СОЕДИНЕНИЯ И КОМПОЗИЦИИ, АКТИВИРУЮЩИЕ ФЕРМЕНТЫ Российский патент 2018 года по МПК C07D295/192 C07D403/12 A61K31/495 A61P35/00 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Для настоящей заявки испрашивается приоритет в соответствии с положениями § 119 (е) Раздела 35 Свода законов США, по предварительной заявке на патент США №61/679,129, поданной 3 августа 2012 года, содержание которой полностью включено в данную заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Апоптоз означает процесс, используемый высшими организмами для поддержания гомеостаза путем удаления клеток, которые присутствуют в избытке, повреждены или потенциально опасны. Ферменты каспазы - это класс цистеиновых протеаз, которые расщепляют клеточные субстраты после распознавания последовательностей с С-терминальными остатками аспартата. Активация ферментов каспазы критична для апоптоза. Существуют два канонических сигнальных пути апоптоза, отличающиеся тем, что инициирующий апоптоз импульс является внутриклеточным (внутренний сигнальный путь) или внеклеточным (внешний сигнальный путь). Данные сигнальные пути приводят к расщеплению прокаспазы-3 с образованием активной каспазы-3, ключевой каспазы-«исполнителя», которая катализирует гидролиз сотен белковых субстратов, что приводит к гибели клетки.

Одна из особенностей рака - способность раковых клеток избегать апоптоза, допуская бесконтрольную пролиферацию. Как таковая, реактивация апоптоза в клетках с помощью дефектных сигнальных путей апоптоза - это перспективная противораковая стратегия. Все такие соединения, как деструкторы p53-MDM2 (нутлины), ингибиторы Bcl-2 (АВТ-737) и ингибиторы XIAP (SM-164) непосредственно воздействуют на белки в каскаде апоптоза, индуцируя апоптоз и приводя к гибели раковые клетки.

В дополнение к стратегиям, описанным выше: прямая активации прокаспазы-3 посредством малых молекул обладает потенциалом индивидуализации терапии рака. Уровни прокаспазы-3 повышаются при некоторых видах рака, в том числе - лимфомах, лейкозах, меланомах, раке поджелудочной железы, раке печени, раке легких, раке молочной железы, раке толстой кишки. Из-за повышенного уровня прокаспазы-3 в раковых клетках, существует необходимость активации каспазы-3 для апоптоза и относительное последующее расположение прокаспазы-3 в апоптотическом каскаде, а также индукция апоптоза путем прямой активации прокаспазы-3 в настоящее время активно изучается в качестве индивидуализированной противораковой стратегии. Соответственно, существует потребность в новых соединениях, которые моделируют активность прокаспазы-3, в частности, в соединениях, активирующих прокаспазу-3 и которые являются достаточно метаболически стабильными, чтобы эффективно применятся в клинической терапии.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Активирующее прокаспазу соединение 1 (PAC-1) представляет собой орто-гидрокси N-ацилгидразон, который повышает ферментативную активность прокаспазы-3 in vitro и индуцирует апоптоз раковых клеток. Аналог PAC-1, называющийся S-PAC-1, оценили в ходе ветеринарных клинических испытаний на домашних собаках с лимфомой и обнаружили в нем значительный потенциал в качестве противоракового средства. С целью определения более мощных соединений в данном перспективном классе экспериментальных терапевтических средств была создана комбинаторная библиотека на основе PAC-1, и проведена оценка способности соединений индуцировать гибель раковых клеток в культуре. Соединения оценивали по их способности индуцировать апоптоз раковых клеток и по их метаболической стабильности. Вновь выявленные соединения могут стать основой терапевтических средств для лечения многих видов рака, которые характеризуются повышенным уровнем экспрессии прокаспазы-3.

Открыты соединения, способные активировать ферменты, которые часто демонстрируют гиперэкспрессию в своей неактивной форме в раковых клетках. Соединения могут индуцировать запрограммированную гибель клеток (апоптоз) в раковых клетках, в том числе тех, которые активируют прокаспазу-3. Многие виды рака устойчивы к стандартной химиотерапии. Соединения, описанные в данной заявке, могут использовать преимущество биологических мишеней, которые можно активировать в раковых клетках, и, таким образом, могут быть эффективными даже в клетках с дефектами в механизме апоптоза. Эти соединения также могут успешно применяться в направленной терапии рака, селективно убивая раковые клетки со сравнительно пониженными побочными реакциями на нераковые клетки, имеющие более низкие уровни прокаспазы-3. Эти побочные реакции могут включать в себя токсичность, в частности - нейротоксичность.

Таким образом, изобретение относится к соединениям Формулы I:

где

R¹ представляет собой необязательно замещенный бензоил, фенил, (арил)метилен, или (арил)метин, где метиновый углерод необязательно замещен фенилом;

n имеет значения 1, 2, 3 или 4; и

каждый R² независимо представляет собой H, алкил, алкокси, гидрокси, карбокси, гало, амино, алкиламино, диалкиламино, трифторметил, трифторметокси, бензил, бензилокси, нитро, циано (-CN), сульфонамид (-SO₂NH₂), 2-пропенил, ацетилен, N-алкил-триазол или N-бензил-триазол; или две группы R² образуют орто-конденсированную бензогруппу;

или их фармацевтически приемлемой соли или сольвату.

В некоторых воплощениях R¹ означает бензоил (Ph(C=O)-). В других воплощениях R¹ означает замещенный бензоил. Бензоильную группу можно заместить 1, 2, 3 или 4 группами R². Переменные R² могут быть в орто-, мета- или пара- положениях, или их сочетаниях, по отношению к карбонилу бензоильной группы.

В некоторых воплощениях n имеет значения 1 или 2. В других воплощениях n имеет значения 3 или 4. Переменные R² могут быть в орто-, мета- или пара- положениях по отношению к гидроксильной группе соединения Формулы I, или их комбинации.

В некоторых воплощениях R² означает метил, трет-бутил, метокси, гидрокси, фтор, хлор, бром, йод, амино, этиламино, диэтиламино, трифторметил, трифторметокси, бензил, бензилокси, нитро, циано, сульфонамид, 2-пропенил, ацетилен, N-метил-триазол или N-бензил-триазол. В различных воплощениях n имеет значения 2, а две группы R² образуют орто-конденсированную бензогруппу. В некоторых воплощениях заместителем фенильной группы R¹ может быть заместитель R². В различных воплощениях R² может самостоятельно быть заместителем арильной группы R¹, включая бензоильную группу, и эти группы могут иметь от одного до пяти заместителей R².

В некоторых воплощениях n имеет значения 2, а каждый R² представляет собой t-бутил.

В некоторых воплощениях n имеет значение 1, а R² представляет собой 2-пропенил.

В некоторых воплощениях R¹ представляет собой метокси-бензил; диметокси-бензил; бензилокси-бензил; mpem-бутил-бензил; нафтилметилен; или этил-бензил.

В некоторых конкретных воплощениях R¹ представляет собой 4-метокси-бензил; 2,5-диметокси-бензил; 4-бензилокси-бензил; 4-трет-бутил-бензил; 2-нафтилметилен; или 4-этил-бензил.

В некоторых других конкретных воплощениях R¹ представляет собой:

.

В различных конкретных воплощениях соединение означает одно или более соединений 1-45 из Примера 4, соединение Таблицы 1 или его фармацевтически приемлемую соль или сольват. В других воплощениях соединение означает соединение, описанное в данной заявке, где метиленовый углерод, присоединенный к дистальному азоту пиперазина, замещен оксогруппой, например:

и т.п., для каждого соединения, описанного или показанного в данной заявке, без оксогруппы при метиленовом углероде, прикрепленному к дистальному азоту пиперазина. Например, в одном воплощении соединение представляет собой соединение Формулы (X):

где

R¹⁰ представляет собой H, F, Cl, Br, -NO₂, -CN, -CF₃, -OCF₃ или -SO₂NH₂;

R²⁰ представляет собой H, F, Cl, Br, -NO₂, -CN, -CF₃, -OCF₃ или -SO₂NH₂; и

R³⁰ представляет собой H, (C₁-C₆)алкил, (C₁-C₆)алкенил или (C₁-C₆)алкокси;

или их фармацевтически приемлемую соль или сольват.

