замещенного фенила, 2- или 3-нафтила, пирролила, фуранила, тиофуранила, пиримидинила, имидазолила, бензила, изопропила, трет-бутила, (CH₂)_nCH₃ алкенила, алкинила; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 0-15;

Z представляет собой H, NO₂, OH, NR10R11, где R10 и R11 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, (CH₂)_nCH₃, NHCOR12, где R12 представляет собой (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, COOR13, где R13 представляет собой H, (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, NHSO₂R14, где R14 представляет собой фенил, 2-, 3- или 4-замещенный фенил, нафтил, гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, (CH₂)nCH₃; нижний индекс η представляет собой целое число, независимо выбранное из 0-15;

где m представляет собой целое число, выбранное из 1-3;

W выбран из H и галогенов; указанный галоген выбран из F-, Cl-, Br- или I-;

R4 представляет собой H, фенил, 2-, 3- или 4-замещенный фенил, 2- или 3-нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, изопропил, трет-бутил, (CH₂)_nCH₃ алкенил, алкинил; нижний индекс η представляет собой целое число, независимо выбранное из 0-15;

Z представляет собой H, NO₂, OH, NR10R11, где R10 и R11 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, (CH₂)_nCH₃, NHCOR12, где R12 представляет собой (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, COOR13, где R13 представляет собой H, (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, NHSO₂RH, где R14 представляет собой фенил, 2-, 3- или 4-замещенный фенил, нафтил, гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, (CH₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 0-15;

где гетероароматический радикал представляет собой аминопиррол, аминофуран, аминотиофуран или пиримидин;

R1, R2, R3, R4 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, фенила, 2-, 3-или 4-замещенного фенила, 2- или 3-нафтила, пирролила, фуранила, тиофуранила, пиримидинила, имидазолила, бензила, изопропила, трет-бутила, (CH₂)_nCH₃ алкенила, алкинила; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 0-15;

X представляет собой O, S, CR5R6, NR7, NHCOR8 или NHSO2R9; где R5, R6, R7, R8, R9 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, фенила, 2-, 3- или 4-замещенного фенила, 2- или 3-нафтила, пирролила, фуранила, тиофуранила, пиримидинила, имидазолила, бензила, изопропила, трет-бутила или (CH₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 0-15;

Z представляет собой H, NO₂, OH, NR10R11, где R10 и R11 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, (CH₂)_nCH₃, NHCOR12, где R12 представляет собой (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, COOR13, где R13 представляет собой H, (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, NHSO₂R14, где R14 представляет собой фенил, 2-, 3- или 4-замещенный фенил, нафтил, гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, (CH₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 0-15;

где нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

гетероароматический радикал представляет собой аминопиррол, аминофуран, аминотиофуран или пиримидин;

Z представляет собой H, NO₂, OH, NR10R11, где R10 и R11 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, (CH₂)_nCH₃, NHCOR12, где R12 представляет собой (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, COOR13, где R13 представляет собой H, (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, NHSO₂R14, где R14 представляет собой фенил, 2-, 3- или 4-замещенный фенил, нафтил, гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, (CH₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 0-15;

где гетероароматический радикал представляет собой аминопиррол, аминофуран, аминотиофуран или пиримидин;

R4 представляет собой Н, фенил, 2-, 3- или 4-замещенный фенил, 2- или 3-нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, изопропил, трет-бутил, (CH₂)_nCH₃ алкенил, алкинил; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 0-15;

Z представляет собой H, NO₂, OH, NR10R11, где R10 и R11 каждый независимо выбран из группы, состоящей из H, (CH₂)_nCH₃, NHCOR12, где R12 представляет собой (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, COOR13, где R13 представляет собой H, (CH₂)_nCH₃, ароматические и гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей фенил, нафтил, пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, NHSO₂R14, где R14 представляет собой фенил, 2-, 3- или 4-замещенный фенил, нафтил, гетероароматические радикалы, выбранные из группы, включающей пирролил, фуранил, тиофуранил, пиримидинил, имидазолил, бензил, (CH₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 0-15;

Более предпочтительно, производное, обладающее ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, выбрано из группы, состоящей из

4-(4-(трет-пентил)фенокси)анилина,

4-(4-циклогексилфенокси)анилина,

6-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)пиридин-3-амина,

6-(3-(трет-бутил)фенокси)пиридин-3-амина,

4-(4-(трет-бутил)фенокси)-3-фторанилина,

6-(4-(трет-пентил)фенокси)пиридин-3-амина,

6-(4-бутилфенокси)пиридин-3-амина,

4-(4-циклогексилфенокси)-3-фторанилина,

3-фтор-4-(4-(трет-пентил)фенокси)анилина,

6-(4-(2-метилпентан-2-ил)фенокси)пиридин-3-амина,

4-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)анилина,

4-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)-3-фторанилина,

6-(4-циклогексилфенокси)пиридин-3-амина,

4-(4-(трет-бутил)фенокси)анилина,

4-(4-изопропилфенокси)анилина и

6-(4-(2,4,4-триметилпентан-2-ил)фенокси)пиридин-3-амина.

Настоящее изобретение также относится к солям или сольватам соединения I3, химически модифицированных соединений I3 и производных указанных соединений I3 согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, данные соли и/или сольваты являются фармацевтически приемлемыми. В соответствии с настоящим изобретением фармацевтически приемлемые соли получают из кислых неорганических или органических соединений, или щелочных неорганических или органических соединений. В настоящем описании термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, которая сохраняет биологическую эффективность свободных кислот и оснований указанного соединения, и которая не является биологически или иным образом нежелательной.

Если не указано иное, также очевидно, что все изомеры, включая энантиомеры, стереоизомеры, ротам еры, таутомеры и рацематы соединения I3, химически модифицированных соединений I3 и производных указанных соединений I3 согласно настоящему изобретению являются частью настоящего изобретения. Настоящее изобретение включает стереоизомеры в оптически чистой форме и в смеси, включая рацемические смеси. Изомеры могут быть получены с использованием обычных способов либо путем проведения реакции оптически чистых или оптически обогащенных исходных веществ, либо путем разделения изомеров соединений согласно настоящему изобретению.

Термин «рацематы» относится к смеси энантиомеров.

Термины «стереоизомер» или «стереоизомеры» относятся к соединениям, которые отличаются хиральностью одного или более стереоцентров. Стереоизомеры включают энантиомеры и диастереомеры. Соединение I3, химически модифицированные соединения I3 и производные указанных соединений I3 согласно настоящему изобретению могут существовать в стереоизомерной форме, если они содержат один или более асимметричных центров или двойную связь с асимметричным замещением и, следовательно, могут быть получены в виде отдельных стереоизомеров или в виде смесей. Если не указано иное, настоящее описание включает отдельные стереоизомеры, а также смеси. Способы определения стереохимии и разделения стереоизомеров хорошо известны в данной области техники (см. обсуждение в 4 главе Advanced Organic Chemistry, 4th ed., J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992).

Термин «таутомер» относится к альтернативным формам соединения, отличающимся положением протона, таким как кето-енольные и имин-енаминные таутомеры или таутомерные формы гетероарильных групп, содержащих атом кольца, присоединенный как к группе -NH- кольца, так и группе =N- кольца, таких как пиразолы, имидазолы, бензимидазолы, триазолы и тетразолы.

Специалисту в данной области техники известно, что, если соединение I3, химически модифицированные соединения I3 и производные указанных соединений I3 согласно настоящему изобретению содержат заряженную группу, подходящий противоион будет получен из органической или неорганической кислоты. Такие противоионы включают галогенид (например, хлорид, бромид, фторид, иодид), сульфат, фосфат, ацетат, сукцинат, цитрат, лактат, малеат, фумарат, пальмитат, холат, глутамат, глутарат, тартрат, стеарат, салицилат, метансульфонат, бензолсульфонат, сорбат, пикрат, бензоат, циннамат и т.п. Если полярная группа представляет собой отрицательно заряженную группу, подходящий противоион будет выбран из натрия, аммония, бария, кальция, меди, железа, лития, калия и цинка, и т.п.

Удивительно то, что химическое соединение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) идентифицировали в качестве потенциального ингибитора Notch. Интересно, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3), как было обнаружено, блокирует опосредуемую NICD активацию пути (фиг. 1). Из-за своей способности ослаблять опосредуемую NICD активацию Notch, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) может блокировать пролиферацию линий лейкозных клеток, сверхэкспрессирующих NICD, которые резистентны к DAPT (ингибитор γ-секретазы, N-[N-(3,5-дифторфенацетил-L-аланил)]-(S)-фенилглицина трет-бутиловый эфир) (фиг. 5). Ингибиторный потенциал 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) также подтверждали понижающей регуляцией целевых генов Notch в линиях клеток T-ALL человека (фиг. 3) и матрице geneChip Affymetrix (данные не представлены). Тот факт, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) может индуцировать дифференцировку клеток С2С12 в многоядерные мышечные трубочки, экспрессирующие МНС, дополнительно подтвердил роль 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) анти-Notch (данные не представлены). Ингибирование пути Notch, вызванное 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), может быть отменено сверхэкспрессией MAML1 выше определенных уровней. Например, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) был способен блокировать передачу сигнала при 800 нг NICD и 1 мкг MAML1 временно вводили в клетки, однако, когда количество MAML1 увеличивали до 3 мкг, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) больше не мог блокировать активацию пути (фиг. 2). Эти данные позволяют предположить, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) может нарушать комплекс активации транскрипции Notch и тем самым ингибировать активацию передачи сигнала. Микроскопические исследования путем введения MAML на уровнях, при которых 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) все еще мог блокировать активацию пути, показали, что лечение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) не препятствует колокализации NICD, MAML1 и CSL/RBP-jk в субъядерных компартментах (данные не представлены). Не являясь связанными рамками какой-либо конкретной теории, один из возможных механизмов действия 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) может заключаться в нарушении привлечения коактиваторов транскрипции в центральный комплекс CSL/RBP-jk-NICD-MAML1. Следовательно, по-прежнему необходимо определить состояние дополнительных коактиваторов, вовлеченных в образование функционального комплекса активации транскрипции. В физиологических условиях после образования комплекса CSL/RBP-jk-NICD-MAML1, в указанный комплекс привлекается гистонацетилтрансфераза (HAT) CBP/p300, что приводит к его автоацетилированию и ацетилированию гистона 3 и 4.

6-(4-Трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3), а также его производные, также исследовали в условиях in vivo для определения их ингибирующего действия в отношении Notch, а также побочных токсических эффектов у мышей. Передача сигнала Notch необходима для поддержания нормального гомеостаза в кишечнике.

Генетическая абляция или фармакологическое ингибирование передачи сигнала Notch1 и Notch2 в кишечнике приводит к метаплазии бокаловидных клеток в кишечнике. Поскольку наблюдали, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) блокирует передачу сигнала, опосредуемую Notch1 и Notch2, ожидали, что у мышей, которых лечили 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), будет развиваться метаплазия бокаловидных клеток. Удивительно то, что лечение мышей 25 мг/кг 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) в течение 7 дней (больше месяца в случае ксенотрансплантатов) не нарушало гомеостаз в кишечнике и не было никакого признака накопления бокаловидных клеток (данные не представлены). Это неожиданный результат мог быть обусловлен двумя причинами. Одно из возможных объяснений могло заключаться в том, что используемой концентрации 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) (25 мг/кг) не достаточно для блокирования активации пути Notch в кишечнике. Однако вторым более правдоподобным объяснением могли служить различия в составе комплексов активации транскрипции, расположенных ниже передачи сигнала Notch1 и Notch2. Из-за данных возможных различий передача сигнала, опосредуемая Notch1 и Notch2, может иметь различную чувствительность к лечению 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3).

Передача сигнала Notch играет важную роль в регуляции кроветворной системы. Например, передача сигнала DL4-Notch1 необходима для развития Т-клеток в тимусе. Активация пути, опосредуемая Notch2 и MAML, имеет критическое значение для развития клеток маргинальной зоны В (MZB) в селезенке. Для исследования того, может ли 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) нарушать зависимое от Notch развитие клеток MZB в селезенке, мышей С57В16 лечили 25 мг/кг 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) в течение 7 дней и анализировали в 8 день. Анализы методом проточной цитометрии с использованием антител к В220, CD21 и CD23, выявили, что лечение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) вызывает уменьшение процента и абсолютного числа клеток MZB в селезенке (фиг. 7).

Противораковую активность 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) исследовали в ксенотрансплантатных моделях заболеваний человека, а именно Т-клеточного лейкоза и рака молочной железы. В данных исследованиях 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) продемонстрировал замечательную способность замедлять прогрессирование и метастазирование очень агрессивной формы линий лейкозных клеток (фиг. 8). Кроме того, в предварительном исследовании с использованием рака молочной железы в качестве модели солидных опухолей, лечение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) привело к блокированию прогрессирования опухолей у мышей (фиг. 9).

Химическое соединение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) продемонстрировало способность блокировать опосредуемую NICD передачу сигнала. Следовательно, данное соединение полезно при раковых опухолях, когда регулируемые Notch опухоли резистентны к лечению ингибиторами γ-секретазы.

Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) формулы I или одно из его производных, обладающее ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, описанными в настоящем документе, или его фармацевтически приемлемые соли, сольваты, таутомеры, изомеры и фармацевтически приемлемый носитель. Что касается соответствующих носителей, можно привести ссылку на стандартную литературу, описывающую данные носители, например, на 25.2 главу 5 тома ʺComprehensive Medicinal Chemistryʺ, Pergamon Press 1990 и на ʺLexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebieteʺ, H.P. Fiedler, Editio Cantor, 2002. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает носитель или вспомогательное вещество, которое подходит для получения фармацевтической композиции, которая является в целом безопасной и обладает приемлемой токсичностью. Приемлемые носители включают носители, которые приемлемы для применения в ветеринарии, а также фармацевтического применения человеком. В настоящем описании и формуле изобретения термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает как один, так и более одного такого носителя. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению возможно также содержит один или более дополнительных активных агентов, выбранных из неограничивающей группы, включающей химиотерапевтические агенты для лечения рака. Такие химиотерапевтические агенты могут быть выбраны из группы, включающей, например, Алтретамин, Блеомицин, Бусульфан, Капецитабин, Карбоплатин, Кармустин, Хлорамбуцил, Цисплатин, Кладрибин, Крисантаспазу (Crisantaspase), Циклофосфамид, Цитарабин, Дакарбазин, Даунорубицин, Доксорубицин, Эпирубицин, Этопозид, Флударабин, Фторурацил, Гемцитабин, Идарубицин, Ифосфамид, Иринотекан, Ломустин, Мелфалан, Меркаптопурин, Метотрексат, Митомицин, Митоксантрон, Оксалиплатин, Пентостатин, Прокарбазин, Стрептозоцин, Тако (Taco), Темозоломид, Тиогуанин, Тиотепу, Топотекан, Треосульфан, Винбластин, Винкристин, Виндезин и Винорелбин.

Соединения согласно настоящему изобретению, а именно 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) и его производные, применяемые в лечении и/или предотвращении раковых опухолей, могут быть включены в различные составы и лекарственные средства для терапевтического введения. В частности, одно или более соединений, предложенных согласно настоящему изобретению, могут быть включены в состав фармацевтических композиций путем комбинирования с соответствующими фармацевтически приемлемыми носителями, и могут быть включены в состав препаратов в твердой, полутвердой, жидкой или газообразной формах, таких как таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы, драже, гели, суспензии, мази, растворы, суппозитории, препараты для инъекций, препараты для ингаляции и аэрозоли. Таким образом, введение соединений можно осуществлять различными способами, включая пероральное, трансбуккальное, ректальное, парентеральное, интраперитонеальное, внутрикожное, трансдермальное, внутричерепное и внутритрахеальное введение. Более того, соединение можно вводить местно, а не системно, в депо-составе или составе с замедленным высвобождением. Соединения могут быть включены в состав совместно с обычными вспомогательными веществами, разбавителями или носителями, и спрессованы в таблетки, или представлены в виде эликсиров или растворов для удобного перорального введения, или введены внутримышечным или внутривенным путем. Соединения могут быть введены трансдермально и могут быть представлены в виде лекарственных форм с замедленным высвобождением и т.п. Соединения могут быть введены отдельно, в комбинации друг с другом или их можно применять в комбинации с другими известными соединениями. Подходящие составы для применения согласно настоящему изобретению можно найти в Remingtonʹs Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company (1985) Philadelphia, PA, 17th ed.), содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки. Более того, для краткого обзора способов доставки лекарственных средств см. Langer, Science (1990) 249: 1527-1533, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки.

Количество соединения, предложенного согласно настоящему изобретению, которое может быть комбинировано с веществом-носителем для получения единой лекарственной формы, будет варьироваться в зависимости от вылечиваемого заболевания, нуждающегося в этом субъекта и конкретного способа введения. Однако в качестве общего руководства подходящие однократные дозы соединений согласно настоящему изобретению могут предпочтительно содержать, например, от 0,1 мг до примерно 1000 мг, от 1 мг до примерно 500 мг и от 1 мг до примерно 300 мг активного соединения. В другом примере однократная доза составляет от 1 мг до примерно 100 мг. Такие однократные дозы можно вводить более одного раза в сутки, например, 2, 3, 4, 5 или 6 раз в сутки, но предпочтительно 1 или 2 раза в сутки так, чтобы общая доза для взрослого человека массой 70 кг находилась в диапазоне от 0,001 до примерно 15 мг на кг массы субъекта за одно введение. Предпочтительная доза составляет от 0,01 до примерно 1,5 мг на кг массы субъекта за одно введение, и такое лечение может продолжаться в течение нескольких недель или месяцев, а в некоторых случаях, лет. Однако очевидно, что конкретный уровень доз для каждого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая активность конкретного применяемого соединения; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион питания вылечиваемого индивидуума; время и путь введения; скорость выведения; другие лекарственные средства, которые были введены ранее; и тяжесть конкретного заболевания, подвергаемого лечению, как понятно специалисту в данной области техники. Типичная доза может представлять собой одну таблетку от 1 мг до примерно 100 мг или от 1 мг до примерно 300 мг, принимаемую один раз в сутки или несколько раз в сутки, или одну капсулу или таблетку с замедленным высвобождением, принимаемую один раз в сутки и содержащую пропорционально более высокое количество активного ингредиента. Эффект замедленного высвобождения может достигаться за счет веществ капсул, которые растворяются при различных значениях pH, за счет капсул, которые медленно высвобождают под действием осмотического давления или любыми другими известными способами контролируемого высвобождения. В некоторых случаях может быть необходимым применение доз вне данных диапазонов, что очевидно для специалиста в данной области техники.

Настоящее изобретение также обеспечивает соединение согласно настоящему изобретению для применения в лечении и/или предотвращении рака.

В настоящем описании рак предпочтительно представляет собой зависимые от Notch раковые опухоли и выбран из неограничивающей группы, включающей Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз (T-ALL), хронический миелоидный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), лимфому из клеток мантийной зоны, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, меланому, опухоли головного мозга, ангиогенез опухоли и рак толстой и прямой кишки.

Предпочтительно, соединения согласно настоящему изобретению (6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3), его производные) также можно применять в лечении раковых опухолей, когда зависимые от Notch раковые опухоли резистентны к лечению ингибиторами γ-секретазы. Зависимые от передачи сигнала Notch опухоли человека, резистентные к лечению ингибиторами γ-секретазы, могут быть определены по уровням NICD, целевых генов Notch, а также по мутационному статусу рецептора Notch и других компонентов пути Notch.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения и/или предотвращения рака, при этом указанный способ включает введение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3), его производных или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению нуждающемуся в этом субъекту.

В другом варианте реализации настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания, связанного с повышенной активностью пути передачи сигнала Notch, при этом указанный способ включает введение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3), его производного или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению нуждающемуся в этом субъекту.

Суточную дозу соединений согласно настоящему изобретению обязательно будут варьировать в зависимости от хозяина, которого лечат, конкретного пути введения и тяжести, и вида вылечиваемого заболевания. Соответственно, оптимальная доза может быть определена практикующим врачом, лечащим какого-либо конкретного пациента. Кроме того, следует отметить, что клинический врач или лечащий врач будет знать, как и когда следует начинать, прерывать, корректировать или прекращать лечение в соответствии с ответом индивидуального пациента.

Для любого соединения, применяемого в способе согласно настоящему изобретению, терапевтически эффективная доза может быть изначально установлена в анализах в культурах клеток, моделях у животных или в результате введения микродоз субъектам, представляющим собой человека.

В настоящем описании термин «лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в лечении субъекты включают тех, у кого уже есть нарушение, такое как рак, а также тех, у кого нарушение, такое как рак, должно быть предотвращено. Таким образом, у млекопитающего, предпочтительно человека, которого лечат согласно настоящему изобретению, может быть диагностировано нарушение, такое как рак, или он может быть предрасположен или подвержен нарушению, такому как рак.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству лекарственного средства, эффективному для лечения заболевания или нарушения у млекопитающего. В случае рака, терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшать количество клеток опухоли или раковых клеток, уменьшать размер опухоли; ингибировать (т.е. в некоторой степени замедлять и предпочтительно останавливать) проникновение раковых клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. в некоторой степени замедлять и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; в некоторой степени ингибировать рост опухоли; и/или в некоторой степени облегчать один или более симптомов, связанных с раком. В той степени, в которой соединения согласно настоящему изобретению могут предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, они могут быть цитостатическими и/или цитотоксическими. В настоящем описании термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для предотвращения или предпочтительно уменьшения по меньшей мере на примерно 30 процентов, предпочтительно по меньшей мере на 50 процентов, предпочтительно по меньшей мере на 70 процентов, предпочтительно по меньшей мере на 80 процентов, предпочтительно по меньшей мере на 90% клинически значимого изменения роста или прогрессирования, или митотической активности целевой клеточной массы, группы раковых клеток или другого признака патологии.

При желании соединения согласно настоящему изобретению можно применять против клеточно-пролиферативных заболеваний в комбинации (например, либо одновременно, либо почти одновременно, либо один за другим) с традиционными видами лечения, такими как стандартная лучевая терапия и/или стандартная химиотерапия. Стандартная лучевая терапия и химиотерапия также могут представлять собой одновременную химиолучевую терапию.

Следовательно, при желании стандартную лучевую терапию и/или химиотерапию можно проводить перед, одновременно или после введения терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению или фармацевтических композиций, содержащих данное соединение.

Термин «одновременная химиолучевая терапия» употребляется, когда эти два вида лечения (химиотерапию и лучевую терапию) проводят либо одновременно, либо почти одновременно, например, один за другим, либо в один и тот же день и т.д.

Термин «стандартная лучевая терапия» относится к использованию ионизирующего излучения как части лечения рака для контроля злокачественных клеток. Предпочтительно, ионизирующее излучение представляет собой γ-облучение. Также распространено комбинирование лучевой терапии с оперативным вмешательством, химиотерапией, гормональной терапией или их комбинациями. Наиболее распространенные виды рака обычно можно лечить лучевой терапией. Точный план лечения (радикальное, адъювантное, неоадъювантное или паллиативное) будет зависеть от вида опухоли, расположения и стадии, а также общего состояния здоровья нуждающегося в этом субъекта.

Термин «стандартная химиотерапия» в целом относится к лечению рака с применением конкретных химиотерапевтических/химических агентов. Термин «химиотерапевтический агент» относится к фармацевтическому агенту, обычно применяемому для лечения рака. Химиотерапевтические агенты для лечения рака включают, например, алтретамин, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, крисантаспазу (Crisantaspase), циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, флударабин, фторурацил, гемцитабин, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митомицин, митоксантрон, оксалиплатин, пентостатин, прокарбазин, стрептозоцин, тако (Taco), темозоламид, тиогуанин, тиотепу, топотекан, треосульфан, винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин.

Когда химиотерапевтический агент применяют в комбинации с соединением согласно настоящему изобретению, тогда их можно применять в форме лекарственного средства, содержащего комбинацию этих двух агентов, для одновременного введения или их можно применять в форме отдельных лекарственных форм, каждая из которых содержит один из агентов, и в последнем случае индивидуальные лекарственные формы можно применять, например, последовательно, т.е. одну лекарственную форму, содержащую соединение согласно настоящему изобретению, с последующей лекарственной формой, содержащей химиотерапевтический агент (или наоборот). Данный вариант двух отдельных лекарственных форм может быть разработан и предложен в форме набора.

Кроме того, при желании соединения согласно настоящему изобретению можно применять против клеточно-пролиферативных заболеваний, таких как раковые опухоли, в комбинации с традиционным удалением основной массы опухоли, например, путем сегментарной резекции (биопсия или обширная резекция).

Термин «удаление основной массы опухоли» относится к любому удалению, абляции или резекции основной массы опухоли у субъекта. Удаление может быть химическим, радиационным или хирургическим. Предпочтительно, указанное удаление является хирургическим, таким как абляция или резекция. Резекция может представлять собой «сегментарную резекцию» (или сегментэктомию), хирургическую процедуру для удаления части органа или железы у субъекта. Ее также можно использовать для удаления опухоли и здоровой ткани вокруг нее. Для удаления основной массы опухоли также можно использовать циторедуктивный агент. Термин «циторедуктивный агент» включает любую молекулу (например химическую, биологическую) или любой внешний/экзогенный агент (например, γ-облучение), или традиционное оперативное вмешательство, которое позволило бы уничтожить раковые клетки в основной массе опухоли (например, клетки FL1⁰ и FL1^-, упомянутые выше).

Другой задачей настоящего изобретения является предложение набора, содержащего одну или более доз 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) или одного из его производных, обладающего ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, для применения в способе лечения и/или предотвращения раковых опухолей. Набор может дополнительно содержать одну или более доз химиотерапевтического агента. При желании набор также может содержать реагенты и/или инструкции по применению.

Как правило, набор содержит емкость и этикетку или листок-вкладыш, содержащий информацию о лекарственном средстве, на указанной емкости или в комплекте с ней. Подходящие емкости включают, например, флаконы, ампулы, шприцы и т.д. Емкости могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Емкость содержит фармацевтическую композицию, эффективную для лечения состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, емкость может представлять собой пакет для раствора для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). На этикетке или листке-вкладыше, содержащем информацию о лекарственном средстве, указано, что композицию применяют для лечения выбранного состояния, такого как рак.

Настоящее изобретение также относится к применению соединений согласно настоящему изобретению для ингибирования пути передачи сигнала Notch в клетках in vitro или in vivo. Как правило, указанные клетки представляют собой раковые клетки.

Также предусмотрен способ лечения субъекта от зависимого от Notch рака, включающий

i) определение в раковых клетках, полученных из биологического образца от указанного субъекта, является ли рак зависимым от пути передачи сигнала Notch, ii) и лечение указанного субъекта исходя из того, что рак является зависимым от Notch, путем введения терапевтически эффективного количества 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) формулы I или одного из его производных, обладающего ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

Зависимость от пути передачи сигнала Notch в раковых клетках обычно определяют любым способом, известным в данной области техники. В качестве примера, данный способ может заключаться в анализах активности комплекса γ-секретазы in vitro, описанных в настоящем документе.

Данный способ лечения может дополнительно включать применение по меньшей мере одного традиционного лечения рака. Традиционное лечение рака применяют перед, одновременно или после введения терапевтически эффективного количества 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) формулы I или одного из его производных, обладающего ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

Традиционное лечение рака обычно заключается в лучевой терапии и/или химиотерапии.

Настоящее изобретение также относится к применению соединений согласно настоящему изобретению в способе провоцирования апоптоза клетки либо in vitro, либо in vivo путем индуцирования остановки клеточного цикла G0/G1.

Для специалиста в данной области техники очевидно, что изобретение, описанное в настоящем документе, допускает вариации и модификации, отличные от тех, которые точно описаны. Следует понимать, что настоящее изобретение включает все такие вариации и модификации в пределах его сущности или существенных характеристик. Настоящее изобретение также включает все этапы, признаки, композиции и соединения, на которые приведена ссылка или которые указаны в настоящем описании, по отдельности или вместе, и все комбинации любых двух или более указанных этапов или признаков. Соответственно, настоящее изобретение следует рассматривать во всех проиллюстрированных аспектах и не как ограничивающее, при этом объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, и все изменения, которые подпадают под значение и диапазон эквивалентности, включены в него.

На протяжении всего настоящего описания приведены различные источники, полное содержание каждого из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

Приведенное выше описание будет более понятным со ссылкой на следующие примеры. Однако такие примеры приведены в качестве примеров способов практического применения настоящего изобретения и не ограничивают объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Конструкции и анализы по гену-репортеру:

кДНК DsRed DL4-IRES мыши клонировали в вектор pENTR1 (Invitrogen®) и, наконец, перемещали в целевой лентивирусный вектор с использованием стратегии клонирования Gateway (Invitrogen). Фосфоглицераткиназный (PGK) промотор регулировал экспрессию белка DL4. DL4-лентивирусные частицы получали в клетках 293Т путем котрансфекции DL4-лентивирусного вектора, экспрессионной плазмиды Gag/pol и плазмиды, кодирующей белки оболочки вируса. Для сверхэкспрессии белка Notch полноразмерную кДНК Notch1 мыши клонировали в вектор pCDNA3.1-IRES-пуромицин. кДНК Notch1 клонировали выше IRES-пуромицина между сайтами рестрикции HindIII и XbaI. Промотор CMV контролировал экспрессию белка Notch1.

Для измерения активации передачи сигнала Notch консенсусные ДНК-связывающие последовательности CSL/RBP-jk клонировали в конформации «голова к хвосту» в люциферазном векторе pGL4 (Promega), таким образом называемом люциферазным вектором 12×CSL/RBP-jjk. Для определения активации пути Notch в анализе со скринингом химических соединений консенсусные ДНК-связывающие последовательности 12×CSL/RBP-jk клонировали в вектор pGL4.26.люцифераза (Promega). В качестве внутреннего контроля эффективности трансфекции использовали вектор Renilla SV40 (Promega).

Исследования сверхэкспрессии NICD-GFP проводили с использованием экспрессионной плазмиды pEGFP-C1-NICD. Плазмида FLAG-CMV2, экспрессирующая MAML1-FLAG, была любезно подарена Dr. Lizi Wu, Гарвардская медицинская школа, Бостон.

Получение стабильных клеток DL4- и N1-HeLa:

Для получения стабильных линий клеток с DL4 и N1 клетки HeLa приобретали у Американской коллекции типовых культур, АТСС (№ по каталогу CCL-2). Для получения стабильных линий с DL4 клетки трансдуцировали DL4-лентивирусными частицами. Стабильные клоны DL4 отбирали с использованием пуромицина. Клоны с высокой экспрессией DL4 сортировали с использованием антител к DL4 с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS). Для получения стабильной линии с N1 клетки трансфицировали плазмидой pCDNA3.1+ (Invitrogen), содержащей полноразмерный Notch1 мыши, под контролем промотора CMV. Для отбора клонов, экспрессирующих Notch1, кассету IRES-пуромицин клонировали ниже кДНК Notch1. Клетки HeLa, экспрессирующие высокие уровни Notch1, обогащали путем FACS с использованием антител анти-Notch1. Клетки DL4- и N1-HeLa культивировали в DMEM (GIBCO, Invitrogen), 10% FCS и 10 мкг/мл пуромицина (Sigma).

Высокопроизводительный скрининг и анализы данных:

Для скрининга библиотек химических соединений анализ в совместной культуре проводили следующим образом. Клетки N1-HeLa котрансфицировали в 10 см чашках для тканевой культуры 16 мкг вектора pGL4.26.12×CSL.люцифераза/планшет, 4 мкг экспрессионной плазмиды Notch1/планшет и 200 нг вектора Renilla SV40/планшет. Клетки DL4- и N1-HeLa отделяли от планшета путем использования 0,5 мм EDTA (1×ФБР). Обе популяции клеток подсчитывали и смешивали в соотношении 1:1 (5000:5000 клеток/лунка в 384-луночном планшете) и распределяли в 384-луночные планшеты (белые, с прозрачным дном, Corning) с использованием планшетного диспенсера Multidrop Combi. В аналитические планшеты предварительно распределяли (с использованием автоматического устройства для манипуляции с жидкостями Biomek 3000) библиотеки химических соединений (Microsource NIMDS, Maybridge Hitfinder и Prestwick) с получением конечной концентрации 10 мкМ. Конечный объем анализируемого образца составлял 22 мкл. Через двадцать четыре часа питательную среду аспирировали и клетки лизировали 1х пассивным буфером для лизиса в течение 10 минут при комнатной температуре. Активность люциферазы измеряли с использованием реагента для анализа с использованием люциферазы II (Luciferase Assay Reagent II) и значения Renilla определяли путем использования реагента Stop and Glow (система анализа Dual luciferase, кат № E1980, Promega). Считывание данных люциферазы и Renilla осуществляли с использованием многопланшетного ридера Tecan® F500 (Tecan). Все этапы манипуляций с жидкостями (аспирация среды, распределение пассивного буфера для лизиса, реагента для анализа с использованием люциферазы II (Luciferase Assay Reagent II) и реагентов Stop and Glow) проводили с использованием устройства для манипуляции с жидкостями ELF406.

Анализы данных осуществляли с использованием внутреннего разработанного программного обеспечения для анализа в Лаборатории биомолекулярного скрининга (BSF) в Федеральной политехнической школе Лозанны (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, EPFL).

Экстракция РНК.

Тотальную РНК экстрагировали из клеток с использованием набора для экстракции TRIzol® (Invitrogen). Вкратце, 1×10⁶ клеток промывали ледяным 1×ФБР и лизировали в 1 мл раствора TRIzol® в течение 5 минут при комнатной температуре для диссоциации нуклеопротеиновых комплексов. Затем лизированные клетки обрабатывали 200 мкл хлороформа и энергично встряхивали в течение 15-30 секунд, и инкубировали при комнатной температуре в течение 2-3 минут. Образцы центрифугировали при 14000 об/мин с использованием настольной центрифуги Eppendorf в течение 10 минут при 4°C. После центрифугирования верхнюю водную фазу переносили в новые пробирки Eppendorf. Для осаждения тотальной РНК к отделенной водной фазе добавляли 500 мкл изомилового спирта и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Осадок РНК получали путем центрифугирования образцов при 4°C в течение 10 минут. Полученный осадок РНК промывали 1 мл ледяного 75% этанола и центрифугировали при 14000 об/мин при 4°C. Осадок РНК сушили от избытка этанола и ресуспендировали в 40 мкл воды DPEC.