В некоторых воплощениях R¹⁰ представляет собой H.

В некоторых воплощениях R¹⁰ представляет собой F, Cl или Br.

В некоторых воплощениях R¹⁰ представляет собой -NO₂ или -CN.

В некоторых воплощениях R¹⁰ представляет собой -CF₃, -OCF₃ или -SO₂NH₂.

В некоторых воплощениях R²⁰ представляет собой H. В некоторых воплощениях R²⁰ представляет собой F. В некоторых воплощениях R²⁰ представляет собой H или F.

В некоторых воплощениях R²⁰ представляет собой F, Cl или Br.

В некоторых воплощениях R²⁰ представляет собой -NO₂ или -CN.

В некоторых воплощениях R²⁰ представляет собой -CF₃, -OCF₃ или -SO₂NH₂.

В некоторых воплощениях R³⁰ представляет собой H.

В некоторых воплощениях R³⁰ представляет собой н-пропил.

В некоторых воплощениях R³⁰ представляет собой 2-пропенил (аллил).

В некоторых воплощениях R¹⁰ может быть R¹, как описано выше, и наоборот.

В некоторых воплощениях R²⁰ может быть R², как описано выше, и наоборот.

В некоторых воплощениях R³⁰ может быть R³, как описано выше, и наоборот.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей соединение, описанное в настоящей заявке, и фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель. В некоторых воплощениях соединение индуцирует гибель раковых клеток в культуре.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения раковой клетки, который включает (а) идентификацию восприимчивости к лечению раковой клетки с помощью активирующего прокаспазу соединения; и (b) воздействие на раковую клетку эффективным количеством активирующего прокаспазу соединения; где активирующее прокаспазу соединение означает соединение, описанное в настоящей заявке.

Изобретение также относится к способу индукции апоптоза клетки, включающему введение в клетку эффективного количества соединения, описанного в данной заявке.

В некоторых воплощениях данное изобретение относится к соединениям и способам, связанным с такими эффективными концентрациями, как приблизительно от 10 нМ приблизительно до 100 мкМ соединения указанной структурной формулы. В некоторых воплощениях эффективные концентрации составляют приблизительно от 200 нМ приблизительно до 5 мкМ. В другом воплощении эффективная концентрация является таким значением, как 50% объемной активности в непосредственно активирующем прокаспазу аналитическом образце, индуцирующем апоптоз клетки аналитическом образце или в клинической терапевтической оценке на животных. В другом воплощении такие значения меньше, чем приблизительно 200 мкМ. В различных воплощениях значение меньше, чем приблизительно 10 мкм. В различных воплощениях соединение может иметь значительную метаболическую стабильность. Например, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90% или по меньшей мере приблизительно 95% образца соединения могут оставаться после 3-часовой инкубации при проведении теста на определение стабильности в микросомах печени.

Таким образом, изобретение относится к соединениям, композициям и способам терапевтического лечения. В некоторых воплощениях, изобретения применимы в контексте различных раковых заболеваний и типов раковых клеток, таких как рак молочной железы, надпочечников, почек, меланома, лейкоз, лимфома, нейробластома, рак легких, мозга, среди прочих.

Изобретение относится к новым соединениям, описанным в данной заявке, и соединениям Формул, описанных в данной заявке, промежуточным продуктам для синтеза таких соединений, а также к способам получения этих соединений. Изобретение также относится к соединениям, которые полезны в качестве промежуточных продуктов в синтезе других полезных соединений.

Также изобретение относится к применению композиций, описанных в данной заявке, для использования в медицинской терапии. Медицинской терапией может быть лечение рака, например, лимфом, лейкозов, меланом, рака поджелудочной железы, рака печени, рака легких, рака молочной железы, рака толстой кишки. Настоящее изобретение также относится к применению препарата, описанного в данной заявке, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания у млекопитающего, например, рака у человека. Лекарственное средство может включать в себя фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Следующие фигуры являются частью описания и включены для дополнительной демонстрации некоторых вариантов осуществления или различных аспектов настоящего изобретения. В некоторых случаях варианты осуществления настоящего изобретения можно лучше понять, обратившись к прилагаемым чертежам в сочетании с подробным описанием, представленным в данной заявке. Описание и прилагаемые чертежи могут выделять определенный конкретный пример или определенный аспект настоящего изобретения. Тем не менее, специалистам в данной области техники будет понятно, что части примера или аспекта можно использовать в сочетании с другими примерами или аспектами настоящего изобретения.

Фиг. 1. Гидразиды, использованные для построения комбинаторной библиотеки аналогов PAC-1. Каждый предшественник бензилгидразида R¹ также может быть соответствующим соединением-предшественником бензоилгидразида R¹ в различных воплощениях.

Фиг. 2. Альдегиды, использованные в комбинаторной библиотеке аналогов PAC-1 в соответствии с некоторыми воплощениями.

Фиг. 3. Активность культуры клеток. Клетки U-937 (лимфома человека), обработанные соединениями в концентрации 25 мкМ в течение 24 часов. Жизнеспособность клеток оценивается анализом с использованием красителя Аламарового синего. Пределы погрешности обозначают стандартное отклонение от среднего (n=3).

Фиг. 4. Тест на определение стабильности в микросомах печени. Соединения (10 мкМ), инкубированные с микросомами печени в течение 3 ч и экранированные MeCN, содержащей внутренний стандарт, анализируют с помощью ЖХ/МС (280 нм).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В 2006 году было объявлено об открытии Активирующего прокаспазу соединения 1 (PAC-1, Схема A) (Putt et al. Nat Chem Biol 2006. 2, 543-550). PAC-1 усиливает ферментативную активность прокаспазы-3 in vitro, индуцирует апоптотическую гибель раковых клеток и демонстрирует эффективность на множественных моделях мышиных опухолей. Исследования соотношения структура-активность показали, что активность PAC-1 in vitro и в культуре клеток зависит от присутствия фрагмента орто-гидрокси N-ацил-гидразона (схема А), функциональной группы, как известно участвующей в хелатировании металлов. В самом деле, цинк является мощным ингибитором ферментативной активности прокаспазы-3, а механизм, с помощью которого PAC-1 активирует прокаспазу-3 in vitro, заключается в хелатировании ингибирующего цинка из прокаспазы-3, что позволяет прокаспазе-3 преобразовываться в активную форму. Этот же основной механизм, по-видимому, функционирует также и в клеточной культуре: приблизительно 10% внутриклеточного цинка не связано прочно, но существует в виде «лабильного цинкового пула». Было показано, цинк из лабильного пула ко-локализуются с прокаспазой-3, и как оказалось, хелатирование PAC-1 указанного лабильного цинка внутри клеток повышает активность прокаспазы-3, что приводит к апоптозу.

Схема А: PAC-1 и S-PAC-1, с орто-гидрокси N-ацил-гидразоновым мотивом, и соответствующие бензоильные (Bz) производные.

PAC-1 можно безопасно вводить мышам и испытуемым собакам в дозах, которые дают концентрации сыворотки ~10 мкМ в течение 48 часов. Сульфонамидсодержащее производное PAC-1, называемое S-PAC-1 (схема А), можно безопасно вводить в дозах, которые обеспечивают очень высокие концентрации сыворотки у мышей (~3,5 мМ). Обнадеживает то, что ветеринарные клинические испытания S-PAC-1 (вводимого в виде 24- или 72-часовой непрерывной инфузии IV) на домашних собаках со спонтанно встречающимися лимфомами, показали, что это соединение безопасно для всех ветеринарных пациентов и эффективно для снижения или стабилизации роста опухоли у 4 из 6 пациентов. Этот результат является концептуальным подтверждением понятия того, что активация прокаспазы-3 путем хелатирования лабильного цинка малыми молекулами может быть безопасной и эффективной противораковой стратегией. В постоянном поиске более сильных производных PAC-1 мы сообщаем в данной заявке о синтезе новых аналогов PAC-1, оценке этих веществ на их способность индуцировать гибель раковых клеток в культуре, и далее характеризуем различные соединения с повышенной метаболической устойчивостью.