Синтез кДНК:

Тотальную РНК, экстрагированную из клеток, использовали для синтеза кДНК путем реакции обратной транскрипции. Обратную транскрипцию осуществляли с использованием обратной транскриптазы Superscript™ (Invitrogen). Концентрацию РНК измеряли с использованием спектрофотометра ND-1000 NanoDrop® (Witec AG), и 500 нг тотальной РНК смешивали с 10 мМ смесью дНТФ и 100 нг случайных праймеров. Реакционную смесь инкубировали при 65°C в течение 5 минут и быстро инкубировали на льду в течение 1 минуты. После инкубации на льду добавляли 5х буфер для синтеза первой цепи и 0,1Μ DTT, и смесь инкубировали в течение 2 минут при 25°C. Для начала реакции обратной транскрипции к реакционной смеси добавляли 200 ед. обратной транскриптазы Superscript™ II и инкубировали при 42°C в течение 50 минут. Реакцию останавливали путем инкубации реакционной смеси при 75°C в течение 15 минут.

Анализы методом вестерн-блоттинга:

Клетки лизировали в буфере RIPA (50 мМ Трис. Cl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1% нонидет Р-40, 0,5% дезоксихолат натрия и 0,1% SDS) в течение 30 минут при 4°C. Лизированные клетки центрифугировали с удалением осадка при 14000 об/мин при 4°C. Надосадочную жидкость переносили в новую пробирку eppendorf. Концентрацию белка определяли методом Бредфорда с использованием спектрофотометра (Ultrospec 3000 Pro). 40 мкг белка денатурировали в 1х гелевом загрузочном буфере SDS (100 мМ Трис. Cl, pH 6,8, 200 мМ DTT, 4% SDS, 0,2% бромфенол, 20% глицерин) путем нагревания при 99°C в течение 5 минут. Образцы денатурированного белка хранили на льду до загрузки на акриламидный гель. Образцы анализировали на 8% или 10% акриламидном геле в Трис-глициновом буфере для электрофореза (25 мМ Трис, 250 мМ глицин, 0,1% SDS). После разделения на акриламидном геле образцы белка переносили на мембрану ПВДФ (PEQ lab, номер по каталогу 39-3010) с использованием буфера для блоттинга (39 мМ глицин, 48 мМ основание Трис, 0,037% SDS и 20% метанол).

Для иммуноблоттинга мембраны блокировали 5% молоком и инкубировали в течение ночи совместно с первичными антителами при 4°C. Мембрану промывали 1×TBST (1x TBS+0,5% Твин 20) в течение 5 минут (3 раза) и инкубировали совместно с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), в течение одного часа при комнатной температуре. Сигнал детектировали с помощью хемилюминесцентного субстрата Super Signal West (Thermo Scientific, номер по каталогу 34077).

Иммунофлуоресцентное окрашивание:

Для выполнения иммунофлуоресцентного окрашивания клетки HeLa или клетки С2С12 выращивали на покровных стеклах. Клетки промывали 1х ледяным ФБР, фиксировали 4% PFA в течение 5 минут при комнатной температуре и пермеабилизировали с использованием 0,3% Тритона Х-100. Затем пермеабилизированные клетки блокировали 1% BSA в течение 20 минут при комнатной температуре. Клетки инкубировали совместно с соответствующими первичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре. Для детектирования первичных антител использовали вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488. Клетки контрастно окрашивали DAPI и заключали во флуоресцентные среды для заключения. Наблюдали и получали флуоресцентные изображения с использованием микроскопа Axioplan Zeiss в Главной лаборатории биовизуализации и оптики в EPFL.

Анализ дифференцировки миобластов С2С12:

Клетки С2С12 выращивали на покровном стекле, покрытом коллагеном, в присутствии питательных сред (10% сыворотки). Для индуцирования дифференцировки миобластов клетки выращивали до 100% конфлюэнтности в течение 3 дней в присутствии сред для дифференцировки (2% лошадиной сыворотки) или в присутствии питательных сред + ингибиторов Notch. Через 3 дня клетки промывали 1х ледяным ФБР и фиксировали 4% PFA. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили с использованием антитела анти-МНС, как описано в разделе 2.2.6 (Иммунофлуоресцентное окрашивание).

Анализы методом проточной цитометрии:

Анализы с использованием сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) проводили на инструментальной платформе ADP CyAn™ для проточной цитометрии в Главной лаборатории проточной цитометрии, EPFL. Экспрессию DL4 и Notch1 в клетках DL4- и N1-HeLa определяли с использованием антител анти-DL4 и анти-N1 соответственно. Развитие Т-клеток в тимусе исследовали с использованием антител к CD4, CD8 и TCR-β. Развитие клеток MZB контролировали с использованием антител к В220, CD21 и CD23. Вкратце, суспензию отдельных клеток получали из тимуса и селезенки. 1×10⁶ клеток суспендировали в 50 мкл сред для окрашивания (HBSS с добавлением 2% NCS и 25 мМ HEPES) и окрашивали соответствующими комбинациями антител путем инкубации на льду в течение 30 минут.

Для количественного определения процента апоптотических клеток проводили окрашивание Аннексином V и 7AAD. Тимусные клетки суспендировали в 300 мкл 1х Аннексии V-связывающего буфера (BD Biosciences, Сан-Диего, США) и инкубировали совместно с 10 мкл антитела Аннексии V-Cy5 и 10 мкл 7AAD (BD Biosciences, Сан-Диего, США). Образцы инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. FACS проводили через один час после окрашивания антителами.

Анализы методом проточной цитометрии проводили с использованием живых клеток путем гейтирования в координатах прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). Данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Ашленд, Орегон).

Анализ пролиферации с использованием аламарового синего:

Проводили анализы пролиферации с использованием аламарового синего® для определения кинетики роста клеток, обработанных ингибиторами Notch. Аламаровый синий® состоит из субстрата резазурина, проницаемого для клеток. В метаболически активных и пролиферирующих клетках резазурин превращается в резоруфин за счет внутренней восстановительной способности живых клеток и вызывает красную флуоресценцию. Поэтому выработка резоруфина служит индикатором жизнеспособности клеточной популяции.

Анализы пролиферации проводили путем высевания 5000 клеток/лунка в 96-луночный планшет. Клетки обрабатывали ДМСО или ингибиторами Notch в течение разных временных интервалов. Каждую обработку в течение каждого временного интервала осуществляли в 8 повторах. Для определения кинетики роста в каждую лунку добавляли 10 мкл аламарового синего® (Invitrogen) и инкубировали в течение 4 часов. Анализ с индикатором аламаровым синим проводили с использованием многопланшетного ридера Tecan® F500 (Tecan).

Окрашивание гематоксилином и эозином:

Брали для анализа органы, фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в течение ночи при 4°C и заливали парафином. Срезы тканей депарафинизировали и гидратировали с использованием уменьшающейся концентрации этанола (100%-70%) и, наконец, в дистиллированной воде. Срезы окрашивали гематоксилином в течение 5 минут, промывали в спиртокислоте в течение примерно 20 секунд, а затем промывали в проточной воде в течение 10 минут. Затем срезы окрашивали эозином в течение 5 минут, промывали в воде и дегидратировали с использованием увеличивающейся концентрации этанола (70%-100%), и очищали в растворе ксилола. Срезы заключали в среду с использованием раствора для заключения ткани. Рассматривали срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, и получали изображения с использованием микроскопа Leica DMI4000.

Окрашивание альциановым синим:

Ткань кишечника промывали ледяным 1×ФБР, фиксировали в 4% PFA. Ткани заливали парафином и делали срезы толщиной 4 микрон. Срезы ткани кишечника депарафинизировали при 60°C и гидратировали уменьшающейся концентрацией спирта (100%-70%) и, наконец, промывали в дистиллированной воде. Проводили окрашивание альциановым синим в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали в проточной воде и, наконец, контрастно окрашивали в растворе ядерного прочного красного в течение 5 минут. Затем срезы ткани промывали в проточной воде, дегидратировали в 100% спирте и очищали в растворе ксилола. Затем рассматривали заключенные в среду срезы и получали изображения с использованием микроскопа Leica DMI4000.

Экспериментальные мыши:

Мышей содержали и разводили в виварии, EPFL, Лозанна. Мышей C57BL6 использовали для оценки кишечной токсичности химических соединений. Мышей MMTV-ErbB2/Neu-IRES Cre (фон FVB) получали от Dr. William J Muller, Университет Макгилла, Монреаль и генотипировали с использованием MMTV-ErbB2/Neu специфичных праймеров (Ursini-Siegel et al., 2008). Мышей NOD/SCIDγc^-/- приобретали у The Jackson Laboratory (США), содержали и разводили в виварии, EPFL, Лозанна.

Кишечная токсичность и влияние на развитие В-клеток маргинальной зоны:

Мышам С57В16 интраперитонеально (и/п) вводили масло или 25 мг/кг соединения I3, или 10 мг/кг CPA путем инъекции один раз в сутки в течение 5-7 дней. Мышей взвешивали с использованием весов в 0 день, 3 день и 5 день. В 8 день ткань кишечника, селезенку и тимус забирали для анализов.

Анализ с трансплантацией опухоли:

Линии лейкозных клеток человека RPMI 8402 и НРВ ALL трансдуцировали лентивирусом, содержащим ген люциферазы, конститутивно экспрессируемый ниже промотора CMV. Линии лейкозных клеток человека RPMI 8204 (0,5-1×10⁶ клеток) и НРВ ALL (1×10⁶) суспендировали в 100 мкл ледяного 1×ФБР и выдерживали на льду до трансплантации. Мышам NOD/SCIDγc^-/- трансплантировали линии лейкозных клеток человека путем внутривенной (в/в) инъекции. Мышей наблюдали на предмет развития опухоли с использованием системы прямой визуализации Caliper IVIS (Xenogen). Вкратце, субстрат люциферазы люциферин (Biosynth, L-8820) растворяли в 1×ФБР и вводили (интраперитонеально) мышам путем инъекции в концентрации, составляющей 150 мг/кг массы тела. Мышей подвергали визуализации через 5 минут после инъекции люциферина с использованием системы прямой визуализации Caliper IVIS.

В 13-15 день мышей лечили маслом или 25 мг/кг соединения I3 каждый день. Изображения получали в конце экспериментов.

У мышей забирали первичные опухоли молочных желез MMTV-ErbB2/Neu и получали суспензию отдельных клеток. 1×10⁶ клеток первичной опухоли суспендировали в 50 мкл 1×ФБР и выдерживали на льду. Трехнедельных реципиентных мышей FVB освобождали от эндогенного эпителия и клетки опухоли вводили в свободную от эпителия жировую подушку путем инъекции. Наблюдали за развитием опухолей у реципиентных мышей и измеряли объемы опухолей с использованием цифрового штангенциркуля. Объемы опухолей рассчитывали с использованием следующей формулы: 2×длина×(ширина)². После того как опухоль достигала объема примерно 100 мм, реципиентных мышей лечили маслом или 25 мг/кг соединения I3 через день.

Разработка анализа

Для идентификации новых модуляторов пути Notch заявители разработали анализ в совместной культуре, в котором клетки HeLa, экспрессирующие лиганд DL4, культивировали совместно с клетками N1-HeLa, что тем самым приводило к активации пути Notch. Использование системы совместной культуры клеток DL4- и N1-HeLa имитирует физиологические условия межклеточной коммуникации между клетками, экспрессирующими лиганд и рецептор. Получение in vitro контролируемой системы анализа рецептор-лиганд позволило заявителям модифицировать и контролировать интенсивность сигнала Notch с помощью ингибиторов γ-секретазы.

Совместное культивирование клеток DL4:N1 HeLa активирует передачу сигнала Notch

Для начала анализа в совместной культуре заявители сформировали стабильные линии клеток HeLa, экспрессирующих DL4 и N1. Вкратце, клетки HeLa трансдуцировали лентивирусом, содержащим кДНК DL4 ниже промотора PGK. Клеточную популяцию, экспрессирующую D4, обогащали путем сортировки клеток с активированной флуоресценцией. Подобным образом, стабильную линию клеток N1-HeLa формировали с использованием плазмиды, содержащей кДНК N1 мыши, с последующим использованием кассеты селекции IRES-Пуромицин. Данная система позволила заявителям отобрать клоны, экспрессирующие только Notch1, при отборе с использованием пуромицина. Уровни экспрессии белков DL4 и N1 в соответствующих линиях клеток определяли с использованием антител анти-DL4 и анти-N1. Количественное определение уровней белков путем проточной цитометрии демонстрировало высокий уровень экспрессии DL4 и N1 по сравнению с родительскими клетками HeLa (данные не представлены).

Для оценки потенциала стабильных линий клеток в отношении активации пути Notch, стабильные клетки DL4- и N1-HeLa (DL4-HeLa и N1-HeLa соответственно) совместно культивировали в соотношении 1:1 в 6-луночном планшете и выращивали до конфлюэнтности. Совместно культивированные клетки обрабатывали ДМСО или DAPT (10 мкМ) в течение 24 часов. Для сравнения, родительские клетки HeLa также совместно культивировали с клетками DL4-HeLa и выращивали в присутствии или отсутствии DAPT в течение 24 часов. Проводили анализ методом вестерн-блоттинга на предмет активной формы Notch1 (NICD) с использованием антител VAL1744, и он показал лишь умеренные уровни NICD, когда родительские клетки HeLa совместно культивировали с клетками DL4-HeLa (данные не представлены), что объясняет низкий уровень эндогенного Notch1 в клетках HeLa. С другой стороны, в отсутствии лиганда (клетки DL4-HeLa) или в присутствии GSI (DAPT) уровни NICD не обнаруживали, что указывает на утрату передачи сигнала Notch (данные не представлены). Однако совместные культуры клеток DL4- и N1-HeLa выявили значительно более высокие уровни NICD, которые можно блокировать путем обработки DAPT (данные не представлены). Временное введение полноразмерной кДНК Notch1 в клетки N1-HeLa дополнительно повысило надежность анализа в совместной культуре, на что указывают повышенные уровни белка NICD (данные не представлены). Ингибирование расщепления N1 с помощью DAPT может отменять повышение активности передачи сигнала Notch (данные не представлены). Данные результаты подтвердили, что в анализе в совместной культуре DL4:N1 могли быть достигнуты высокие уровни активации пути Notch, которые отвечают на ингибирование GSI.

Разработка анализа в совместной культуре DL4:N1 в формате 6-луночного планшета позволила заявителям оценить активацию передачи сигнала Notch, опосредуемую взаимодействиями рецептор-лиганд. Обработка системы совместной культуры GSI (DAPT) могла блокировать передачу сигнала Notch, регулируемую взаимодействиями рецептор-лиганд.

Разработка совместимого с высокопроизводительным скринингом (HTS) анализа

Первоначально анализ в совместной культуре DL4:N1 разрабатывали в 6-луночном планшете. Для начала высокопроизводительного скрининга (HTS) систему анализа дополнительно оптимизировали для надежной работы в формате 384-луночного планшета.

Масштаб анализа уменьшали до формата 384-луночного планшета для скрининга библиотек химических соединений. Для осуществления этого клетки N1-HeLa трансфицировали репортерными плазмидами и вектором экспрессии N1. Через двенадцать часов химические соединения распределяли в 384-луночный планшет наряду с ДМСО и DAPT в качестве отрицательного и положительного контролей. Клетки DL4- и N1-HeLa смешивали в соотношении 1:1 (5000:5000 клеток/лунка) и добавляли в 384-луночные планшеты с использованием планшетного диспенсера multidropCombi. Данные люциферазы получали с использованием системы анализа Dual luciferase. Для оптимизации и определения воспроизводимости анализа половину планшета обрабатывали ДМСО (192 лунки), а вторую половину обрабатывали 10 мкМ DAPT (192 лунки). Обработка DAPT приводила к 10-кратной понижающей регуляции активации передачи сигнала Notch. Значение Zʹ для данного анализа было выше 0,5. Значение Zʹ>0,5 подтверждает достоверность и воспроизводимость данных анализов для «кампании» HTS.

Пример 2

6-(4-Трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) в качестве нового ингибитора передачи сигнала Notch

Соединение I3 ингибирует опосредуемую NICD активацию передачи сигнала Notch:

Для подтверждения ингибирующей активности в отношении Notch и определения значения IC50 соединения I3 использовали систему анализа в совместной культуре DL4:N1. Клетки в анализе в совместной культуре обрабатывали в течение 24 часов увеличивающейся концентрацией соединения I3 (2-10 мкМ). Активацию пути Notch измеряли с использованием анализа репортерного гена люциферазы, регулируемого Notch. Как показано на фиг. 1А, соединение I3 блокирует передачу сигнала Notch зависимым от концентрации образом со значением IC50 в нижнем мкМ диапазоне.

Для определения того, может ли сверхэкспрессия NICD отменить ингибирование передачи сигнала Notch, опосредованное соединением I3, клетки HeLa котрансфицировали экспрессионной плазмидой NICD и конструкцией 12×CSL-люцифераза. Трансфицированные клетки обрабатывали увеличивающейся концентрацией соединения I3 и DAPT. Удивительно то, что обработка клеток, экспрессирующих NICD, соединением I3 могла блокировать активацию пути дозозависимым образом, тогда как DAPT не оказывал влияния на активацию передачи сигнала (фиг. 1B). Эти данные позволяют предположить, что ингибирование пути Notch, опосредованное соединением I3, обусловлено его активностью ниже от процесса расщепления S3.

Затем заявители исследовали, может ли соединение I3 блокировать активацию пути через другие рецепторы Notch или оно специфично в отношении передачи сигнала Notch1. Для исследования этого использовали анализ в совместной культуре, в котором передачу сигнала Notch активировали через пары лиганд-рецептор DL4:N1 или DL4:N2. Обработка клеток в этих двух анализах в совместной культуре соединением I3 вызывала ингибирование передачи сигнала Notch через пары лиганд-рецептор как DL4:N1, так и DL4:N2 (фиг. 1C). Подобным образом, соединение I3 также могло блокировать активацию пути через Notch1-внутриклеточный домен (NICD) и Notch2-внутриклеточный домен (N2-ICD), что позволяет предположить, что соединение I3 не является специфичным в отношении опосредуемой NICD активации (фиг. 1D).

6-(4-Трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин не блокирует ядерную локализацию NICD:

Данные in vitro клеток HeLa, трансфицированных NICD, позволяют предположить, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) блокирует передачу сигнала Notch путем действия ниже от процесса расщепления S3. Это допускает несколько возможностей, касающихся механизма действия 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3). Например, обработка 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) могла нарушать ядерную локализацию NICD. Второй возможный механизм ингибирования мог заключаться в прицельном воздействии на один или более отдельных компонентов комплекса активации транскрипции в ядре. Для тестирования того, оказывает ли 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) влияние на ядерный транспорт NICD, клетки HeLa трансфицировали гибридной конструкцией NICD-GFP и обрабатывали ДМСО и 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3). Это позволило заявителям проследить за транспортом гибридного белка в клетке. Параллельно, ингибирование пути, опосредованное 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), определяли путем измерения люциферазы, регулируемой Notch (данные не представлены). Микроскопические исследования показали, что в клетках, обработанных ДМСО, гибридный блок NICD-GFP перемещался в ядро, что не нарушалось при обработке 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) (данные не представлены). Эти данные исключают выход NICD из ядра в качестве механизма действия 6-(4-трет-бутил фенокси)пиридин-3-амина (I3).

Сверхэкспрессия MAML1 выше определенного порогового значения может отменять ингибирование передачи сигнала Notch, индуцированное 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3):

Поскольку блокировка передачи сигнала Notch, опосредованная 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), не включает выход NICD из ядра, заявители исследовали, блокирует ли 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) взаимодействие и тем самым субъядерную локализацию NICD, MAML1 и CSL-RBP-jk (всех частей центрального комплекса активации транскрипции). Для этого клетки HeLa котрансфицировали 800 нг плазмиды NICD-GFP, 1 мкг вектора экспрессии MAML1-FLAG и выращивали на покровных стеклах. Трансфицированные клетки HeLa обрабатывали ДМСО или 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) (10 мкМ) в течение 24 часов. Способность 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) блокировать активацию Notch в данной концентрации NICD и MAML1 подтверждали путем измерения люциферазы, регулируемой Notch (данные не представлены). После обработки клетки фиксировали 4% PFA, блокировали 1% BSA и окрашивали антителами к FLAG-меченому MAML1 и CSL-RBP-jk. Гибридный белок NICD-GFP визуализировали путем отслеживания белка GFP. При экспрессии отдельно белок NICD-GFP локализовался в ядре распространенным образом и обработка 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) не меняла его ядерную локализацию. Однако сверхэкспрессия NICD-GFP и MAML1 приводила к колокализации обоих белков в субъядерные компартменты (возможно ядерные тельца). Обработка клеток 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) не нарушала транслокацию и колокализацию NICD-GFP и MAML1 в субъядерном компартменте (данные не представлены).

Подобным образом, локализацию CSL/RBP-jk исследовали с использованием антител, специфичных к данному белку. Как показано на фиг. 22С, MAML1-FLAG и CSL/RBP-jk колокализовались в субъядерных компартментах, и обработка 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) не нарушала их распределение в ядре (данные не представлены). Эти данные позволяют предположить, что обработка 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) не нарушает колокализацию компонентов комплекса активации транскрипции Notch в ядре. Однако по-прежнему необходимо исследовать блокирует ли данная обработка взаимодействие между различными компонентами указанного комплекса.

Для дополнительного исследования механизма действия 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) заявители предположили, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) вероятно прицельно воздействует на один из компонентов комплекса активации транскрипции. Сверхэкспрессия данного целевого белка может «оттитровать» соединение, представляющее собой 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3), и таким образом отменить ингибирование пути, индуцированное 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3). Для исследования этого вопроса клетки HeLa котрансфицировали 800 нг плазмиды NICD-GFP и увеличивающимся количеством (0,1 и 3 мкг) вектора экспрессии MAML1-FLAG. Активацию пути Notch измеряли путем введения плазмиды 12×CSL-люцифераза. Как показано на фиг. 2, в клетках HeLa, трансфицированных одним NICD или NICD+1 мкг MAML1, обработка 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) может блокировать передачу сигнала Notch зависимым от концентрации образом. Однако когда количество плазмиды MAML1 увеличивали до 3 мкг, обработка 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) больше не могла ингибировать активацию передачи сигнала Notch (фиг. 2). Следовательно, сверхэкспрессия MAML1 выше определенного порогового значения могла отменять ингибирование пути Notch, опосредованное 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3). Эти данные позволяют предположить, что сам MAML1 может являться мишенью для соединения, представляющего собой 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3). Увеличение концентрации MAML1 может «оттитровать» ингибитор и таким образом сделать его неспособным блокировать сигнальный каскад.

Обработка 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) уменьшает передачу сигнала Notch в линиях раковых клеток человека:

Аберрантная активация передачи сигнала Notch играет важную роль в зарождении опухоли и/или поддержании раковых опухолей человека. Для определения того, может ли обработка 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) блокировать передачу сигнала Notch в раковых клетках человека, различные линии раковых клеток (линии клеток T-ALL RPMI 8402, НРВ ALL, KOPTK1 и линию клеток рака поджелудочной железы PANC1) обрабатывали 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) в течение 24 часов. Влияние на передачу сигнала Notch определяли путем измерения уровней экспрессии целевых генов Notch. Обработка линий раковых клеток человека (RPMI 8402, НРВ ALL, KOPTK1 и PANC1) 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) в течение 24 часов и последующие анализы целевых генов Notch путем количественной ОТ-ПЦР или анализы методом вестерн-блоттинга показали, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) индуцировал статистически значимую понижающую регуляцию целевых генов Notch, таких как Hes1, cMyc и Dtx1, в мРНК, а также на уровнях белка (фиг. 3). Понижающая регуляция целевых генов Notch коррелирует с пониженными уровнями NICD (фиг. 3В, С и D).

Поскольку обработка линий клеток человека T-ALL и линии клеток рака поджелудочной железы PANC1 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) индуцировала понижающую регуляцию передачи сигнала Notch, заявители исследовали, приводит ли данное ингибирование пути к остановке роста раковых клеток. С этой целью линии клеток RPMI 8402, KOPTK1, PANC1 и клеток меланомы, регулируемых nRas, выращивали в присутствии или отсутствии 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) в течение нескольких дней, и измеряли их пролиферативный индекс с использованием анализа с аламаровым синим. Кроме того, линии В-лимфоцитов RAJI без известных мутаций Notch использовали в качестве контроля (данные не представлены). Как показано на фиг. 4, обработка 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) и DAPT индуцировала значительную блокировку пролиферации в линиях клеток T-ALL RPMI 8402, KOPTK1 и линии клеток рака поджелудочной железы PANC1. Подобным образом, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) значительно ингибировал рост линий клеток меланомы, регулируемых nRas (фиг. 4). Однако ни DAPT, ни 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) не оказывал никакого влияния на пролиферацию независимых от Notch клеток RAJI (данные не представлены).

6-(4-Трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3), но не DAPT, блокирует передачу сигнала Notch в линии клеток T-ALL и рака молочной железы человека, сверхэкспрессирующих NICD.

6-(4-Трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) может блокировать опосредуемую NICD активацию пути Notch (фиг. 1). Для определения того, может ли 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) также индуцировать блокировку пролиферации клеток, сверхэкспрессирующих NICD, линию клеток T-ALL человека DND41 (DND41-Родительские) трансдуцировали лентивирусом, экспрессирующим NICD, с получением линии клеток DND41-NICD. Эти две линии клеток обрабатывали ДМСО, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) и DAPT. Обработка линии DND41-родительских клеток DAPT и 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) приводила к понижающей регуляции Hes1 по сравнению с клетками, обработанными ДМСО. Однако, когда клетки DND41-NICD обрабатывали ДМСО, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) и DAPT, обработка только 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином, но не DAPT, вызывала понижающую регуляцию Hes1 (фиг. 5А). Кроме того, за данными двумя линиями клеток также наблюдали в течение нескольких дней на предмет антипролиферативного действия 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) и DAPT. Наблюдали, что тогда как обработка как 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), так и DAPT вызывала значительную блокировку пролиферации в линии DND41-родительских клеток (фиг. 5В), только 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) мог индуцировать остановку роста клеток DND41-NICD (фиг. 5С). Эти данные дополнительно подкрепляют идею о том, что соединение, представляющее собой 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3), может блокировать опосредуемую NICD активацию пути и пролиферацию раковых клеток человека.

Для дополнительного подкрепления идеи о том, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) может блокировать опосредуемую NICD активацию пути и пролиферацию раковых клеток человека, линии клеток рака молочной железы человека НСС1187 обрабатывали данным соединением. Линия клеток НСС1187 содержит хромосомную транслокацию SEC22B-Notch2, что таким образом приводит к образованию конститутивно активной формы N2-ICD (фиг. 5D). Из-за данной мутации линии клеток НСС1187 не отвечают на ингибиторы γ-секретазы, такие как DAPT. Как показано на фиг. 5Е, тогда как обработка DAPT не ингибировала пролиферацию линий клеток НСС1187, обработка 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) значительно индуцировала блокировку пролиферации в данной линии клеток.

6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) индуцирует остановку клеточного цикла G0/G1 и апоптоз в линиях клеток Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза человека:

Как показано на фиг. 4 и 5, обработка линий лейкозных клеток человека и линий клеток рака молочной железы человека 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) отрицательно регулирует пролиферацию. Данная остановка пролиферации, опосредуемая 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), могла быть обусловлена индукцией апоптоза или остановкой клеточного цикла в ходе различных фаз клеточного цикла. Кроме того, было показано, что ингибирование передачи сигнала Notch с использованием ингибиторов γ-секретазы индуцирует остановку клеточного цикла G0/G1 в линиях клеток человека TALL. Поэтому для дальнейшего выяснения механизмов, ответственных за остановку пролиферации, опосредуемую 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), проводили анализы клеточного цикла и апоптоза. Линии клеток TALL человека (RPMI8402, KOPTK1, TALL1, CUTL1 и НРВ ALL) и линию клеток рака молочной железы человека НСС1187 обрабатывали 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) или ДМСО в течение 2 дней или 7 дней. Для исследования гибели клеток проводили окрашивание Аннексином V и долю апоптотической (Аннексии V-положительной) клеточной популяции определяли путем анализов методом проточной цитометрии после 7 дней обработки. Как показано на фиг. 6а, обработка 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) индуцирует значительный апоптоз в RPMI8402, CUTL1, KOPTK1, TALL1 и НРВ ALL. Подобным образом, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин индуцирует апоптоз в линии клеток рака молочной железы человека НСС1187 (фиг. 6С).

В дополнение к индукции апоптоза, остановка пролиферации, наблюдаемая в линиях лейкозных клеток человека и линии клеток рака молочной железы, обработанных 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), также, по-видимому, обусловлена остановкой клеточного цикла в фазе G0/G1 клеточного цикла. Линии лейкозных клеток (RPMI8402, KOPTK1 и TALL1) и линии клеток рака молочной железы обрабатывали 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) в течение 48 часов и состояние клеточного цикла определяли с использованием Κi67 и красителя Хехст. Как показано на фиг. 6В и 6D, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) индуцирует остановку в фазе G0/G1 клеточного цикла, фенотип, обычно наблюдаемый в результате ингибирования передачи сигнала Notch.

Ингибирование передачи сигнала Notch, опосредованное 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), индуцирует дифференцировку миобластов С2С12:

Для дополнительного подтверждения ингибиторного потенциала 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) в отношении Notch в различных системах, дифференцировку миобластов С2С12 использовали в качестве функционального анализа. Активация пути Notch в миобластах С2С12 сохраняет их в недифференцированном состоянии, тогда как отмена передачи сигнала Notch индуцирует их дифференцировку. Миобласты С2С12 обрабатывали ДМСО, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) и DAPT, и выращивали до 100% конфлюэнтности в течение 3 дней. Через три дня клетки фиксировали и окрашивали антителами к тяжелой цепи миозина (МНС). Ядра клеток контрастно окрашивали DAPI. Миобласты С2С12, выращенные в присутствии 10% сыворотки (питательной среды), сохраняли свое недифференцированное состояние, тогда как клетки, обработанные DAPT и 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), начинали дифференцироваться в многоядерные МНС-положительные мышечные трубочки (данные не представлены).

6-(4-Трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) не препятствует сигнальным каскадам Wnt и Hedgehog

Одним из вызывающих озабоченность вопросов, касающихся активности химического соединения, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3), является его специфичность в отношении пути передачи сигнала Notch. Для исследования того, может ли 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) также блокировать другие пути развития, заявители протестировали его способность блокировать пути передачи сигнала Wnt и Hedgehog. Вкратце, для измерения передачи сигнала Wnt, клетки HeLa трансфицировали плазмидой, содержащей промотор, состоящий из сайтов связывания TCF/LEF и тем самым регулирующий экспрессию гена люциферазы (ТОР-люцифераза). Для активации пути Wnt, плазмиду, кодирующую β-катенин, котрансфицировали в клетки HeLa. Котрансфицированные клетки инкубировали в присутствии или отсутствии химического соединения, представляющего собой 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3). Временное введение β-катенина приводило к повышающей регуляции передачи сигнала Wnt, измеряемой по активности люциферазы, регулируемой β-катенина-TCF/LEF. Важно то, что обработка клеток с активированной передачей сигнала Wnt 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) не блокировала активацию пути Wnt (данные не представлены).

С использованием подобной стратегии передачу сигнала Hedgehog активировали в клетках HeLa путем введения фактора транскрипции GH1, и активацию пути контролировали с использованием промоторной последовательности, содержащей сайты связывания GH1, регулирующие экспрессию люциферазы. Обработка данных клеток 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) не приводила к ингибированию сигнального каскада Hedgehog (данные не представлены). Эти данные в совокупности позволяют предположить, что химическое соединение, представляющее собой 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3), возможно не нарушает другие пути развития и вероятно является специфичным в отношении ингибирования передачи сигнала Notch. Однако по-прежнему необходимо определить является ли устойчивость передачи сигнала Wnt и Hedgehog к действию 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) характерной для определенных типов клеток или это общее явление.

Действие 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) in vivo у мышей C57BL6:

Передача сигнала Notch регулирует гомеостаз некоторых органов во время развития. Например, опосредуемая Notch1 активация пути необходима для развития Т-клеток в тимусе (Radtke et al., 1999). Однако регулируемое Notch1 развитие Т-клеток, по-видимому, не зависит от MAML1, т.к. утрата MAML1 не нарушала развитие Т-клеток у мышей. Это могло быть обусловлено компенсаторным механизмом членов семейства MAML2 и MAML3 в ответ на утрату MAML1. В селезенке регулируемая Notch2 передача сигнала исключительно через MAML1 необходима для развития клеток MZB. Генетическая абляционная утрата Notch2 и MAML1 вызывает блокировку развития клеток MZB (Wu et al., 2007, Saito et al., 2003). Кроме того, передача сигнала Notch через как Notch1, так и Notch2 необходима для поддержания пристеночной микрофлоры. Сложная генетическая абляция Notch1 и Notch2 в кишечнике приводит к метаплазии бокаловидных клеток. Поэтому заявители исследовали, может ли 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) нарушать вышеупомянутые зависимые от Notch процессы развития.

В анализах в культуре in vitro химическое соединение, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3), мог блокировать опосредуемую Notch1 и Notch2 активацию пути. Поэтому заявители выдвинули гипотезу от том, что лечение мышей 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) может приводить к метаплазии бокаловидных клеток в кишечнике. Для проверки данной гипотезы мышам интраперитонеально (и/п) вводили 25 мг/кг 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) путем инъекции в течение 7 последовательных дней. В 8 день животных умерщвляли, и ткани кишечника фиксировали и заливали парафином. Гистологические анализы проводили с использованием альцианового синего для окрашивания на предмет бокаловидных клеток. Удивительно то, что несмотря на способность блокировать опосредуемую как Notch1, так и Notch2 активацию пути в культурах in vitro, ткань кишечника мышей, которых лечили 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (13), была совершенно нормальной с интактной структурой и без признака метаплазии бокаловидных клеток (данные не представлены). Подобным образом, также контролировали влияние 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) на изменения массы тела. Мышам вводили в течение 5 последовательных дней 25 мг/кг 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) путем инъекции и фиксировали изменения массы тела. Лечение мышей 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) не вызывало потерю массы тела.

Лечение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином индуцирует блокировку развития клеток MZB:

Заявители выдвинули гипотезу от том, что ингибирование передачи сигнала Notch2, опосредуемое 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), должно приводить к блокировке развития клеток MZB в селезенке. Развитие клеток MZB оценивали путем окрашивания спленоцитов в ходе проточной цитометрии антителами к В220, CD21 и CD23. Как показано на фиг. 7В, лечение мышей 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) приводило к уменьшению процента клеточной популяции MZB в селезенке. Кроме того, потеря клеточной популяции MZB в селезенке также отражается в абсолютном числе клеток MZB (фиг. 7С).

Таким образом, блокировка развития клеток MZB, опосредуемая 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), имитирует утрату фенотипа Notch2 и MAML1. Однако по-прежнему необходимо рассмотреть, оказывает ли 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) ингибирующее действие в отношении Notch только через MAML1, или он может блокировать передачу сигнала Notch также через других членов семейства MAML.