Дизайн и синтез комбинаторной библиотеки на основе PAC-1. Библиотеку аналогов PAC-1 разрабатывают с целью идентификации соединений, способных вызывать масштабную гибель раковых клеток в культуре. Так как максимальной цитотоксичности S-PAC-1 не достигалось по меньшей мере в течение вплоть до 24 часов, и так как PAC-1 и S-PAC-1 демонстрировали короткий период полураспада 1-2 часа in vivo, вторичной целью данного исследования была идентификация аналогов PAC-1, которые могут индуцировать апоптоз быстрее. Отмеченные синтетические пути к PAC-1 и S-PAC-1, а также другим аналогам PAC-1, используют конденсацию гидразида и альдегида в качестве конечной стадии в синтетической схеме, раскрытой в (заявке US 2007/0049602) (WO 2008/134474 (Hergenrother et al.)). Этот модульный характер синтеза PAC-1 дает возможность множеству разнообразных функциональных групп, быть легко включаемыми в остов PAC-1, существенно не изменяя ядро орто-гидрокси N-ацил-гидразонового мотива, необходимого для активации прокаспаза-3 и индукции апоптоза.

Как показано на Фиг. 1 и 2, 31 гидразид (1{1-31}) и 27 альдегидов (2{1-27}) были выбраны для создания библиотек из 837 аналогов PAC-1. Гидразиды были построены из коммерчески доступных бензилгалогенидных исходных соединений. Синтез гидразидов 1{1-6} был представлен ранее (Putt et al. Nat Chem Biol 2006, 2, 543-550; Peterson et al. J Med Chem 2009, 52, 5721-5731; Peterson и др., Cancer Res 2010, 70, 7232-41). Гидразиды 1{7-27} синтезируют согласно схеме 1. Замещенные бензилгалогениды 4{7-27} сначала подвергают взаимодействию с пиперазином с образованием замещенных бензилпиперазинов 5{7-27}. Последующее алкилирование пиперазинового кольца этилхлорацетатом дает дизамещенные пиперазины 6{7-27}, а сложные эфиры затем превращают в гидразиды 1{7-27} с помощью реакции с гидразином.

Схема 1: Синтез гидразидов 1{7-27}.

Синтетические пути для получения гидразидов 1{28-31} подробно описаны в схеме 2. Синтез гидразида 1{28} начинался с алкилирования пиперазина 4-винилбензилхлоридом (7) с образованием монозамещенного пиперазина 8 (схема 2, уравнение 1). Последующее алкилирование этилхлорацетатом дает сложный эфир 9, а реакция с гидразином образует гидразид и восстанавливает олефин, давая гидразид 1 {28}. Восстановление олефинов гидразином, как правило, предполагает добавление окислительного агента (Miller, С.Е., Hydrogenation with Diimide. J Chem Educ 1965, 42, 254), однако присутствие кислорода воздуха было достаточным для достижения этого превращения.

Схема 2: Синтез гидразидов ^{28-31}.

Синтез гидразида 1{29} (схема 2, уравнение 2) начался с реакции этил-2-(пиперазин-1-ил)ацетата (10) с бензилбромидом 4{29} с образованием промежуточного продукта 6{29}. Реакция соединения 6{29} с гидразином затем дает гидразид 1{29}. Синтез гидразида 1{30} (схема 2, уравнение 3) начался с реакции 1-фенилпиперазина (5{30}) с этилхлорацетатом, чтобы получить дизамещенный пиперазин 6{30}, и реакция с гидразином дает гидразид 1{30}. Гидразид 1{31} синтезируют путем первоначальной защиты 4-метилбензофенона (11) в виде этиленацеталя (12), как показано на схеме 2, уравнение 4. Это соединение бромируют в радикальных условиях с получением бензилбромида 13. Реакция с монозамещенным пиперазином 10 дает промежуточный продукт 14, а реакция с гидразином дает гидразид 15. Удаление ацетальной защитной группы водным раствором кислоты дает гидразид 1{31}.

Соотношение структура-активность PAC-1, выведенное на основе синтеза и оценки ~30 соединений, демонстрирует необходимость наличия орто-гидроксильной группы, поэтому для создания библиотеки было отобрано 27 салицилальдегидных строительных блоков. Альдегиды 2{1-23} были получены из коммерчески доступных исходных материалов, а синтез альдегидов 2{24-26} описывался ранее (Peterson et al., J Med Chem 2009, 52, 5721-5731; Peterson et al., Cancer Res 2010, 70, 7232-41; Chang et al., Dalton Trans 2004, 1731-8). Альдегид 2{27} синтезируют путем катализируемого медью циклоприсоединения альдегида 2{26} к бензилазиду, как показано на схеме 3.

Схема 3: Синтез альдегида 2{27}.

Используя параллельный синтезатор фирмы Büchi Syncore, каждый гидразид конденсируют с каждым альдегидом, при этом более 80 реакций выполняют одновременно. Каждый альдегид (5-15 мг) подвергают взаимодействию с избытком гидразида (1,7 экв.), и для контроля исчезновения альдегида из реакционной смеси используют масс-спектрометрию. Когда альдегид прореагировал полностью, добавляют полистирол-связанный бензальдегид в качестве поглотительной смолы, взаимодействия с избытком гидразида и его удаления. Когда масс-спектрометрия показала, что не осталось остатков гидразида, гранулы отфильтровывают, а растворы высушивают в высоком вакууме. Каждое из 837 соединений оценивают с помощью ВЭЖХ/МС. Чистота каждого соединения составила приблизительно 74-100%, со средней чистотой 91%.

Оценка комбинаторной библиотеки PAC-1. Имея 837 аналогов PAC-1, соединения оценивают на их способность индуцировать апоптоз в культуре клеток. Клетки лимфомы человека U-937 подвергают воздействию соединений в течение 24 ч при концентрации 20 мкМ. И PAC-1 и S-PAC-1 демонстрируют умеренную активность (гибель ~50% клеток) в отношении этой клеточной линии в данных условиях. Гибель клеток путем апоптоза оценивают методом проточной цитометрии с использованием аннексина V-FITC и окрашивания йодидом пропидия. С помощью этого процесса скрининга было определено и подтверждено, что шесть соединений вызывают гибель >80% клеток в данных условиях.

Индукция гибели клеток и ослабление цинк-опосредованного ингибирования прокаспазы-3 найденными соединениями. После повторного синтеза найденных соединений (3{2,7}, 3{4,7}, 3{18,7}, 3{20,24}, 3{25,7}, и 3{28,7}) аналитически чистые образцы соединений оценивают в дальнейших биологических анализах. Эти структуры и биологические результаты приведены в Таблице А выше. Соединения оценивают в диапазоне концентраций, в отношении их способности индуцировать клеточную гибель клеток U-937, а также их способности активировать прокаспазу-3 in vitro. Все шесть из этих найденных соединений оказались в 2-4 раза более сильными в клеточной культуре, чем PAC-1 и S-PAC-1 при 72-часовой обработке.

Во втором эксперименте анализ проточной цитометрией с помощью аннексина V-FITC и йодида пропидия выполняют на клетках U-937, которые подвергали воздействию соединений одной концентрации (7,5 мкМ) в течение 24 часов (таблица А). В течение 24 часов большинство обработанных соединением клеток подверглись апоптозу (клетки в правом нижнем квадранте гистограммы - положительные по аннексину V, отрицательные по иодиду пропидия), или были в конце стадии апоптоза/некроза (верхний правый квадрант - положительные по аннексину V, положительные по иодиду пропидия) было установлено, что новые аналоги более мощные, чем PAC-1 в данных условиях продолжительностью 24 часа.