Лечение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) замедляет рост опухоли Т-клеточного лейкоза человека в модели с ксенотрансплантацией:

Известно, что активация передачи сигнала Notch вследствие активирующих мутаций в разных компонентах пути вызывает более 50% Т-клеточных острых лимфобластных лейкозов человека. Поэтому заявители решили исследовать противораковую активность химического соединения, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3), при регулируемом Notch Т-клеточном лейкозе человека in vivo. Для достижения этой цели разрабатывали ксенотрансплантатные модели лейкоза человека с использованием мышей NOD/SCIDγc^-/-. Для этого использовали линии клеток T-ALL НРВ ALL и RPMI 8402. Линия клеток НРВ ALL содержит мутацию L1575P в домене гетеродимеризации и встраивание в домене PEST рецептора Notch1, что таким образом конститутивно активирует передачу сигнала Notch1. Подобным образом, клетки RPMI 8402 демонстрируют независимую от лиганда активацию передачи сигнала Notch вследствие встраивания в 1584 аминокислотного остатка в домене гетеродимеризации, а также инактивирующей мутации (R465H) в лигазе Е3 FBW7. Было обнаружено, что обе данные линии клеток отвечают на обработку 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) в анализах в культуре in vitro с точки зрения пролиферации и/или понижающей регуляции целевых генов Notch. Для определения того, формируется ли в данных линиях клеток лейкоз в условиях ксенотрансплантации, один миллион клеток из каждой линии внутривенно (в/в) вводили мышам NOD/SCIDγc^-/- путем инъекции. У животных развивался лейкоз со 100% пенетрантностью, и они умирали в течение 4 недель после трансплантации.

Как только было показано, что в линиях клеток RPMI 8402 и НРВ ALL развивался лейкоз в анализе с ксенотрансплантацией, их трансдуцировали лентивирусом, конститутивно экспрессирующим ген люциферазы. Это позволило заявителям визуализировать и контролировать прогрессирование лейкоза у мышей с использованием системы прямой визуализации Caliper IVIS (Xenogen). Для определения противораковой эффективности 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) при развившихся опухолях, проводили поддерживающий эксперимент. Один миллион клеток НРВ ALL вводили (интраперитонеально) мышам NOD/SCIDγc^-/- путем инъекции. Мышей наблюдали на предмет развития лейкоза путем детектирования лейкозных клеток, экспрессирующих люциферазу. После развития заболевания примерно в 15 день мышей делили на две группы. Одну группу лечили маслом в качестве контроля, а вторую группу лечили 25 мг/кг 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) каждый день. Как показано на фиг. 8а, у мышей, которых лечили маслом, развивался лейкоз со 100% пенетрантностью, тогда как лейкоз у мышей, которых лечили 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), не прогрессировал с такой же скоростью, как в группе, которую лечили маслом (фиг. 8А).

Подобным образом, в предварительном эксперименте мышам NOD/SCIDγс^-/- трансплантировали 5×10⁵ клеток RPMI 8402 и их лечили маслом или 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) после развития заболевания. Как показано на фиг. 8В, у животных, которых лечили маслом, развивался лейкоз, тогда как у мышей, которых лечили 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), не было данного заболевания. Кроме того, гистологические анализы показали, что у мышей, которых лечили маслом, лейкозные клетки прогрессировали до проникновения в печень, а у мышей, которых лечили 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), не развивались никакие метастатические поражения в печени (данные не представлены). Поскольку этих животных лечили химическим соединением, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3), в течение 27 дней, анализировали ткань кишечника для обнаружения какой-либо токсичности в кишечнике. Окрашивание ткани кишечника альциановым синим не выявило какого-либо нарушения числа бокаловидных клеток и структуры кишечника (данные не представлены).

Полученные с использованием модели лейкоза человека с ксенотрансплантацией данные заявителей в совокупности позволяют предположить, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) обладает способностью замедлять прогрессирование уже развившегося лейкоза. Благодаря своей способности влиять на прогрессирование опухоли, соединение I3 может являться подходящим кандидатом для дальнейшей разработки в качестве противоракового агента.

Опухоли молочных желез у мышей MMTV-ErbB2 демонстрируют активацию передачи сигнала Notch и влияние 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) на прогрессирование опухолей молочных желез.

При раке молочной железы человека высокие уровни белков Notch1 и Jagged1 коррелировали с малой выживаемостью пациентов с раком молочной железы. Кроме того, активация передачи сигнала Notch при раке молочной железы также облегчает метастазирование в кости и легкие. Поэтому для определения противоракового потенциала химического соединения, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3), при раке молочной железы исследовали модель рака молочной железы у мышей. Известно, что сверхэкспрессия ErbB2, регулируемая вирусом опухоли молочной железы мышей (MMTV), вызывает опухоли молочных желез у мышей. У трансгенных мышей MMTV-ErbB2 опухоли молочных желез развиваются с задержкой примерно 5-6 месяцев наряду с развитием метастазов в легких. Одной из характеристик опухолей молочных желез у мышей MMTV-ErbB2 является наличие преимущественно люминальных типов эпителиальных клеток. Известно, что передача сигнала Notch регулирует дифференцировку люминальных клеток из стволовых клеток молочных желез мышей. Поэтому заявители выдвинули гипотезу о том, что активация пути Notch в опухолях молочных желез MMTV-ErbB2 может вносить вклад в онкогенез отчасти за счет способствования дифференцировке люминальных эпителиальных клеток. С этой целью заявители исследовали уровни активации передачи сигнала Notch в опухолях молочных желез MMTV-ErbB2-IRES-Cre путем измерения уровней Hes1 путем вестерн-блоттинга. Как показано на фиг. 9А, опухоли молочных желез, регулируемые MMTV-ErbB2, экспрессируют очень высокие уровни белка Hes1 по сравнению с нормальными молочными железами мышей в соответствующей возрастной группе. Для исследования влияния 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) на развитие рака молочной железы, у мышей FVB, несущих трансген MMTV-ErbB2, забирали опухоли молочных желез MMTV-ErbB2. Получали суспензию отдельных клеток и 5×10⁵ клеток опухоли вводили путем инъекции в свободную от эпителия жировую подушку реципиентной мыши FVB. После развития прощупываемых опухолей, реципиентных мышей лечили либо маслом, либо 25 мг/кг 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) через день до конца эксперимента. Объем опухоли измеряли и фиксировали с постоянными интервалами. Предварительные результаты показали, что лечение реципиентных мышей, несущих опухоль, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) вызывало значительное замедление роста опухоли по сравнению с мышами, которых лечили только маслом (фиг. 9В). Эти данные показали, что 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) обладает способностью замедлять рост развившегося рака молочной железы.

6-(4-Трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) блокирует передачу сигнала Notch при первичных Т-клеточных острых лимфобластных лейкозах человека:

Для дополнительного исследования ингибирующего действия 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) в отношении Notch при соответствующем патологическом состоянии, исследовали образцы первичного TALL человека на предмет активации передачи сигнала Notch. Накопление активной формы Notch (NICD) использовали в качестве биомаркера активации пути. Несколько первичных TALL человека демонстрировали накопление онкогенного NICD, и обработка данных опухолей 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) приводила к понижающей регуляции этого белка. Более того, понижающая регуляция NICD в данных образцах первичного TALL человека коррелирует с остановкой пролиферации (данные не представлены). Образцы первичного TALL человека, которые не демонстрировали детектируемые уровни NICD, напротив, не отвечали на обработку 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амином (I3) (данные не представлены).

Эти данные показывают, что накопление NICD можно использовать в качестве биомаркера активации пути Notch и прогнозирования результата лечения с использованием ингибитора Notch, 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3).

Различные производные 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) проявляют способность блокировать активацию передачи сигнала Notch в анализе в совместной культуре DL4-N1:

Для повышения ингибирующей активности в отношении Notch, а также эффективности исходного соединения, представляющего собой 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3), тестировали различные химические производные соединения 13 в анализе в совместной культуре DL4-N1. В результате скрининга более 40 различных химических производных 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) получили следующие соединения из-за их способности блокировать активацию пути Notch в анализе в совместной культуре (фиг. 10).

I3-А). 6-(4-циклогексилфенокси)пиридин-3-амин

I3-B). 6-(4-(трет-пентил)фенокси)пиридин-3-амин (№ CAS 1036533-91-1)

I3-С). 4-(4-(трет-бутил)фенокси)анилин (№ CAS 56705-89-6)

I3-D). 6-(4-бутилфенокси)пиридин-3-амин

I3-Е). 4-(4-(трет-пентил)фенокси)анилин (№ CAS 328032-81-1)

I3-F). 4-(4-циклогексилфенокси)анилин (№ CAS 70682-64-3)

I3-G). 6-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)пиридин-3-амин

I3-H). 6-(3-(трет-бутил)фенокси)пиридин-3-амин (№ CAS 1098366-43-8)

I3-I). 4-(4-(трет-бутил)фенокси)-3-фторанилин (№ CAS 946785-77-9)

I3-J). 4-(4-изопропилфенокси)анилин

I3-K). 6-(4-(2,4,4-триметилпентан-2-ил)фенокси)пиридин-3-амин

I3-L). 4-(4-циклогексилфенокси)-3-фторанилин

I3-М). 3-фтор-4-(4-(трет-пентил)фенокси)анилин

I3-N). 6-(4-(2-метилпентан-2-ил)фенокси)пиридин-3-амин

I3-O). 4-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)анилин

I3-P). 4-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)-3-фторанилин

Как показано на фиг. 10, некоторые из этих производных (I3-A, I3-B, I3-C, I3-Е, I3-G, I3-Н, I3-М и I3-N) блокируют передачу сигнала Notch до уровней, сопоставимых с исходным соединением I3, тогда как производные I3-F и I3-I, по-видимому, обладают повышенной активностью.

Пример 3

Химический синтез его производного и предшественников

4-(2-метилпентан-2-ил)фенол

4-Бутирилфенол (1000 мг, 6,09 ммоль, 1,00 экв.) суспендировали в толуоле (25 мл) и ДХМ (5 мл), и охлаждали до 0°C. По каплям добавляли 2М раствор Me₃Al в толуоле (7 мл, 14,01 ммоль, 2,30 экв.) и таким образом растворяли исходное вещество. После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 часов реакционную смесь снова охлаждали до 0°C и по каплям добавляли TMSOSO₂CF₃ (1,1 мл, 6,09 ммоль, 1,00 экв.). После перемешивания при комнатной температуре в течение 3 дней реакционную смесь гасили путем вливания указанной смеси в ледяную воду. После подкисления 40% H₃PO₄ продукт экстрагировали этилацетатом (3х), и органические фазы промывали H₃PO₄-кислым насыщенным водным раствором NaCl. Растворитель удаляли при пониженном давлении при 30°C. Полученный неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ/петролейный эфир в соотношении от 1:1 до 2:1) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного масла (188 мг, с чистотой примерно 90% (по данным ЯМР), 0,95 ммоль, выход 15%). R_f=0,60 (ДХМ/MeOH 4%). Масс-спектрометрия высокого разрешения с ионизацией электрораспылением (HRMS (ESI)): рассчитано для C₁₂H₁₇O^- [М-Н]^- 177,1279, обнаружено: 177,1284. ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,24-7,18 (m, 2Н, ароматический H), 6,82-6,76 (m, 2Н, ароматический H), 5,12 (s, 1Н, OH), 1,60-1,52 (m, 2Н, C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃), 1,27 (s, 6Н, C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃), 1,16-1,01 (m, 2Н, C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃), 0,83 (t, J=7,3 Гц, 3Н, C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 153,03, 142,29, 127,11, 114,85, 47,35, 37,25, 29,23, 18,09, 14,90.

Общая процедура А:

Соответствующие нитропиридины или нитробензолы и конкретные фенолы растворяли в ДМФА или ДМСО. Добавляли безводный K₂CO₃ и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре, если не указано иное, до полного превращения. Затем реакционную смесь гасили путем добавления H₂O, и продукт экстрагировали EtOAc или Et₂O. Органические фазы промывали 1 Μ водным раствором NaOH (1х), а затем насыщенным водным раствором NaCl (1х). Растворитель удаляли досуха при пониженном давлении при 30°C. Остаток растворяли в ДХМ и фильтровали через вату с удалением неорганических солей. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии с получением соответствующих соединений, указанных в названии (I3-n, I3-nA-I3-nP).

2-(4-(трет-бутил)фенокси)-5-нитропиридин, I3-n

В соответствии с процедурой А, 2-хлор-5-нитропиридин (501 мг, 3,16 ммоль, 1.00 экв.) и 4-трет-бутилфенол (611 мг, 4,07 ммоль, 1,29 экв.) растворяли в ДМФА (6,0 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (654 мг 4,73 ммоль 1,50 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 14 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении от 1:100 до 1:50) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (820 мг, 3,01 ммоль, выход 95%). R_f=0,40 (EtOAc/PE в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₅H₁₇N₂O₃⁺ [М+Н]⁺ 273,1234, обнаружено: 273,1229. ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 9,06 (d, J=2,8 Гц, 1Н, ароматический H), 8,46 (dd, J=9,1, 2,8 Гц, 1H, ароматический Η), 7,53-7,42 (m, 2H, ароматический H), 7,17-7,05 (m, 2H, ароматический Η), 7,01 (d, J=9,1 Гц, 1H, ароматический H), 1,35 (s, 9H, C(CH₃)₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 167,20, 150,49, 148,98, 145,26, 140,29, 134,95, 126,99, 120,84, 111,38, 34,72, 31,57.

2-(4-циклогексилфенокси)-5-нитропиридин, I3-nA

В соответствии с процедурой А, 2-хлор-5-нитропиридин (300 мг, 1,89 ммоль, 1,00 экв.) и 4-циклогексилфенол (417 мг, 2,37 ммоль, 1,25 экв.) растворяли в ДМСО (6 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (397 мг, 2,87 ммоль, 1,52 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 27 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении от 1:100 до 1:75) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (600 мг, 2,01 ммоль, количественный выход). R_f=0,35 (EtOAc/PE в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₇H₁₉N₂O₃⁺ [М+Н]⁺ 299,1390, обнаружено: 299,1392. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 9,06 (d, J=2,9 Гц, 1Н, ароматический Η), 8,46 (dd, J=9,1, 2,9 Гц, 1H, ароматический H), 7,31-7,22 (m, 2H, ароматический H), 7,07 (dd, J=8,7, 2,3 Гц, 2H, ароматический H), 7,00 (d, J=9,1 Гц, 1Н, ароматический H), 2,58-2,51 (m, 1H, циклогексил H), 2,01-1,64 (m, 5H, циклогексил H), 1,56-1,10 (m, 5Н, циклогексил H). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 167,18, 150,71, 145,88, 145,17, 140,22, 134,89, 128,30, 121,12, 111,30, 44,08, 34,59, 26,95, 26,19.

5-нитро-2-(4-(трет-пентил)фенокси)пиридин, I3-nB

В соответствии с процедурой А, 2-хлор-5-нитропиридин (303 мг, 1,91 ммоль, 1,00 экв.) и 4-трет-пентилфенол (397 мг, 2,42 ммоль, 1,27 экв.) растворяли в ДМСО (6 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (403 мг 2,92 ммоль 1,53 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 7 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:100) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (530 мг, 1,85 ммоль, выход 97%). R_f=0,31 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₆H₁₉N₂O₃⁺ [М+Н]⁺ 287,1390, обнаружено: 287,1381. ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 9,07-9,05 (m, 1Н, ароматический H), 8,45 (dd, J=9,4, 2,4 Гц, 1Н, ароматический H), 7,40 (d, J=8,6 Гц, 2Н, ароматический H), 7,09 (d, J=8,6 Гц, 2Н, ароматический H), 6,99 (d, J=9,2 Гц, 1Н, ароматический H), 1,67 (q, J=7,4 Гц, 2Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃), 1,31 (s, 6Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃), 0,73 (t, J=7,4 Гц, 3Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 167,17, 150,46, 147,34, 145,20, 140,27, 134,90, 127,56, 120,72, 111,28, 37,89, 37,06, 28,55, 9,26.

1-(трет-бутил)-4-(4-нитрофенокси)бензол, I3-nC

В соответствии с процедурой А, 4-фторнитробензол (500 мг, 3,54 ммоль, 1,00 экв.) и 4-трет-бутилфенол (671 мг, 4,46 ммоль, 1,26 экв.) растворяли в ДМФА (6,0 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (857 мг 6,20 ммоль 1,75 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 52 часов. После экстракции EtOAc неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:100) с получением соединения, указанного в названии, в виде бледно-желтого твердого вещества (860 мг, 3,17 ммоль, выход 89%). R_f=0,72 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:9). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₆H₁₈NO₃⁺ [М+Н]⁺ 272,1281, обнаружено: 272,1272. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,24-8,16 (m, 2Н, ароматический H), 7,49-7,39 (m, 2Н, ароматический H), 7,06-6,97 (m, 4Н, ароматический H), 1,35 (s, 9Н, C(CH₃)₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 163,82, 152,29, 148,59, 142,54, 127,27, 126,03, 120,15, 116,98, 34,67, 31,58.