Шесть подтвержденных найденных соединений затем оценивали in vitro на их способность уменьшить цинк-опосредованное ингибирование прокаспазы-3 (Таблица А). В этом эксперименте прокаспазу-3 инкубируют с помощью ZnSO₄, т.е. в условиях, в которых прокаспаза-3 не имеет ферментативной активности. Все соединения были способны усиливать ферментативную активность прокаспазы-3 в данных условиях (по оценке расщепления колориметрического субстрата каспазы-3 Ac-DEVD-pNA, синтезированного, как упоминалось ранее (Peterson et al., Nat Protoc 2010, 5, 294-302), a пять из шести найденных соединений показали большую активность, по сравнению с PAC-1 в этом анализе. Эти данные показывают, что соединения повышают активность прокаспазы-3 in vitro посредством хелатирования ингибирующего цинка, и предполагается, что в клетке соединения хелатируют цинк из лабильного пула, что позволяет прокаспазе-3 быть преобразованной в активную каспазу-3, что приводит к апоптотической гибели клеток.

Прямая модуляция апоптотических белков подставляет собой практическую противораковую стратегию. PAC-1 и его производное S-PAC-1, которые хелатируют лабильный клеточный цинк и индуцируют апоптоз раковых клеток, оказались эффективными в различных доклинических противоопухолевых моделях. Тем не менее, производные, которые вызывают гибель клеток более быстро и более мощно, будут еще более привлекательными в качестве терапевтических средств. Используя параллельный синтез и руководствуясь известным соотношением структура-активность, были синтезированы 837 аналогов PAC-1 и проведена их оценка по свойству индуцировать гибель клеток. Шесть соединений, показанные в таблице А, стали результатом этой работы. Эти соединения в два-четыре раза более мощные, чем PAC-1 в индукции гибели раковых клеток как при 24-часовом, так и при 72-часовом исследовании.

Учитывая общую гидрофобность найденных соединений по отношению к PAC-1, повышенная эффективность и повышенная скорость клеточной гибели может быть вызвана повышенной проницаемостью клеток. Указанные качества могут быть выгодными, поскольку соединения прошли исследования in vivo. Кроме того, другие элементы этой библиотеки, вероятно, станут жизнеспособными кандидатами для исследования in vivo, так как рассматриваются и альтернативные свойства (например, склонность пересечь гематоэнцефалический барьер, улучшенная метаболическая стабильность, улучшенная растворимость / состав для исследований in vivo и т.п.). Таким образом, указанная библиотека из 837 соединений может стать ценным источником для разработки соединений нового поколения, активирующих прокаспазу-3.

Дополнительные соединения и их анализ

Высокопроизводительный скрининг приблизительно 20000 соединений определил PAC-1 (1, схема А1) в качестве соединения, которое повышает расщепление прокаспазы-3 in vitro. Соединение вызывает апоптоз клеток в широком спектре линий раковых клеток в культуре и показывает противоопухолевую эффективность на множественных моделях мышиных опухолей.¹ Дальнейшее изучение соотношений структура-активность (SAR) выявило орто-гидрокси-N-ацилгидразон в качестве ключевого фармакофора.^2-3 Несколько производных PAC-1, содержащих этот мотив, проявляют сравнимую активность in vitro и в культуре клеток, но производные, имеющие модифицированное ядро, теряют активность.³ Орто-гидрокси-N-ацилгидразон, как известно, хелатирует металлы,⁴ многие из которых, как известно, ингибируют прокаспазу и ферменты каспазы.^{2, 5-7} В частности, цинк из лабильного цинкового пула, который слабо связан и не играет существенной роли в активности этих белков, как было показано, локализуется с прокаспазой-3 и ингибирует ее ферментативную активность. Механизм действия PAC-1, скорее всего, включает в себя хелатирование цинка из лабильного пула, уменьшая цинк-опосредованное ингибирование прокаспазы-3, и позволяет ферменту преобразовываться в активную форму.^2-3

Схема А1. Структуры PAC-1 (1) и S-PAC-1 (2).

Фармакокинетические исследования PAC-1 показали, что концентрации в сыворотке приблизительно 10 мкМ можно достичь с минимальными побочными эффектами.⁸ Сульфонамидсодержащее производное PAC-1, называемое S-PAC-1 (2, схема А1), можно безопасно вводить в дозах 350 мг/кг или выше, с получением максимальной концентрации в плазме 3,5 мМ.⁹ Улучшенный профиль безопасности связан в значительной степени со снижением способности преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), по сравнению с PAC-1.¹⁰ Обнадеживает то, что S-PAC-1 является эффективным в снижении или стабилизации роста опухоли у четырех из шести собак, больных спонтанно возникающей лимфомой, и соединение хорошо переносится всеми шестью собаками.⁹ Этот результат демонстрирует потенциал активации прокаспазы в качестве безопасной и эффективной противораковой стратегии.

Результаты и обсуждение. Синтез соединения. Предыдущие синтезы PAC-1 и других производных включают в себя на последней стадии конденсацию гидразида с альдегидом с образованием ключевого орто-гидрокси-N-ацилгидразона.^{1, 3, 9, 11} Эта реакция была полезна для синтеза большого количества производных из сравнительно небольшого числа исходных веществ.¹¹ В данной работе, аналоги PAC-1 1-45 были синтезированы путем конденсации девяти гидразидов (46a-i) с пятью альдегидами (47а-е), как показано на схеме А2.

Схема А2. Строительные блоки, использованные для построения библиотеки.

Гидразиды синтезируют в соответствии со схемой А3а-с. Синтез начинают с алкилирования пиперазина (48) этилхлорацетатом (49) с образованием монозамещенного пиперазина 50. Соединение 50 затем подвергают взаимодействию с замещенным бензил или бензоилгалогенидом с получением дизамещенных пиперазинов 51a-i с высокими выходами. Реакция сложных эфиров с гидразином затем дает гидразиды 46a-i.

Схема A3. Синтез аналогов PAC-1. (а) Синтез гидразидов (46a-i). (b) Синтез альдегидов (47а-е). (с) Конденсация гидразидов и альдегидов с образованием аналогов PAC-1 (1-45).

Синтез альдегидов показан на схеме A3b. Как салициловый альдегид (52), так и 5-фторсалицилальдегид (47с) алкилируют аллилбромидом с получением аллилоксибензальдегидов 53a-b с высокими выходами. Нагревание указанных соединений при 200°С позволило данным субстратам пройти перегруппировку Кляйзена, с образованием альдегидов 47а и 47d с выходом приблизительно 50%. Наконец, хемоселективная гидрогенизация дифенилсульфидом в качестве каталитического яда¹² дает альдегиды 47b и 47е с высоким выходом. Как показано на схеме А3с, каждый из гидразидов (46a-i) конденсируют с каждым из альдегидов (47а-е) в присутствии каталитического количества HCl с получением производных PAC-1 1-45, структуры которых приведены в таблице 1 (см. также фиг. 3 и 4).

Оценка аналогов РАС-1. После завершения синтеза оценивают биологическую активность соединений. Сначала определяют 72-часовые значения 1С₅₀ соединений

против клеток U-937 в культуре (таблица 1). Обнаруживают, что каждое из соединений заметно индуцирует дозозависимую гибель клеток в данных условиях, и большинство соединений было приблизительно таким же мощным, как PAC-1 и S-PAC-1.

Далее, метаболическую стабильность соединений оценивают в микросомах печени крыс. Соединения оценивают в течение 3 часов при концентрации 10 мкМ, и метаболиты обнаруживают с помощью ЖХ/МС. Результаты данного анализа представлены в таблице 1. Соединения, содержащие бензоильные заместители были значительно более стабильны, чем аналогичные соединения, содержащие бензильные группы. Неожиданно оказалось, что пропилсодержащие соединения были менее устойчивы, чем аллилсодержащие соединения, хотя дигидроксилированные метаболиты не наблюдались у пропиловых соединений. Кроме того, S-PAC-1 был достаточно стабильным в микросомах печени, несмотря на короткий период полураспада соединения in vivo, что указывает на то, что другие механизмы элиминирования играют большую роль в удалении S-PAC-1 из организма.

Наконец, прогнозируемое значение logBB рассчитывают для каждого соединения. Этот алгоритм, который включает в себя площадь полярной поверхности и ClogP, используется для прогнозирования проницаемости малых молекул через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).¹³ Соединения с более положительными значениями logBB будут иметь более высокие концентрации в головном мозге, в то время как соединения с более отрицательными значениями logBB будут иметь более высокие концентрации в крови. Значения приведены в таблице 1. Как и ожидалось, несколько соединений, содержащих гидрофобные заместители, прогнозируемо преодолеют гематоэнцефалический барьер в большей степени, чем те, которые содержат более полярные заместители.

Оценка токсичности in vivo. С целью идентификации соединения с улучшенной переносимостью, 32 из 45 аналогов PAC-1 оценивают в опытах на мышах. Результаты исследования токсичности приведены в Таблице 1. Уровень токсичности оценивают по шкале от 0 (без наблюдаемых неблагоприятных эффектов) до 3 (тяжелая токсичность, вплоть до летального исхода). Многие из соединений приводят к летальному исходу мышей, и мыши умерли либо в течение 24 часов лечения, либо по истечении более 72 часов после лечения; эти результаты также отмечены.

Библиография

1. Putt, K.S.; Chen, G.W.; Pearson, J.M.; Sandhorst, J.S.; Hoagland, M.S.; Kwon, J.Т.; Hwang, S.K.; Jin, H.; Churchwell, M.I.; Cho, M.H.; Doerge, D.R.; Helferich, W.G.; Hergenrother, P.J., Small-molecule activation of procaspase-3 to caspase-3 as a personalized anticancer strategy. Nat. Chem. Biol. 2006, 2, 543-550.

2. Peterson, Q.P.; Goode, D.R.; West, D.C.; Ramsey, K.N.; Lee, J.J.Y.; Hergenrother, P.J., PAC-1 Activates Procaspase-3 in Vitro through Relief of Zinc-Mediated Inhibition. J. Mol. Biol. 2009, 388, 144-158.

3. Peterson, Q.P.; Hsu, D.C.; Goode, D.R.; Novotny, C.J.; Totten, R.K.; Hergenrother, P.J., Procaspase-3 Activation as an Anti-Cancer Strategy: Structure-Activity Relationship of Procaspase-Activating Compound 1 (PAC-1) and Its Cellular Co-Localization with Caspase-3. J. Med. Chem. 2009, 52, 5721-5731.

4. Charkoudian, L.K.; Pham, D.М.; Franz, K.J., A pro-chelator triggered by hydrogen peroxide inhibits iron-promoted hydroxyl radical formation. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 12424-12425.

5. Aiuchi, Т.; Mihara, S.; Nakaya, М.; Masuda, Y.; Nakajo, S.; Nakaya, K., Zinc ions prevent processing of caspase-3 during apoptosis induced by geranylgeraniol in HL-60 cells. J. Biochem. 1998, 124, 300-303.

6. Chai, F.; Truong-Tran, A.Q.; Ho, L.H.; Zalewski, P.D., Regulation of caspase activation and apoptosis by cellular zinc fluxes and zinc deprivation: A review. Immunol. Cell Biol. 1999, 77, 272-278.

7. Perry, D.K.; Smyth, М.J.; Stennicke, H.R.; Salvesen, G.S.; Duriez, P.; Poirier, G.G.; Hannun, Y.A., Zinc is a potent inhibitor of the apoptotic protease, caspase-3. A novel target for zinc in the inhibition of apoptosis. J. Biol. Chem. 1997, 272, 18530-18533.

8. Lucas, P.W.; Schmit, J.М.; Peterson, Q.P.; West, D.C.; Hsu, D.C.; Novotny, C.J.; Dirikolu, L.; Churchwell, М.I.; Doerge, D.R.; Garrett, L.D.; Hergenrother, P.J.; Fan, T.М., Pharmacokinetics and derivation of an anticancer dosing regimen for PAC-1, a preferential small molecule activator of procaspase-3, in healthy dogs. Invest. New Drugs 2011, 29, 901-911.

9. Peterson, Q.P.; Hsu, D.C.; Novotny, C.J.; West, D.C.; Kim, D.; Schmit, J.М.; Dirikolu, L.; Hergenrother, P.J.; Fan, T.М., Discovery and canine preclinical assessment of a nontoxic procaspase-3-activating compound. Cancer Res. 2010, 70, 7232-7241.

10. West, D.C.; Qin, Y.; Peterson, Q.P.; Thomas, D.L.; Palchaudhuri, R.; Morrison, K.C.; Lucas, P.W.; Palmer, A.E.; Fan, T.М.; Hergenrother, P.J., Differential effects of procaspase-3 activating compounds in the induction of cancer cell death. Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 1425-1434.

11. Hsu, D.C.; Roth, H.S.; West, D.C.; Botham, R.C.; Novotny, C.J.; Schmid, S.C.; Hergenrother, P.J., Parallel Synthesis and Biological Evaluation of 837 Analogues of Procaspase-Activating Compound 1 (PAC-1). ACS Comb. Sci. 2012, 14, 44-50.

12. Mori, A.; Miyakawa, Y.; Ohashi, E.; Haga, Т.; Maegawa, Т.; Sajiki, H., Pd/C-catalyzed chemoselective hydrogenation in the presence of diphenylsulfide. Org. Lett. 2006, 8, 3279-3281.

13. Clark, D.E., Rapid calculation of polar molecular surface area and its application to the prediction of transport phenomena. 2. Prediction of blood-brain barrier penetration. J. Pharm. Sci. 1999, 88, 815-821.

Определения

Как используют здесь, приведенные термины имеют следующие значения. Все другие термины и фразы, используемые в данном описании, имеют свои обычные значения, понятные специалисту в данной области техники. Такие обычные значения можно получить, ссылаясь на технические словари, такие как Hawley's Condensed Chemical Dictionary 14^th Edition, by R.J. Lewis, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2001.

Ссылки в описании на «одно воплощение», «воплощение» и т.д., указывают, что описанное воплощение может включать в себя конкретный аспект, признак, структуру, фрагмент или характеристику, но не каждый вариант обязательно включает в себя этот аспект, признак, структуру, фрагмент или характеристику. Кроме того, такие фразы могут, но не обязательно, относиться к тому же самому воплощению, которое указано в других частях описания. Кроме того, когда конкретный аспект, признак, структура, фрагмент или характеристика описываются в связи с каким-либо воплощением, то в пределах компетенции специалиста в данной области техники привязать или сопоставить такой аспект, признак, структуру, фрагмент или характеристику с другими воплощениями, как описанными, так и не описанными явным образом.

Формы единственного числа «a», «an», «the» включают в себя и ссылки на множественное число, если контекст явно указывает на иное. Так, например, ссылка на «соединение» включает в себя множество таких соединений, таким образом, соединение Х включает в себя множество соединений X. Следует также отметить, что пункты формулы могут формулироваться так, чтобы исключить какой-либо дополнительный элемент. Таким образом, это утверждение призвано служить в качестве предшествующей основы для использования такой отличительной терминологии, как «исключительно», «только», и т.п. в связи с перечислением элементов формулы изобретения или использованием «отрицательного» ограничения.

Термин «и/или» означает любой из элементов, любую комбинацию из элементов или все элементы, с которыми этот термин ассоциируется. Фраза «один или более» легко понятна специалистам в данной области техники, в частности при ее прочтении в контексте ее использования. Например, один или более заместителей на фенильном кольце относится к 1-5 или 1-4, например, если фенильное кольцо является дизамещенным.

Термин «приблизительно» может относиться к отклонению ±5%, ±10%, ±20%, или ±25% от указанного значения. Например, «приблизительно 50» процентов может в некоторых воплощениях предполагать диапазон от 45 до 55 процентов. Для целочисленных диапазонов термин «приблизительно» может включать в себя один или два целых числа больше и/или меньше, чем упоминаемое целое на каждом конце диапазона. Если не указано иное, то термин «приблизительно» предполагается включающим в себя параметры, например, массовые проценты, близкие к упомянутому диапазону, которые эквивалентны с точки зрения функциональности отдельного ингредиента композиции или воплощения.