2-(4-бутилфенокси)-5-нитропиридин, I3-nD

В соответствии с процедурой А, 2-хлор-5-нитропиридин (103 мг, 0,65 ммоль, 1,00 экв.) и 4-бутилфенол (126 мг, 0,84 ммоль, 1,29 экв.) растворяли в ДМФА (2,5 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (143 мг 1,04 ммоль 1,59 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:100) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (190 мг, 0,70 ммоль, количественный выход). R_f=0,33 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₅H₁₇N₂O₃⁺ [М+Н]⁺ 273,1234, обнаружено: 273,1226. ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 9,05 (dd, J=2,9, 0,6 Гц, 1Н, ароматический H), 8,46 (dd, J=9,1, 2,8 Гц, 1Н, ароматический H), 7,32-7,21 (m, 2Н, ароматический H), 7,11-7,02 (m, 2Н, ароматический H), 7,00 (dd, J=9,0, 0,6 Гц, 1Н, ароматический H), 2,69-2,60 (m, 2Н, Ar-CH₂CH₂CH₂CH₃), 1,70-1,57 (m, 2Н, Ar-CH₂CH₂CH₂CH₃), 1,39 (dq, J=14,6, 7,3 Гц, 2Н, Ar-CH₂CH₂CH₂CH₃), 0,95 (t, J=7,3 Гц, 3Н, Ar-CH₂CH₂CH₂CH₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 167,27, 150,75, 145,22, 140,86, 140,30, 134,92, 129,91, 121,22, 111,32, 35,21, 33,67, 22,51, 14,08.

1-нитро-4-(4-(трет-пентил)фенокси) бензол, I3-nE

В соответствии с процедурой А, 4-фторнитробензол (318 мг, 2,25 ммоль, 1,00 экв.) и 4-трет-пентилфенол (460 мг, 2,28 ммоль, 1,24 экв.) растворяли в ДМСО (6 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (465 мг 3,37 ммоль 1,49 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:100) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (533 мг, 1,87 ммоль, выход 83%). R_f=0,70 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₇H₂₀NO₃⁺ [М+Н]⁺ 285,1365, обнаружено: 285,1359. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,25-8,14 (m, 2Н, ароматический H), 7,44-7,32 (m, 2Н, ароматический H), 7,06-6,96 (m, 4Н, ароматический H), 1,66 (q, J=7,4 Гц, 2Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃), 1,31 (s, 6Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃), 0,71 (t, J=7,4 Гц, 3Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 163,81, 152,24, 146,94, 142,56, 127,91, 126,01, 120,06, 116,99, 37,89, 37,06, 28,63, 9,27.

1-циклогексил-4-(4-нитрофенокси)бензол, I3-nF

В соответствии с процедурой А, 4-фторнитробензол (325 мг, 2,30 ммоль, 1,00 экв.) и 4-циклогексилфенол (519 мг, 2,94 ммоль, 1,28 экв.) растворяли в ДМСО (6 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (513 мг 3,72 ммоль 1,61 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении от 1:100 до 1:50) с получением соединения, указанного в названии, в виде бледно-желтого твердого вещества (640 мг, 2,15 ммоль, выход 93%). R_f=0,55 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₈H₂₀NO₃⁺ [М+Н]⁺ 298,1438, обнаружено: 298,1442. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,31-8,11 (m, 2Н, ароматический H), 7,26 (d, J=2,3 Гц, 2Н, ароматический H), 7,13-6,92 (m, 4Н, ароматический H), 2,57-2,50 (m, 1Н, циклогексил H), 2,09-1,67 (m, 5Н, циклогексил H), 1,59-1,18 (m, 5Н, циклогексил H). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 163,89, 152,61, 145,58, 142,57, 128,66, 126,04, 120,49, 116,99, 44,14, 34,72, 26,99, 26,23.

2-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)-5-нитропиридин, I3-nG

В соответствии с процедурой А, 2-хлор-5-нитропиридин (300 мг, 1,89 ммоль, 1,00 экв.) и 4-адамантилфенол (546 мг, 2,39 ммоль, 1,26 экв.) растворяли в ДМСО (6 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (662 мг 4,79 ммоль 2,53 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 42 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении от 1:100 до 1:50) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (664 мг, 1,89 ммоль, количественный выход). R_f=0,36 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₂₁H₂₃N₂O₃⁺ [М+Н]⁺ 351,1703, обнаружено: 351,1701. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 9,06 (d, J=2,8 Гц, 1H, ароматический H), 8,45 (dd, J=9,1, 2,8 Гц, 1H, ароматический H), 7,52-7,39 (m, 2Н, ароматический H), 7,16-7,06 (m, 2Н, ароматический H), 7,00 (d, J=9,1 Гц, 1Н, ароматический H), 2,13-2,10 (m, 3Н, адамантил H), 1,94 (d, J=3,0 Гц, 5Н, адамантил H), 1,87-1,70 (m, 5Н, адамантил H). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 167,19, 150,51, 149,18, 145,20, 140,26, 134,89, 126,53, 120,83, 111,32, 43,35, 36,82, 36,18, 29,02.

2-(3-(трет-бутил)фенокси)-5-нитропиридин, I3-nH

В соответствии с процедурой А, 2-хлор-5-нитропиридин (300 мг, 1,89 ммоль, 1,00 экв.) и 3-трет-бутилфенол (358 мг, 2,38 ммоль, 1,26 экв.) растворяли в ДМСО (6 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (420 мг, 3,04 ммоль, 1,60 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 70 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:100) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (512 мг, 1,88 ммоль, выход 99%). R_f=0,37 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₅H₁₇N₂O₃⁺ [М+Н]⁺ 273,1234, обнаружено: 273,1232. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 9,08-9,04 (m, 2Н, ароматический H), 8,47 (dd, J=9,1, 2,8 Гц, 1Н, ароматический H), 7,39 (t, J=7,9 Гц, 1Н, ароматический H), 7,33 (ddd, J=7,9, 1,8, 1,2 Гц, 1Н, ароматический H), 7,17 (t, J=2,1 Гц, 1Н, ароматический H), 7,01 (dd, J=9,1, 0,5 Гц, 1Н, ароматический H), 6,98 (ddd, J=7,9, 2,4, 1,2 Гц, 1H, ароматический H), 1,34 (s, 9Н, C(CH₃)₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 167,21, 153,88, 152,76, 145,26, 140,31, 134,93, 129,50, 123,17, 118,62, 118,47, 111,28, 35,02, 31,36.

1-(4-(трет-бутил)фенокси)-2-фтор-4-нитробензол, I3-nI

В соответствии с процедурой А, 3,4-дифторнитробензол (401 мг, 2,52 ммоль, 1,00 экв.) и 4-трет-бутилфенол (477 мг, 3,18 ммоль, 1,26 экв.) растворяли в ДМСО (6 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (522 мг 3,78 ммоль 1,50 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 19 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:50) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного масла (722 мг, 2,52 ммоль, выход 99%). R_f=0,54 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₆H₁₇FNO₃⁺ [М+Н]⁺ 290,1187, обнаружено: 290,1194. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,07 (dd, J=10,3, 2,7 Гц, 1H, ароматический H), 7,96 (ddd, J=9,1, 2,7, 1,5 Гц, 1H, ароматический H), 7,49-7,38 (m, 2Н, ароматический H), 7,09-6,99 (m, 2Н, ароматический H), 6,96 (dd, J=9,1, 8,0 Гц, 1H, ароматический H), 1,35 (s, 9Н, C(CH₃)₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 153,35, 152,23, 151,93, 151,82, 150,84, 148,70, 142,40, 142,33, 127,29, 120,68, 120,64, 119,38, 117,73, 117,71, 113,28, 113,05, 34,65, 31,54.

1-(4-циклогексилфенокси)-2-фтор-4-нитробензол, I3-nJ

В соответствии с процедурой А, 3,4-дифторнитробензол (509 мг, 3,20 ммоль, 1,00 экв.) и 4-циклогексилфенол (691 мг, 3,93 ммоль, 1,23 экв.) растворяли в ДМСО (6 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (664 мг 4,81 ммоль 1,50 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 23 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:50) с получением соединения, указанного в названии, в виде бледно-желтого твердого вещества (1002 мг, 3,18 ммоль, выход 99%). R_f=0,51 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₈H₁₉FNO₃⁺ [М+Н]⁺ 316,1343, обнаружено: 316,1348. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,09 (dd, J=10,3, 2,7 Гц, 1Н, ароматический Η), 7,97 (ddd, J=9,1, 2,7, 1,4 Гц, 1H, ароматический Η), 7,33-7,22 (m, 2H, ароматический Η), 7,08-6,99 (m, 2H, ароматический Η), 6,96 (dd, J=9,1, 8,0 Гц, 1H, ароматический Η), 2,58-251 (m, 1H, циклогексил Η), 1,98-1,73 (m, 5H, циклогексил Η), 1,52-1,20 (m, 5H, циклогексил Η). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 153,35, 152,51, 152,01, 151,90, 150,84, 145,68, 142,39, 142,32, 128,67, 120,70, 120,66, 119,73, 117,70, 117,68, 113,30, 113,08, 44,09, 34,69, 26,97, 26,21.

2-фтор-4-нитро-1-(4-(трет-пентил)фенокси)бензол, I3-nK

В соответствии с процедурой А, 3,4-дифторнитробензол (502 мг, 3,16 ммоль, 1,00 экв.) и 4-трет-пентилфенол (693 мг, 4,22 ммоль, 1,34 экв.) растворяли в ДМСО (6 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (656 мг 4,75 ммоль, 1,50 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 22 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:50) с получением соединения, указанного в названии, в виде бледно-желтого масла (943 мг, 3,11 ммоль, выход 99%). R_f=0,61 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₇H₁₉NO₃⁺ [М+Н]⁺ 304,1343, обнаружено: 304,1332. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,08 (dd, J=10,3, 2,7 Гц, 1H, ароматический Η), 7,96 (ddd, J=9,1, 2,7, 1,5 Гц, 1H, ароматический H), 7,42-7,35 (m, 2Η, ароматический H), 7,07-6,99 (m, 2Н, ароматический H), 6,95 (dd, J=9,1, 8,0 Гц, 1Н, ароматический H), 1,66 (q, J=7,4 Гц, 2Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃), 1,31 (s, 6Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃), 0,71 (t, J=7,4 Гц, 3Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 153,40, 152,19, 151,98, 151,87, 150,88, 147,11, 127,97, 120,71, 120,68, 119,34, 117,73, 117,71, 113,11, 37,92, 37,08, 28,64.

2-(4-(2-метилпентан-2-ил)фенокси)-5-нитропиридин, I3-nL

В соответствии с процедурой А, 4-(2-метилпентан-2-ил)фенол (52 мг, 0,29 ммоль, 1,00 экв.) и 2-хлор-5-нитропиридин (57 мг, 0,36 ммоль, 1,23 экв.) растворяли в ДМСО (6 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (66 мг, 0,48 ммоль, 1,65 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 27 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:50) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (86 мг, 0,29 ммоль, выход 98%). R_f=0,50 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:10). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₇H₂₁N₂O₃⁺ [М+Н]⁺ 301,1547, обнаружено: 301,1545. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 9,07 (d, J=2,7 Гц, 1H, ароматический H), 8,46 (dd, J=9,1, 2,8 Гц, 1H, ароматический H), 7,45-7,35 (m, 2Н, ароматический H), 7,14-7,05 (m, 2Н, ароматический H), 6,99 (dd, J=9,0, 0,6 Гц, 1Н, ароматический H), 1,65-1,54 (m, 2Н, C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃), 1,32 (s, 6Н, C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃), 1,19-1,05 (m, 2Н, C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃), 0,84 (t, J=7,3 Гц, 3Н, C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 167,17, 150,43, 147,69, 145,21, 140,26, 134,90, 127,44, 120,72, 111,29, 47,27, 37,74, 29,07, 18,08, 14,87.

(3r,5r,7r)-1-(4-(4-нитрофенокси)фенил)адамантан, I3-nM

В соответствии с процедурой А, 4-фторнитробензол (303 мг, 2,15 ммоль, 1,00 экв.) и 4-адамантилфенол (600 мг, 2,63 ммоль, 1,22 экв.) растворяли в ДМСО (6 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (450 мг, 3,26 ммоль, 1,52 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении от 1:100 до 1:50) с получением соединения, указанного в названии, в виде бледно-желтого твердого вещества (736 мг, 2,11 ммоль, выход 98%). R_f=0,73 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:10). HRMS (ESI): рассчитано для C₂₂H₂₄NO₃⁺ [М+Н]⁺ 350,1751, обнаружено: 350,1760. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,27 8,10 (m, 2Н, ароматический H), 7,46-7,35 (m, 2Н, ароматический H), 7,08-6,95 (m, 4Н, ароматический H), 2,13-2,10 (m, 3Н, адамантил H), 1,93 (d, J=2,9 Гц, 6Н, адамантил H), 1,88-1,70 (m, 6Н, адамантил H). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 163,85, 152,30, 148,86, 142,53, 126,86, 126,85, 126,03, 120,18, 117,00, 43,40, 36,82, 36,17, 29,03.

(3r,5r,7r)-1-(4-(2-фтор-4-нитрофенокси)фенил)адамантан, I3-nN

В соответствии с процедурой А, 3,4-дифторнитробензол (303 мг, 1,90 ммоль, 1,00 экв.) и 4-адамантилфенол (533 мг, 2,34 ммоль, 1,23 экв.) растворяли в ДМСО (6 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (395 мг, 2,86 ммоль, 1,50 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:100) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (703 мг, 1,91 ммоль, количественный выход). R_f=0,69 (ETOAc/РЕ в соотношении 1:10). HRMS (APPI): рассчитано для C₂₂H₂₂FNO⁺ [М]⁺ 367,1584, обнаружено: 367,1581. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,08 (dd, J=10,3, 2,7 Гц, 1H, ароматический H), 7,96 (ddd, J=9,1, 2,7, 1,5 Гц, 1Н, ароматический H), 7,46-7,36 (m, 2Н, ароматический H), 7,06-7,00 (m, 2Н, ароматический H), 6,95 (dd, J=9,1, 8,0 Гц, 1Н, ароматический H), 2,17-2,07 (m, 3Н, адамантил H), 1,92 (d, J=2,9 Гц, 5Н, адамантил H), 1,87-1,71 (m, 5Н, адамантил H). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 153,36, 153,35, 152,24, 152,21, 151,99, 151,88, 150,85, 150,83, 148,98, 126,89, 120,70, 120,66, 119,44, 119,42, 117,72, 117,70, 113,30, 113,07, 43,38, 36,81, 36,17, 29,02.

2-(4-изопропилфенокси)-5-нитпропиридин, I3-nO

В соответствии с процедурой А, 2-хлор-5-нитропиридин (303 мг, 1,91 ммоль, 1,00 экв.) и 4-изопропилфенол (331 мг, 2,43 ммоль, 1,27 экв.) растворяли в ДМФА (6,0 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (398 мг 2,88 ммоль 1,51 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. После экстракции Et₂O неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:100) с получением соединения, указанного в названии, в виде бледно-желтого твердого вещества (490 мг, 1,90 ммоль, выход 99%). R_f=0,40 (EtOAc/РЕ в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₄H₁₅N₂O₃⁺ [M+H]⁺ 259,1077, обнаружено: 259,1072. ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 9,04 (d, J=3,4 Гц, 1Н, ароматический Η), 8,44 (dd, J=9,1, 2,8 Гц, 1H, ароматический Η), 7,37-7,28 (m, 2Н, ароматический Η), 7,12-7,06 (m, 2Н, ароматический Η), 7,03-6,97 (m, 1Н, ароматический H), 2,96 (hept, J=6,9 Гц, 1H, CH(CH₃)₂), 1,30 (d, J=7,0 Гц, 6Н, CH(CH₃)₂). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 167,08, 150,67, 146,49, 145,02, 140,18, 134,81, 127,84, 121,11, 111,24, 33,62, 24,03.

5-нитро-2-(4-(2,4,4-триметилпентан-2-ил)фенокси)пиридин, I3-nP

В соответствии с процедурой А, 2-хлор-5-нитропиридин (303 мг, 1,91 ммоль, 1,00 экв.) и 4-трет-октилфенол (495 мг, 2,40 ммоль, 1,25 экв.) растворяли в ДМСО (5 мл). Добавляли безводный K₂CO₃ (426 мг, 3,08 ммоль 1,61 экв.) и реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 28 часов. После экстракции Et20 неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:50) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (598 мг, 1,82 ммоль, выход 95%). R_f=0,65 (EtOAc/PE в соотношении 1:10). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₉H₂₅N₂O₃⁺ [М+Н]⁺ 329,1860, обнаружено: 329,1854. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 9,07 (d, J=2,8 Гц, 1H, ароматический H), 8,45 (dd, J=9,1, 2,8 Гц, 1H, ароматический H), 7,52-7,40 (m, 2Η, ароматический H), 7,14-7,03 (m, 2Н, ароматический H), 6,97 (d, J=9,1 Гц, 1H, ароматический H), 1,76 (s, 2Η, Ar-C(CH₃)₂CH₂C(CH₃)₃), 1,40 (s, 6Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂C(CH₃)₃), 0,75 (s, 9Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂C(CH₃)₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 167,24, 150,49, 148,12, 145,30, 140,29, 134,92, 127,78, 120,57, 111,15, 57,28, 38,63, 32,55, 31,93, 31,62.

Общая процедура В:

Соответствующие нитропроизводные (I3-n, I3-nA-I3-nP) сначала растворяли в MeOH или толуоле, или напрямую добавляли к суспензии каталитических количеств Pd (10%) на порошковом активированном угле в MeOH. Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до полного превращения. Затем реакционную смесь фильтровали через Целит. Растворитель удаляли при пониженном давлении при 30°C и неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии с получением соответствующих соединений, указанных в названии (I3, I3-A-I3-P).