Как будет понятно специалисту в данной области техники, все числа, в том числе, выражающие количества ингредиентов, свойства, такие как молекулярная масса, условия реакции и тому подобное, являются приближенными и понимаются как необязательно измененные во всех случаях термином «приблизительно». Эти значения могут изменяться в зависимости от требуемых свойств, которые должны быть получены специалистами в данной области техники с использованием приведенного описания в данной заявке. Следует также понимать, что такие значения по своей сути содержат изменчивость, обязательно проистекающую из стандартных отклонений, обнаруженных в их соответствующих тестовых измерениях.

Как будет понятно специалисту в данной области техники, для любых и всех целей, в частности, с точки зрения представления письменного описания, все диапазоны, указанные в описании, также охватывают любые и все возможные поддиапазоны и комбинации этих поддиапазонов, а также отдельные значения, составляющие диапазон, в частности, целые значения. Упоминаемый диапазон (например, массовые проценты или углеродные группы) включает в себя каждое конкретное значение, целое, десятичную дробь или идентичность в пределах диапазона. Любые указанные диапазоны можно легко признать, как достаточно описывающие и позволяющие разбить этот диапазон по меньшей мере на равные половины, на три, четыре, пять или десять частей. В качестве неограничивающего примера, каждый диапазон, обсуждаемый в описании, можно легко разбить на нижнюю треть, среднюю треть и верхнюю треть и т.п. Кроме того, как будет понятно специалисту в данной области техники, все термины, «до», «по меньшей мере», «больше», «меньше чем», «более чем», «или более» и тому подобное, включают в себя упомянутое количество, и такие термины относятся к диапазонам, которые можно впоследствии разбить на поддиапазоны, как обсуждалось выше. Таким же образом, все соотношения, указанные в описании, также включают в себя все вспомогательные соотношения, входящие в более широкое соотношение. Соответственно, конкретные значения, приведенные для радикалов, заместителей и диапазонов, предназначены только для иллюстрации; они не исключают других определенных значений или других значений в пределах определенных диапазонов для радикалов и заместителей.

Специалисты в данной области техники также легко поймут, что там, где члены сгруппированы в общем порядке, например, как в группе Маркуша, данное изобретение охватывает не только всю группу, перечисленную в целом, но каждый член группы индивидуально и все возможные подгруппы основной группы. Кроме того, для всех целей, изобретение охватывает не только главную группу, но и основную группу минус один или более членов группы. Таким образом, изобретение предусматривает явное исключение какого-либо одного или более упомянутых членов группы. Соответственно, условия могут применяться к любому из описанных воплощений или любой категории, тем самым любой, один или более, из указанных элементов, видов или воплощений, могут быть исключены из таких категорий или вариантов осуществления, например, как использованные в явном отрицательном ограничении.

Термин «контактирование» относится к действию соприкосновения, осуществлению контакта, или приведению в непосредственную или малую близость, в том числе на клеточном и молекулярном уровне, например, чтобы вызвать физиологическую реакцию, химическую реакцию или физическое изменение, например, в растворе, в реакционной смеси, in vitro или in vivo.

«Эффективное количество» относится к количеству, эффективному для лечения заболевания, расстройства и/или состояния, или для получения упомянутого эффекта, такого как, активация или ингибирование. Например, эффективное количество может быть количеством, эффективным для снижения прогрессирования или тяжести заболевания или симптомов, подлежащих лечению. Определение терапевтически эффективного количества доступно среднему специалисту в данной области техники. Предполагается, что термин «эффективное количество» включает в себя количество соединения, описанного в заявке, или количество комбинации соединений, описанных в заявке, например, которое является эффективным для лечения или профилактики заболевания или расстройства, или для лечения симптомов заболевания или расстройства у хозяина. Таким образом, «эффективное количество», как правило, означает количество, которое обеспечивает желаемый эффект. В одном воплощении изобретения эффективное количество относится к количеству активного агента, описанного в заявке, которое эффективно либо само по себе, либо в комбинации с фармацевтическим носителем, при введении одной или нескольких доз в клетку или субъекту, например, пациенту, при ингибировании роста или пролиферации, индуцируя гибель или предотвращая рост гиперпролиферативных клеток. Такое ингибирование роста или гибель может отразиться на продлении жизни субъекта, например, пациента, на больший срок, чем ожидалось в отсутствие такого лечения, или какого-либо улучшения в прогнозе субъекта в сравнении с отсутствием такого лечения.

Термины «лечение», «лечить» и «процесс лечения» включают в себя (i) предотвращение болезни, медицинского или патологического состояния или расстройства (например, профилактика); (ii) ингибирование болезни, патологического или медицинского состояния или расстройства или прекращение их развития; (iii) облегчение болезни, патологического или медицинского состояния или расстройства; и/или (iv) уменьшение симптомов, связанных с болезнью, патологическим или медицинским состоянием или расстройством. Таким образом, термины «лечить», «процесс лечения» и «лечение» могут распространяться на профилактику, и могут включать в себя предотвращение, предупреждение, процесс предотвращения, снижение, прекращение или обращение прогрессирования или тяжести заболевания или симптомов, подлежащих лечению. Таким образом, термин «лечение» может включать в себя применение медицинских, терапевтических и/или профилактических мер, в зависимости от ситуации. В некоторых воплощениях термины «процесс лечения», «лечить» или «лечение» могут относиться к (i) предотвращению роста опухоли или повторного роста опухоли (профилактика), (ii) уменьшению или устранению симптомов рассматриваемой болезни (терапия) или (iii) устранение или уничтожение опухоли (лечение).

Термины «ингибировать», «ингибирующее», и «ингибирование» относятся к замедлению, прекращению или обращению вспять роста или прогрессирования заболевания, инфекции, состояния или группы клеток. Ингибирование может быть больше, чем приблизительно 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 95% или 99%, например, по сравнению с ростом или прогрессированием, которые наступают при отсутствии лечения или контакта. Кроме того, термины «индуцировать» «ингибировать», «усиливать», «увеличивать», «повышать», «снижать» или сходные обозначают количественные различия между двумя состояниями, и могут ссылаться по меньшей мере на статистически значимые различия между двумя состояниями. Например, «количество, эффективное для ингибирования роста гиперпролиферативных клеток», означает, что скорость роста таких клеток может, в некоторых воплощениях, по меньшей мере, статистически должно значительно отличаться от скорости роста необработанных клеток. Такие термины могут быть применены в данном описании, например, к скорости пролиферации.

Фраза «ингибирование роста или пролиферации» гиперпролиферативной клетки, например, неопластической клетки, относится к замедлению, прерывание, задержке или прекращению ее роста и метастазирования, и необязательно означает полное устранение неопластического роста.

Термин «раковая клетка» охватывает определения, широко известные в данной области техники. В одном воплощении этот термин относится к аномально регулируемой клетке, которая может способствовать клиническому состоянию рака у человека или животного. В некоторых воплощениях этот термин может относиться к культивируемой клеточной линии или клетке внутри тела или выделенной из тела человека или животного. Раковая клетка может относиться к самым разнообразным дифференцированным клеткам, тканям, типам органов, известным в данной области, а также описанным в данной заявке.

Таким образом, термин «рак» в целом относится к любому из группы более чем 100 заболеваний, вызванных неконтролируемым ростом аномальных клеток. Рак может проявляться в виде солидных опухолей и лимфом, и несолидных опухолей, таких как лейкоз. В отличие от нормальных клеток, которые воспроизводятся до созревания и затем, только по мере необходимости, чтобы заменить старые клетки, раковые клетки могут расти и делиться бесконечно, вытесняя соседние клетки и, в конечном итоге, распространяться на другие части тела.