6-(4-(трет-бутил)фенокси)пиридин-3-амин, I3

В соответствии с процедурой В, соединение I3-n (300 мг, 1,10 ммоль, 1,00 экв.) добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (82 мг, 0,08 ммоль Pd, 0,07 экв.) в MeOH (15 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ/MeOH 1%) с получением соединения, указанного в названии, в виде бледно-бежевого твердого вещества (250 мг, 1,03 ммоль, выход 94%). R_f=0,40 (ДХМ/MeOH 4%). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₅H₁₉N₂O⁺ [М+Н]⁺ 243,1492, обнаружено: 243,1487. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,69 (d, J=3,0 Гц, 1H, ароматический H), 7,39-7,31 (m, 2Н, ароматический H), 7,03 (dd, J=8,6, 3,0 Гц, 1H, ароматический H), 7,00-6,93 (m, 2Η, ароматический H), 6,72 (d, J=8,6 Гц, 1Н, ароматический H), 3,48 (s, 1H, CH₂), 1,31 (s, 9Н, C(CH₃)₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,62, 153,28, 146,33, 138,82, 134,06, 126,86, 126,47, 119,24, 112,36, 34,33, 31,52.

6-(4-циклогексилфенокси)пиридин-3-амин, Ι3-Α

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nA (201 мг, 0,67 ммоль, 1,00 экв.) добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (47 мг, 0,04 ммоль Pd, 0,07 экв.) в MeOH (15 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ/MeOH 1%) с получением соединения, указанного в названии, в виде бежевого твердого вещества (190 мг, 0,71 ммоль, количественный выход). R_f=0,36 (ДХМ/MeOH 4%). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₇H₂₁N₂O⁺ [М+Н]⁺ 269,1648, обнаружено: 269,1643. ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,70 (d, J=2,9 Гц, 1Н, ароматический H), 7,22-7,13 (m, 2Н, ароматический H), 7,04 (dd, J=8,6, 3,0 Гц, 1Н, ароматический H), 7,01-6,92 (m, 2Н, ароматический H), 6,73 (dd, J=8,8, 0,7 Гц, 1H, ароматический H), 3,36 (s, 2Н, NH₂), 2,51-2,44 (m, 1Н, циклогексил H), 1,97-1,67 (m, 5Н, циклогексил H), 1,49-1,15 (m, 5Н, циклогексил H). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,88, 153,61, 143,47, 138,67, 134,21, 127,92, 126,96, 119,68, 112,38, 43,99, 34,68, 27,01, 26,25.

6-(4-(трет-пентил)фенокси)пиридин-3-амин, I3-B

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nB (200 мг, 0,70 ммоль, 1,00 экв.) добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (52 мг, 0,05 ммоль Pd, 0,07 экв.) в MeOH (15 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ/MeOH 0,5%) с получением соединения, указанного в названии, в виде бежевого твердого вещества (107 мг, 0,42 ммоль, выход 60%). R_f=0,41 (ДХМ/MeOH 4%). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₆H₂₁N₂O⁺ [М+Н]⁺ 257,1648, обнаружено: 257,1648. ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,73 (d, J=2,9 Гц, 1Н, ароматический H), 7,34-7,23 (m, 2H, ароматический H), 7,06 (dd, J=8,6, 3,0 Гц, 1H, ароматический H), 7,02-6,94 (m, 2H, ароматический H), 6,73 (d, J=8,6 Гц, 1H, ароматический H), 3,35 (s, 2H, NH₂), 1,62 (q, J=7,4 Гц, 2H, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃), 1,27 (s, 6H, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃), 0,70 (t, J=7,4 Гц, 3Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃). ¹³C ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,80, 153,36, 144,75, 138,72, 134,30, 127,19, 126,97, 119,13, 112,51, 37,63, 37,04, 28,64, 9,26.

4-(4-(трет-бутил)фенокси)анилин, I3-C

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nC (300 мг, 1,11 ммоль, 1,00 экв.) добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (59 мг, 0,06 ммоль Pd, 0,05 экв.) в MeOH (15 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3,5 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; этилацетат/петролейный эфир в соотношении от 1:100 до 1:10) с получением соединения, указанного в названии, в виде темно-желтого масла (244 мг, 1,01 ммоль, выход 91%). R_f=0,78 (ДХМ/MeOH 4%). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₆H₂₀NO⁺ [М+Н]⁺ 242,1539, обнаружено: 242,1530. ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,33-7,27 (m, 2Н, ароматический H), 6,91-6,84 (m, 4Н, ароматический H), 6,72-6,66 (m, 2Н, ароматический H), 3,49 (s, 2Н, NH₂), 1,31 (s, 9Н, C(CH₃)₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,55, 149,24, 145,05, 142,30, 126,45, 121,08, 116,90, 116,49, 34,33, 31,66.

6-(4-бутилфенокси)пиридин-3-амин, I3-D

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nD (170 мг, 0,62 ммоль, 1,00 экв.) добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (53 мг, 0,05 ммоль Pd, 0,08 экв.) в MeOH (15 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ/MeOH 1%) с получением соединения, указанного в названии, в виде коричневого масла (133 мг, 0,55 ммоль, выход 88%). R_f=0,38 (ДХМ/MeOH 4%). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₅H₁₉N₂O⁺ [М+Н]⁺ 243,1492, обнаружено: 243,1485. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,69 (d, J=3,1 Гц, 1H, ароматический H), 7,20-7,09 (m, 2Η, ароматический H), 7,03 (dd, J=8,6, 3,0 Гц, 1Н, ароматический H), 7,00-6,91 (m, 2Н, ароматический H), 6,72 (d, J=8,6 Гц, 1Н, ароматический H), 3,36 (s, 2Н, NH₂), 2,67-2,51 (m, 2Н, Ar-CH₂CH₂CH₂CH₃), 1,66-1,52 (m, 2H, Ar-Ch₂CH₂CH₂CH₃), 1,41-1,31 (m, 2Н, Ar-CH₂CH₂CH₂CH₃), 0,93 (t, J=7,3 Гц, 3Н, Ar-CH₂CH₂CH₂CH₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,83, 153,55, 138,75, 138,26, 134,12, 129,48, 126,90, 119,74, 112,28, 35,02, 33,74, 22,40, 14,02.

4-(4-(трет-пентил)фенокси)анилин, I3-E

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nE (313 мг, 1,10 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в MeOH (10 мл) и добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (52 мг, 0,05 ммоль Pd, 0,04 экв.) в MeOH (5 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Неочищенный продукт очищали путем фильтрации через тонкий слой SiO₂(ДХМ/MeOH 4%) с получением соединения, указанного в названии, в виде бежевого масла (293 мг, 1,15 ммоль, количественный выход). R_f=0,09 (EtOAc/PE в соотношении 1:20). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₇H₂₂N₂O⁺ [М+Н]⁺ 256,1696, обнаружено: 256,1692. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,29-7,19 (m, 2Н, ароматический H), 6,98-6,81 (m, 4Н, ароматический H), 6,76-6,61 (m, 2Н, ароматический H), 3,47 (s, 2Н, NH₂), 1,63 (q, J=7,4 Гц, 2Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃), 1,28 (s, 6Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃), 0,71 (t, J=7,4 Гц, 3Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,45, 149,08, 143,29, 142,55, 127,08, 121,04, 116,79, 116,33, 37,50, 37,06, 28,69, 9,27.

4-(4-циклогексилфенокси)анилин, I3-F

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nF (352 мг, 1,18 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в толуоле (5 мл) и добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (38 мг, 0,04 ммоль Pd, 0,03 экв.) в MeOH (10 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ) с получением соединения, указанного в названии, в виде бежевого твердого вещества (315 мг, 1,18 ммоль, количественный выход). R_f=0,86 (ДХМ/MeOH 4%). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₈H₂₂NO⁺ [М+Н]⁺ 268,1696, обнаружено: 268,1692. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,17-7,07 (m, 2Н, ароматический H), 6,94-6,82 (m, 4Н, ароматический Н), 6,72-6,62 (m, 2Н, ароматический Н), 3,49 (s, 2Н, NH₂), 2,51-2,44 (m, 1H, циклогексил Н), 1,98-1,68 (m, 5Н, циклогексил Н), 1,46-1,21 (m, 5Н, циклогексил Н). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,87, 149,13, 142,53, 142,05, 127,81, 121,02, 117,22, 116,33, 43,90, 34,79, 27,05, 26,27.

6-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)пиридин-3-амин, I3-G

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nG (278 мг, 0,79 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в толуоле (10 мл) и добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (56 мг, 0,05 ммоль Pd, 0,07 экв.) в MeOH (10 мл). Колбу продували H₂ (3х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ/MeOH от 0% до 1%) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (176 мг, 0,55 ммоль, выход 69%). R_f=0,43 (ДХМ/MeOH 4%). HRMS (ESI): рассчитано для C₂₁H₂₅N₂O⁺ [М+Н]⁺ 321,1961, обнаружено: 321,1959. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,71 (d, J=3,0 Гц, 1Н, ароматический H), 7,37-7,29 (m, 2H, ароматический Η), 7,08-6,96 (m, 3Н, ароматический H), 6,74 (d, J=8,6 Гц, 1H, ароматический H), 3,40 (s, 2H, NH₂), 2,12-2,09 (m, 3Н, адамантил H), 1,93 (dd, J=9,7, 3,0 Гц, 5H, адамантил H), 1,86-1,70 (m, 5Н, адамантил H). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,73, 153,37, 151,35, 146,65, 138,76, 134,15, 128,14, 126,86, 126,06, 125,54, 124,88, 119,29, 112,40, 43,36, 43,22, 36,87, 36,84, 35,87, 29,02.

6-(3-(трет-бутил)фенокси)пиридин-3-амин, I3-H

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nH (362 мг, 1,33 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в MeOH (10 мл) и добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (44 мг, 0,04 ммоль Pd, 0,03 экв.) в MeOH (5 мл). Колбу продували H₂ (5х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ/MeOH от 0% до 1%) с получением соединения, указанного в названии, в виде бледно-коричневого масла (303 мг, 1,25 ммоль, выход 94%). R_f=0,44 (ДХМ/MeOH 4%). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₅H₁₉N₂O⁺ [М+Н]⁺ 243,1492, обнаружено: 243,1493. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,92 (d, J=3,0 Гц, 1H, ароматический H), 7,48-7,40 (m, 1H, ароматический H), 7,32 (ddd, J=7,8, 1,9, 1,0 Гц, 1Н, ароматический H), 7,29-7,27 (m, 1Н, ароматический H), 7,24 (d, J=3,0 Гц, 1Н, ароматический H), 7,01 (ddd, J=8,0, 2,4, 1,0 Гц, 1Н, ароматический H), 6,92 (dd, J=8,6, 0,7 Гц, 1Н, ароматический H), 3,40 (s, 2Н, NH₂) 1,48 (s, 9Н, C(CH₃)₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,81, 155,65, 153,31, 138,69, 134,40, 129,10, 126,99, 120,85, 117,23, 116,69, 112,54, 34,89, 31,41.

4-(4-(трет-бутил)фенокси)-3-фторанилин, I3-I

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nI (501 мг, 1,73 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в MeOH (13 мл) и добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (56 мг, 0,05 ммоль Pd, 0,03 экв.) в MeOH (2 мл). Колбу продували H₂ (5х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (455 мг, 1,75 ммоль, количественный выход). R_f=0,76 (ДХМ/MeOH 1%). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₆H₁₉FNO⁺ [М+Н]⁺ 260,1445, обнаружено: 260,1442. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,37-7,29 (m, 2Н, ароматический H), 6,94 (t, J=8,8 Гц, 1H, ароматический H), 6,91-6,85 (m, 2Η, ароматический H), 6,52 (dd, J=12,0, 2,7 Гц, 1H, ароматический H), 6,42 (ddd, J=8,6, 2,7, 1,3 Гц, 1H, ароматический H), 3,61 (s, 2Н, NH₂), 1,33 (s, 9H, C(CH₃)₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,58, 156,44, 154,12, 145,02, 144,42, 144,33, 134,83, 134,71, 126,41, 123,92, 123,90, 115,43, 110,97, 110,93, 103,93, 103,72, 34,25, 31,59.

4-(4-циклогексилфенокси)-3-фторанилин, I3-J

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nJ (550 мг, 1,74 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в MeOH (12 мл) и добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (46 мг, 0,04 ммоль Pd, 0,03 экв.) в MeOH (3 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ/петролейный эфир в соотношении от 1:1 до 2:1) с получением соединения, указанного в названии, в виде бледно-розового твердого вещества (489 мг, 1,71 ммоль, выход 98%). R_f=0,81 (ДХМ/MeOH 4%). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₈H₂₁FNO⁺ [М+Н]⁺ 286,1602, обнаружено: 286,1613. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,19 ? 7,10 (m, 2Н, ароматический H), 6,93 (t, J=8,8 Гц, 1H, ароматический H), 6,90-6,83 (m, 2Η, ароматический H), 6,51 (dd, J=12,1, 2,7 Гц, 1Н, ароматический H), 6,41 (ddd, J=8,6, 2,7, 1,2 Гц, 1Н, ароматический H), 3,66 (s, 2Н, NH₂), 2,52-2,45 (m, 1Н, циклогексил H), 1,96-1,72 (m, 5Н, циклогексил H), 1,53-1,18 (m, 5Н, циклогексил H). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,74, 156,55, 154,09, 144,39, 144,30, 142,04, 134,86, 134,74, 127,79, 123,89, 115,76, 110,93, 110,90, 103,90, 103,69, 43,80, 34,72, 26,99, 26,22.

3-фтор-4-(4-(трет-пентил)фенокси)анилин, I3-K

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nK (497 мг, 1,64 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в MeOH (13 мл) и добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (28 мг, 0,03 ммоль Pd, 0,02 экв.) в MeOH (2 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; этилацетат/петролейный эфир в соотношении от 1:10 до 1:7,5) с получением соединения, указанного в названии, в виде оранжевого масла (463 мг, 1,69 ммоль, количественный выход). R_f=0,28 (EtOAc/петролейный эфир в соотношении 1:5). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₇H₂₁FNO⁺ [М+Н]⁺ 274,1602, обнаружено: 274,1599. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,26-7,17 (m, 2Н, ароматический H), 6,92 (t, J=8,8 Гц, 1H, ароматический H), 6,89-6,80 (m, 2Н, ароматический H), 6,51 (dd, J=12,0, 2,7 Гц, 1Н, ароматический H), 6,42 (ddd, J=8,7, 2,7, 1,2 Гц, 1Н, ароматический H), 3,65 (s, 2Н, NH₂), 1,61 (q, J=7,4 Гц, 2Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃), 1,26 (s, 6Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃), 0,69 (t, J=7,4 Гц, 3Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂CH₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,61, 156,37, 154,15, 144,34, 144,25, 143,34, 134,98, 134,86, 123,95, 123,92, 115,41, 110,98, 110,95, 104,00, 103,78, 37,07, 28,68, 9,26.

6-(4-(2-метилпентан-2-ил)фенокси)пиридин-3-амин, I3-L

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nL (50 мг, 0,17 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в MeOH (12 мл) и добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (31 мг, 0,03 ммоль Pd, 0,17 экв.) в MeOH (3 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ/MeOH 1%) с получением соединения, указанного в названии, в виде бледно-оранжевого масла (39 мг, 0,14 ммоль, выход 87%). R_f=0,41 (ДХМ/MeOH 4%). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₇H₂₃N₂O⁺ [М+Н]⁺ 271,1805, обнаружено: 271,1796. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,73 (d, J=2,9 Гц, 1H, ароматический H), 7,32-7,26 (m, 2Η, ароматический H), 7,07 (dd, J=8,6, 3,0 Гц, 1H, ароматический H), 7,01-6,94 (m, 2Н, ароматический H), 6,74 (d, J=8,6 Гц, 1H, ароматический H), 3,35 (s, 2Н, NH₂), 1,61-1,51 (m, 2H, C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃), 1,27 (s, 6Н, C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃), 1,16-1,01 (m, 2Н, C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃), 0,82 (t, J=7,3 Гц, 3Н, C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,82, 153,32, 145,10, 138,67, 134,32, 128,12, 127,09, 126,99, 119,62, 119,13, 112,53, 47,31, 37,49, 29,17, 18,08, 14,90.

4-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)анилин, I3-M

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nM (615 мг, 1,76 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в толуоле (15 мл) и добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (126 мг, 0,12 ммоль Pd, 0,07 экв.) в MeOH (10 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 19 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ) с получением соединения, указанного в названии, в виде бежевого твердого вещества (538 мг, 1,68 ммоль, выход 96%). R_f=0,39 (ДХМ/MeOH 1%). HRMS (ESI): рассчитано для C₂₂H₂₆NO⁺ [М+Н]⁺ 320,2009, обнаружено: 320,2006. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,32-7,25 (m, 2Н, ароматический H), 6,93-6,86 (m, 4Н, ароматический H), 6,72-6,65 (m, 2Н, ароматический H), 3,56 (s, 2Н, NH₂), 2,14-2,06 (m, 3Н, адамантил H), 1,90 (d, J=2,9 Гц, 5Н, адамантил H), 1,84-1,71 (m, 5Н, адамантил H). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,59, 149,02, 145,32, 142,51, 125,98, 121,10, 116,84, 116,34, 43,45, 36,88, 35,78, 29,07.