Изобретение относится к способам лечения рака и раковых состояний. Термин «раковое состояние» относится к любому состоянию, когда клетки находятся в анормальном состоянии или состоянии, которое характеризуется быстрым распространением или неоплазией. Раковое состояние может быть злокачественным или доброкачественным (например, предраковое состояние) по сути. Для дальнейшего описания «ракового состояния» могут использоваться термины «гиперпролиферативный», «гиперплазивный», «гиперплазия», «злокачественная», «неопластическая» и «неоплазия». Эти термины могут использоваться взаимозаменяемо и предполагаются включающими в себя все типы гиперпролиферативного роста, гиперпластического роста, раковые новообразования или онкогенные процессы, метастатические ткани или злокачественно трансформированные клетки, ткани или органы, независимо от гистологического типа, стадии инвазии или детерминации раковых опухолей (например, злокачественные и доброкачественные).

Термин «неоплазия» относится к росту новых клеток, который приводит к потере чувствительности к нормальному контролю роста, например, неопластический рост клеток. «Гиперплазия» относится к клеткам, подвергающимся аномально высоким скоростям роста. Тем не менее, эти термины могут использоваться взаимозаменяемо, в зависимости от контекста, ссылаясь как правило, на клетки, испытывающие аномальную скорость роста клеток. «Неоплазии» и «гиперплазии» включают в себя опухоли, которые могут быть доброкачественными, предраковыми, преинвазивными, злокачественными, солидными или несолидными.

Было установлено, что соединения, описанные в заявке, особенно эффективны для лечения рака головного мозга. Рак мозга включает в себя, не ограничиваясь, олигодендроглиомы и глиобластомы, в том числе мультиформную глиобластому (GBM). Ткани, поражаемые раковыми клетками, могут находиться в самом мозге (например, в черепе или центральном спинномозговом канале) или в лимфатической ткани, в кровеносных сосудах, в черепно-мозговых нервах, в мозговых оболочках (мозговая оболочка головного или спинного мозга), черепе, гипофизе или шишковидном теле. Конкретные формы рака мозга, которые можно лечить, включают астроцитомы, хондромы, хондросаркомы, хордомы, лимфомы ЦНС (центральной нервной системы), краниофарингиомы, эпендимомы, ганглиоглиомы, ганглионевромы (также называемые ганглиоцитомы), глиомы, в том числе астроцитомы, олигодендроглиомы и эпендимомы, гемангиобластомы (также называемые сосудистыми опухолями), примитивные нейроэктодермальные опухоли (PNET), такие как медуллобластомы, менингиомы и вестибулярные шванномы (ранее известные как акустические невриномы/шванномы).

Соединения, описанные в данной заявке, также можно использовать для лечения метастатических опухолей, которые поражают внутричерепную область из-за роста опухоли, происходящего в других органах тела. Эти состояния, как правило, называют вторичными опухолями головного мозга. Вторичные опухоли головного мозга, которые можно лечить соединением, описанным в данной заявке, включают в себя метастатические опухоли головного мозга, источником которых являются рак легкого, рак молочной железы, злокачественная меланома, рак почки, рак толстой кишки и прочие карциномы.

Другие примеры раковых состояний, которые находятся в пределах объема настоящего изобретения, включают, не ограничиваясь, нейробластомы и остеогенные карциномы (например, рак кости или неопластический рост ткани в кости). Примеры злокачественных первичных опухолей костей, которые можно лечить соединением, описанным в данной заявке, включают в себя остеосаркомы, хондросаркомы, саркому Юинга, фибросаркомы и т.п., и вторичные опухоли костей, такие как метастатические поражения, которые распространяются от других органов, в том числе карциномы груди, легкого и предстательной железы.

Термины алкил, циклоалкил, алкенил, арил, аминогруппы, алкокси, гало, галогеналкил, гетероарил, гетероцикл и сложный эфир хорошо известны в данной области техники и имеют в данной области техники те определения, которые описаны в Заявке US №2012/0040995 (Hergenrother et al.).

Например, термин «алкил» относится к монорадикальной разветвленной или неразветвленной насыщенной углеводородной цепи, предпочтительно имеющей от 1 до 22 атомов углерода, и к циклоалкильным группам, содержащим одно или более колец, имеющих от 3 до 22 атомов углерода. Короткие алкильные группы - это группы, имеющие от 1 до 6 атомов углерода, включающие в себя метильную, этильную, пропильную, бутильную, пентильную и гексильную группы, включая все их изомеры. Длинные алкильные группы - это группы, которые имеют 8-22 атомов углерода, и предпочтительно имеющие 12-22 атомов углерода, а также те, которые имеют 12-20 и те, которые имеют 16-18 атомов углерода.

Таким образом, термин «алкил» может относиться к монорадикальной разветвленной или неразветвленной насыщенной углеводородной цепи, предпочтительно имеющей от 1 до 22 атомов углерода. Короткие алкильные группы - это группы, имеющие от 1 до 12 атомов углерода, включающие в себя метильные, этильные, пропильные, бутильные, пентильные и гексильные группы, в том числе все их изомеры. Длинные алкильные группы - это группы, которые имеют 12-22 атомов углерода. Группа может быть концевой группой или мостиковой группой.

Алкильные, гетероалкильные, арильные, гетероарильные и гетероциклические группы, и циклические и/или ненасыщенные их варианты, могут быть R-группами формулы I, и каждая группа может быть необязательно замещена. Таким образом, в различных воплощениях, один или более из нижеуказанных заместителей может быть R-группой (например, R¹, R², R², R¹⁰, R²⁰, R³⁰ и т.д.) группы или структурной формулы, описанной в данной заявке. Термин «замещенный» означает, что один или несколько атомов водорода в группе, определенной выражением «замещенный», заменен на «заместитель». Число, относящееся к «один или более», может быть очевидным из фрагмента, один из которых замещает заместитель. Например, «один или более» может относиться, например, к 1, 2, 3, 4, 5 или 6; в некоторых воплощениях - к 1, 2 или 3; а в других воплощениях - к 1 или 2. Заместитель может быть одним из выбранных из упомянутых групп, или он может быть соответствующей группой, известной специалистам в данной области техники, при условии, что нормальная валентность замещенного атома не превышена и что замещение приводит к стабильному соединению. Подходящие замещающие группы включают, например, алкил, алкенил, алкинил, алкокси, галоген, галогеналкил, гидрокси, гидроксиалкил, арил, ароил, (арил)алкил (например, бензил или фенилэтил), гетероарил, гетероцикл, циклоалкил, алканоил, алкоксикарбонил, амино, алкиламино, диалкиламино, трифторметил, трифторметокси, трифторметилтио, дифторметил, ациламино, нитро, карбокси, карбоксиалкил, кето, тиоксо, алкилтио, алкилсульфинил, алкилсульфонил, арилсульфинил, арилсульфонил, гетероарилсульфинил, гетероарилсульфонил, гетероциклосульфинил, гетероциклосульфонил, фосфат, сульфат, гидроксиламин, гидроксил (алкил)амин и циано. Кроме того, соответствующими замещающими группами могут быть, например, -X, -R, -O^-, -OR, -SR, -S^-, -NR₂, -NR₃, =NR, -CX₃, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO₂, =N₂, -N₃, -NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NRR, -S(=O)₂O^-, -S(=O)₂OH, -S(=O)₂R, -OS(=O)₂OR, -S(=O)₂NR, -S(=O)R, -OP(=O)O₂RR, -P(=O)O₂RR, -P(=O)(O^-)₂, -P(=O)(OH)₂, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O^-, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR, -C(S)NRR или -C(NR)NRR, где каждый X независимо означает галоген («гало»): F, Cl, Br, или I; и каждый R независимо представляет собой Н, алкил, арил, (арил)алкил (например, бензил), гетероарил, (гетероарил)алкил, гетероцикл, гетероцикл(алкил) или защитную группу. Как будет легко понятно специалисту в данной области техники, когда заместитель означает кето (=O) или тиоксо (=S), или тому подобное, то заменяются два атома водорода на замещенном атоме. В некоторых воплощениях один или более из вышеупомянутых заместителей могут быть исключены из группы потенциальных значений заместителей на замещенной группе, такой как R-группа (например, R¹, R², R², R¹⁰, R²⁰, R³⁰ и т.д.) группы или формулы, описанной в данной заявке.