4-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)-3-фторанилин, I3-N

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nN (570 мг, 1,55 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в толуоле (10 мл) и добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (143 мг, 0,13 ммоль Pd, 0,09 экв.) в MeOH (10 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 7 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (510 мг, 1,51 ммоль, выход 97%). R_f=0,67 (ДХМ/MeOH 1%). HRMS (ESI): рассчитано для C₂₂H₂₅FNO⁺ [М+Н]⁺ 338,1915, обнаружено: 338,1916. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,32-7,23 (m, 2Н, ароматический H), 6,92 (t, J=8,8 Гц, 1Н, ароматический H), 6,89-6,81 (m, 2Н, ароматический H), 6,51 (dd, J=12,0, 2,7 Гц, 1Н, ароматический H), 6,41 (ddd, J=8,7, 2,7, 1,2 Гц, 1Н, ароматический H), 3,64 (s, 2Н, NH₂), 2,11-2,07 (m, 3Н, адамантил H), 1,89 (d, J=2,9 Гц, 5Н, адамантил H), 1,83-1,70 (m, 5Н, адамантил H). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,60, 156,47, 154,15, 145,37, 144,33, 144,24, 134,91, 134,79, 125,98, 123,97, 123,95, 115,47, 110,98, 110,95, 103,98, 103,76, 43,43, 36,86, 35,76, 29,06.

6-(4-изопропилфенокси)пиридин-3-амин, I3-O

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nO (202 мг, 0,78 ммоль, 1,00 экв.) добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (76 мг, 0,07 ммоль Pd, 0,09 экв.) в MeOH (15 мл). Колбу продували H₂ (6х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ/MeOH 1%) с получением соединения, указанного в названии, в виде бежевого твердого вещества (150 мг, 0,66 ммоль, выход 84%). R_f=0,42 (ДХМ/MeOH 4%). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₄H₁₇N₂O⁺ [М+Н]⁺ 229,1335, обнаружено: 229,1326. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,70 (d, J=2,9 Гц, 1Н, ароматический H), 7,24-7,14 (m, 2Н, ароматический H), 7,05 (dd, J=8,6, 3,0 Гц, 1H, ароматический H), 7,01-6,93 (m, 2Н, ароматический H), 6,73 (d, J=8,6 Гц, 1Н, ароматический H), 3,33 (s, 2Н, NH₂), 2,89 (hept, J=6,9 Гц, 1Н, CH(СН₃)₂), 1,24 (d, J=7,0 Гц, 6H, CH(CH₃)₂). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,88, 153,59, 144,19, 138,68, 134,19, 127,55, 126,97, 119,76, 112,35, 77,48, 77,16, 76,84, 33,57, 24,20.

6-(4-(2,4,4-триметилпентан-2-ил)фенокси)пиридин-3-амин, Ι3-P

В соответствии с процедурой В, соединение I3-nP (283 мг, 0,86 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в толуоле (4 мл) и добавляли к суспензии Pd (10%) на порошковом активированном угле (78 мг, 0,07 ммоль Pd, 0,09 экв.) в MeOH (15 мл). Колбу продували H₂ (5х) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Неочищенный продукт очищали путем колоночной флэш-хроматографии (SiO₂; ДХМ/MeOH 2%) с получением соединения, указанного в названии, в виде бесцветного твердого вещества (235 мг, 0,79 ммоль, выход 91%). R_f=0,49 (ДХМ/MeOH 4%). HRMS (ESI): рассчитано для C₁₉H₂₇N₂O⁺ [М+Н]⁺ 299,2118, обнаружено: 299,2112. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,73 (dd, J=3,0, 0,7 Гц, 1H, ароматический H), 7,37-7,29 (m, 2H, ароматический H), 7,06 (dd, J=8,6, 3,0 Гц, 1H, ароматический H), 6,99-6,93 (m, 2H, ароматический H), 6,71 (dd, J=8,6, 0,7 Гц, 1Н, ароматический H), 3,10 (s, 2Н, NH₂), 1,72 (s, 2Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂C(CH₃)₃), 1,36 (s, 6Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂C(CH₃)₃), 0,73 (s, 9Н, Ar-C(CH₃)₂CH₂C(CH₃)₃). ¹³С ЯМР (101 МГц, CDCl₃) δ 156,87, 153,39, 145,48, 138,70, 134,39, 127,37, 126,94, 118,96, 112,41, 57,20, 38,36, 32,50, 31,93, 31,68.

Иллюстрации к изобретению RU 2 631 611 C2

Реферат патента 2017 года ИНГИБИТОРЫ ПУТИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА NOTCH И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАКА

Группа изобретений относится к онкологии, фармакологии и химиотерапии. Предложено применение ингибиторов пути передачи сигнала Notch, выбранных из группы, состоящей из 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3), или некоторых его производных, при лечении и/или предотвращении зависимых от Notch раковых опухолей, фармацевтическая композиция и набор того же назначения, применение 6-(4-трет-бутилфенокси)пиридин-3-амина (I3) или некоторых его производных для ингибирования передачи сигнала Notch в клетках in vitro, in vivo (вариант), способ лечения субъекта от зависимого от Notch рака и способ лечения заболевания, связанного с повышенной активностью пути передачи сигнала Notch. Технический результат состоит в реализации заявленных назначений. 7 н. и 12 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл.

Формула изобретения RU 2 631 611 C2

1. Применение соединения, обладающего ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, имеющего формулу:

где m представляет собой целое число, выбранное из 1-4;

W выбран из Н и галогенов; указанный галоген выбран из F-, Cl-, Br- или I-;

R¹, R², R³, R⁴ каждый независимо выбран из группы, состоящей из Н, изопропила, трет-бутила, (СН₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 0-15;

X представляет собой О, NR⁷, где R⁷ представляет собой Н;

Y представляет собой N или СН;

Z представляет собой NR¹⁰R¹¹, где R¹⁰ и R¹¹ представляют собой Н,

или одного из их солей, сольватов, таутомеров или стереоизомеров;

или

где m представляет собой целое число, выбранное из 1-4;

W выбран из Н и галогенов; указанный галоген выбран из F-, Cl-, Br- или I-;

R⁴ и R¹⁵ каждый независимо выбран из группы, состоящей из Н, трет-бутила, (СН₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

X представляет собой О, NR⁷, где R⁷ представляет собой Н;

Y представляет собой N или СН;

Z представляет собой NR¹⁰R¹¹, где R¹⁰ и R¹¹ представляют собой Н,

или одного из их солей, сольватов, таутомеров или стереоизомеров;

или

где m представляет собой целое число, выбранное из 1-4;

W выбран из Н и галогенов; указанный галоген выбран из F-, Cl-, Br- или I-;

R⁴ независимо выбран из группы, состоящей из Н, изопропила, трет-бутила, (СН₂)_nCH₃; нижний индекс n представляет собой целое число, независимо выбранное из 1-15;

X представляет собой О, NR⁷, где R⁷ представляет собой Н;

Y представляет собой N или СН;

Z представляет собой NR¹⁰R¹¹, где R¹⁰ и R¹¹ представляют собой Н,

или одного из их солей, сольватов, таутомеров или стереоизомеров

для лечения и/или предотвращения зависимого от Notch рака.

2. Применение по п.1, где указанное соединение, обладающее ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, выбрано из группы, состоящей из следующих соединений:

6-(4-Трет-бутилфенокси)пиридин-3-амин (I3) формулы I,

4-(4-циклогексилфенокси)анилина формулы IIIa,

6-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)пиридин-3-амина формулы IVa,

6-(3-(трет-бутил)фенокси)пиридин-3-амина формулы IIe,

4-(4-(трет-бутил)фенокси)-3-фторанилина формулы IIf,

6-(4-(трет-пентил)фенокси)пиридин-3-амина формулы IIg,

6-(4-бутилфенокси)пиридин-3-амина формулы IIh,

3-фтор-4-(4-(трет-пентил)фенокси)анилина формулы IIi,

4-(4-циклогексилфенокси)-3-фторанилина формулы IIIb,

4-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)анилина формулы IVb,

6-(4-циклогексилфенокси)пиридин-3-амина формулы IIIc,

или одного из их солей, сольватов, таутомеров или стереоизомеров.

3. Применение по любому из пп.1 или 2, отличающееся тем, что зависимый от Notch рак выбран из группы, включающей Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз (T-ALL), хронический миелоидный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), лимфому из клеток мантийной зоны, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, меланому, опухоли головного мозга, ангиогенез опухоли и рак толстой и прямой кишки.

4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что зависимый от Notch рак резистентен к лечению ингибиторами γ-секретазы.

5. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующими свойствами в отношении пути передачи сигнала Notch, содержащая соединение по любому из пп.1-4 или его фармацевтически приемлемые соли, сольваты, таутомеры, стереоизомеры, и фармацевтически приемлемый носитель.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, где указанное соединение, содержащееся в указанной фармацевтической композиции, выбрано из группы, состоящей из:

4-(4-циклогексилфенокси)анилина формулы IIIa,

6-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)пиридин-3-амина формулы IVa,

6-(3-(трет-бутил)фенокси)пиридин-3-амина формулы IIe,

4-(4-(трет-бутил)фенокси)-3-фторанилина формулы IIf,

6-(4-(трет-пентил)фенокси)пиридин-3-амина формулы IIg,

6-(4-бутилфенокси)пиридин-3-амина формулы IIh,

3-фтор-4-(4-(трет-пентил)фенокси)анилина формулы IIi,

4-(4-циклогексилфенокси)-3-фторанилина формулы IIIb,

4-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)анилина формулы IVb,

6-(4-циклогексилфенокси)пиридин-3-амина формулы IIIc,

или одного из их солей, сольватов, таутомеров или стереоизомеров.

7. Фармацевтическая композиция по п.5, где указанное соединение, содержащееся в указанной фармацевтической композиции, выбрано из группы, состоящей из:

6-(4-((3r,5r,7r)-адамантан-1-ил)фенокси)пиридин-3-амина формулы IVa,

6-(4-бутилфенокси)пиридин-3-амина формулы IIh,

4-(4-циклогексилфенокси)-3-фторанилина формулы IIIb,

6-(4-циклогексилфенокси)пиридин-3-амина формулы IIIc,

или одного из их солей, сольватов, таутомеров или стереоизомеров.

8. Набор для лечения и/или предотвращения зависимого от Notch рака, содержащий одну или более доз соединения по любому из пп.1-4 и инструкции по применению.

9. Набор по п.8, дополнительно содержащий одну или более доз химиотерапевтического агента.

10. Применение соединения по любому из пп.1-4 для ингибирования пути передачи сигнала Notch в клетках in vitro.

11. Применение по п. 10, отличающееся тем, что указанные клетки представляют собой раковые клетки.

12. Применение соединения по любому из пп.1-4 для ингибирования пути передачи сигнала Notch в клетках in vivo.

13. Применение по п.12, отличающееся тем, что указанные клетки представляют собой раковые клетки.

14. Способ лечения субъекта от зависимого от Notch рака, включающий

i) определение в раковых клетках, полученных из биологического образца от указанного субъекта, является ли рак зависимым от пути передачи сигнала Notch,

ii) и лечение указанного субъекта исходя из того, является ли указанный рак зависимым от Notch раком, путем введения терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-4 или фармацевтической композиции по любому из пп.5-7.

15. Способ лечения по п.14, отличающийся тем, что зависимость от пути передачи сигнала Notch в раковых клетках определяют путем анализа активности комплекса γ-секретазы in vitro.

16. Способ лечения по п.14 или п.15, дополнительно включающий применение по меньшей мере одного традиционного средства лечения рака.

17. Способ лечения по п.16, отличающийся тем, что указанное традиционное средство лечения рака применяют перед, одновременно или после введения терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-4 или фармацевтической композиции по п.7.

18. Способ лечения по п.16 или п.17, отличающийся тем, что указанное традиционное средство лечения рака заключается в лучевой терапии и/или химиотерапии.

19. Способ лечения заболевания, связанного с повышенной активностью пути передачи сигнала Notch, включающий введение соединения по любому из пп.1-4 или фармацевтической композиции по любому из пп.5-7 нуждающемуся в этом субъекту.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2017 года RU2631611C2

Приспособление для суммирования отрезков прямых линий	1923	Иванцов Г.П.	SU2010A1
HSIAO S-H
et al
Electroactive aromatic polyamides and polyimides with adamantylphenoxy-substituted triphenylamine units
Колосоуборка	1923	Беляков И.Д.	SU2009A1
ПРОИЗВОДНЫЕ МОЧЕВИНЫ (ВАРИАНТЫ), ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, СВЯЗАННОГО С РОСТОМ РАКОВЫХ КЛЕТОК (ВАРИАНТЫ)	2000	Вуд Джил Э. Дюма Жак Кайре Юдэй Лоуингер Тимоти Б. Моунэйхэн Мэри-Кэтрин Нэйтиро Рейна Реник Джоуэл Ридль Бернд Сибли Роберт Н. Скотт Уильям Дж. Смит Роджер Э.	RU2319693C9
SARMENTO LM et al
Therapeutic potential of Norch inhibition in T-cell acute lymphoblastic leukemia: rationale caveats and promises
Expert Rewv.Anticancer Ther
Способ приготовления лака	1924	Петров Г.С.	SU2011A1
JP 2001089412 A, 03.04.2001
Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п.	1921	Богач Б.И.	SU3A1
ЛЕЧЕНИЕ АДЕНОМЫ И/ИЛИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ КИШЕЧНИКА С ПОМОЩЬЮ ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВАЦИИ ПУТИ NOTCH	2005	Клеверс Йоханнес Каролус Ван Гейн Мария Элизабет Ван Эс Йоханнес Хендрикус	RU2392961C2

RU 2 631 611 C2

Авторы

Радтке Фредди

Лехал Райвиндер

Рейнмюллер Виктория

Чжу Джипин

Даты

2017-09-25—Публикация

2012-12-21—Подача

название	год	авторы	номер документа
ПРОИЗВОДНЫЕ ПИРИДОПИРИМИДИНОНА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КАЧЕСТВЕ МОДУЛЯТОРОВ РЕЦЕПТОРА АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ	2021	Сон, Минсу Пак, Ка Юн Кан, Чихи Ли, Ынхе Пак, Юджин Чхве, Юджон Ким, Сун-Хён Ко, Ын Пи Пэ, Сери Пак, Чон-Сан Чха, Тэвон Ли, Вонхён Чу, Мин Сон Юн, Тэён Тох, Хёнмие Сон, Хён Чон Ли, По Рён Ким, Юнджон	RU2818954C1
НОВЫЕ АНТИИНВАЗИВНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ	2013	Ру Пьер Маюто Флоренс Нажман Ромен Гадеа Жиль Тази Жамаль Шеррер Дидье Брок Карстен Каюзак Натали	RU2641650C2
Ингибитор CDK4/6	2017	Сюй Чжаобин Ху Лихун Дин Чарльз З. Чэнь Шухуэй	RU2747311C2
МОДУЛЯТОРЫ АКТИВНОСТИ НЕС1 И СПОСОБЫ ДЛЯ НИХ	2011	Лау Джонсон Хуан Цзяннь-Дзих	RU2576036C2
ДИСПИРОИНДОЛИНОНЫ НА ОСНОВЕ РОДАНИНОВ КАК ИНГИБИТОРЫ Р53-MDM2 БЕЛОК-БЕЛКОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ	2019	Белоглазкина Анастасия Александровна Мажуга Александр Георгиевич Белоглазкина Елена Кимовна Мефедова София Романовна Карпов Никита Александрович	RU2730286C1
Новые производные пиразола	2022	Ли Су Джин Мун Сун Хван Бан Сухо Ли Ынсиль Син Ын Чжон Го Ю-Кён	RU2816835C1
БИЦИКЛИЧЕСКИЕ АГОНИСТЫ СТИМУЛЯТОРА ГЕНОВ ИНТЕРФЕРОНА STING	2020	Петрасси, Хэнк Майкл Джеймс Юй, Чэниан Ван, Цзе Чаттерджи, Арнаб К. Шульц, Питер Дж. Джонсон, Кристен Чу, Алан Чин, Эмили Лэйрсон, Люк Л.	RU2800072C1
ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ И ИХ КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО	2012	Дороски Мэттью Дэвид Мадерна Андреас О'Доннелл Кристофер Джон Субраманьям Чакрапани Ветелино Бет Купер Душин Рассел Джордж Строп Павел Грациани Эдмунд Идрис	RU2586885C2
АРИЛ- И ГЕТЕРОАРИЛЗАМЕЩЕННЫЕ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ ПРОИЗВОДНЫЕ МОЧЕВИНЫ, СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ КИНАЗЫ RAF И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ	1998	Вуд Джил Э. Джонсон Джефри Дьюмэс Джеквес Кайре Юдэй Лоуингер Тимоти Бруно Паульсен Хольгер Редмэн Анико Ридль Бернд Сибли Роберт Скотт Уильям Дж. Смит Роджер Э. Хатоум-Мокдад Холия	RU2265597C2
ИНГИБИТОРЫ АКТИВНОСТИ ПРОТЕИНТИРОЗИНКИНАЗЫ	2009	Майкл Маннион Стефан Раппель Стивен Уилльям Кларидж Фредерик Годетт Лицзи Чжань Любомир Исаковиц Оскар Марио Сааведра Тетсуюки Уно Масаши Кишида Аркадий Вайсбург	RU2533827C2

ИНГИБИТОРЫ ПУТИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА NOTCH И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАКА Российский патент 2017 года по МПК A61K31/4412 A61K31/136 A61P35/00

Описание патента на изобретение RU2631611C2

Похожие патенты RU2631611C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 631 611 C2

Реферат патента 2017 года ИНГИБИТОРЫ ПУТИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА NOTCH И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАКА

Формула изобретения RU 2 631 611 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2017 года RU2631611C2

RU 2 631 611 C2