Термин «циклоалкил» относится к циклической алкильной группе, содержащей от 3 до 22 атомов углерода, имеющей одно циклическое кольцо или несколько конденсированных колец. Циклоалкильные группы включают в себя группы, имеющие 3-8 членные кольца и группы, имеющие 5 и 6 членные кольца. Циклоалкильные группы включают в себя, в качестве примера, моноциклические структуры, такие как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклооктил и тому подобное, или мультициклические структуры, такие как адамантанил, и тому подобное.

Термин «алкенил» относится к монорадикальной разветвленной или неразветвленной ненасыщенной углеводородной группе, предпочтительно имеющей от 2 до 22 атомов углерода, и циклоалкенильной группе, имеющим одно или более колец, имеющей от 3 до 22 атомов углерода, в которой, по меньшей мере, одно кольцо содержит двойную связь. Алкенильные группы могут содержать одну или несколько двойных связей (C=C), которые могут быть сопряжены. Предпочтительными алкенильными группами являются те, которые имеют 1 или 2 двойные связи. Короткие алкенильные группы - это те группы, которые имеют от 2 до 6 атомов углерода, такие группы, как этилен (винил) пропилен, бутилен, пентилен и гексилен, в том числе все их изомеры. Длинные алкенильные группы - это группы, имеющие 8-22 атомов углерода, и предпочтительно имеющие 12-22 атомов углерода, а также имеющие 12-20 атомов углерода, и имеющие 16-18 атомов углерода. Термин «циклоалкенил» означает циклические алкенильные группы, содержащие от 3 до 22 атомов углерода, имеющие одно циклическое кольцо или несколько конденсированных колец, в которых, по меньшей мере, одно кольцо содержит двойную связь (C=C). Циклоалкенильные группы включают в себя, в качестве примера, моноциклические структуры, такие как циклопропенил, циклобутенил, циклопентенил, циклооктенил, циклооктадиенил и циклооктатриенил. Термин «аллил» относится к алкенильной группе -CH₂-CH=CH₂.

Термин «алкинил» относится к монорадикалу ненасыщенного углеводорода, предпочтительно имеющему от 2 до 22 атомов углерода, и имеющему одну или несколько тройных связей (C≡C). Алкинильные группы включают в себя этинил, пропаргил и тому подобное. Короткие алкинильные группы - это группы, имеющие от 2 до 6 атомов углерода, включая все их изомеры. Длинные алкинильные группы - это группы, имеющие 8-22 атомов углерода, и предпочтительно имеющие 12-22 атомов углерода, а также имеющие 12-20 атомов углерода, и имеющие 16-18 атомов углерода.

Термин «арил» относится к группе, содержащей ненасыщенную ароматическую карбоциклическую группу, содержащую от 6 до 22 атомов углерода, имеющей одно кольцо (например, фенил), одно или несколько колец (например, бифенил) или множественные конденсированные (слитые) кольца, где по меньшей мере одно кольцо является ароматическим (например, нафтил, дигидрофенантренил, флуоренил или антрил). Арилы включают в себя фенил, нафтил и тому подобное. Арильные группы могут содержать части, которые представляют собой алкил, алкенил или алкинил в дополнение к ненасыщенному ароматическому кольцу (кольцам). Термин «алкарил» относится к арильным группам, содержащим алкильные части, т.е. алкилен-арил и замещенный алкилен-арил. Такие алкарильные группы в качестве примера содержат бензил (-CH₂-фенил), фенетил и тому подобное.

Алкильные, алкенильные, алкинильные и арильные группы необязательно замещены, как описано в настоящей заявке (термин(ы) может(гут) включать в себя замещенные варианты), и могут содержать 1-8 неводородных заместителей в зависимости от числа атомов углерода в группе и степени ненасыщенности группы. Все такие переменные, описанные в заявке, могут быть незамещенными (в которых любые переменные группы, которые могут быть водородом, представляют собой водород) или замещенными одним или более неводородными заместителями, выбранными из галогена, в том числе фтора, хлора, брома или йода, C1-C3 галогеналкила, гидроксила (OH), тиола (HS-), C1-C6-алкила, C1-C3-алкила, C1-C6-алкокси, C1-C3-алкокси, фенила, бензила, алкенила, C2-C4 алкенила, алкинила, C2-C4-алкинила, -NH₂, -NR'H, -NR'R'', R''CO-, R'R''NCO-, R'CO-NH-, или R'CO-NR'-, где R' и R'' представляют собой C1-C6-алкил, C1-C3-алкил или фенил.

Термин «амино» относится к группе -NH₂ или группе -NR'R'', где каждый R' и R'' независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, алкильной или арильной группы.

«Галогеналкил» относится к алкилу, как определено в данном описании, замещенный одной или более группами галогена, как определено в данном описании, которые могут быть одинаковыми или различными. Типичные галогеналкильные группы включают в себя, в качестве примера, трифторметил, 3-фтордодецил, 12,12,12-трифтордодецил, 2-бромоктил, 3-бром-6-хлоргептил, и тому подобное.

Термин «гетероарил» относится к ароматической группе, содержащей от 2 до 22 атомов углерода, имеющей от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из кислорода, азота и серы в пределах по меньшей мере одного кольца (если содержит более одного кольца). Гетероарильные группы могут быть необязательно замещенными. Гетероарильные группы включают, среди прочего, группы, которые имеют 5 и 6-членные кольца и группы, которые имеют один или два атома азота в кольце, группы, имеющие один или два атома кислорода в кольце, а также группы, имеющие один или два атома серы в кольце.

Термин «гетероцикл» или «гетероциклический» относится к монорадикальной насыщенной или ненасыщенной группе, имеющей одно кольцо или несколько конденсированных колец, от 2 до 22 атомов углерода и от 1 до 6 гетероатомов, предпочтительно - от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из азота, серы, фосфора и/или кислорода в пределах по меньшей мере одного кольца. Гетероциклические группы могут быть замещенными. Кольца предпочтительно имеют 3-10 членов, и, более конкретно, имеют 5 или 6 членов.

Термин «сложный эфир» относится к химическим соединениям, понимаемым в данной области техники и, в частности, может включать в себя группы вида (RCO-).

Соединения по настоящему изобретению включают в себя все новые стереохимические изомеры, возникающие вследствие замещения описанных соединений.

Фармацевтические составы

Соединения, описанные в данной заявке, можно использовать для получения терапевтических фармацевтических композиций. Соединения могут быть добавлены в композиции в форме соли или сольвата. Например, в тех случаях, когда соединения являются достаточно основными или кислотными, чтобы образовывать стабильные соли нетоксичных кислот или оснований, введение соединений в виде солей может быть целесообразным. Примерами фармацевтически приемлемых солей являются органические кислотно-аддитивные соли, образованные с кислотами, которые образуют физиологически приемлемый анион, например тозилат, метансульфонат, ацетат, цитрат, малонат, тартрат, сукцинат, бензоат, аскорбат, α-кетоглутарат и β-глицерофосфат. Также могут быть образованы подходящие неорганические соли, включающие в себя гидрохлорид, галогенид, сульфат, нитрат, бикарбонат и карбонатные соли.

Фармацевтически приемлемые соли можно получить при помощи стандартных методик, хорошо известных в данной области техники, например, путем реакции достаточно основного соединения, такого как амин, с подходящей кислотой, чтобы получить физиологически приемлемое ионное соединение. Соли щелочного металла (например, натрия, калия или лития) или щелочноземельного металла (например, кальция) карбоновых кислот также можно получить с помощью аналогичных методов.

Соединения формул, описанные в данной заявке, могут быть составлены в виде фармацевтических композиций, и введены хозяину-млекопитающему, такому как человек-пациент, в различных формах. Формы могут быть специально адаптированы к выбранному пути введения, например, перорального или парентерального введения, внутривенного, внутримышечного, местного или подкожного.

Соединения, описанные в данной заявке, могут систематически вводиться в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем, таким как инертный разбавитель или усваиваемый съедобный носитель. Для перорального введения соединения может быть заключено в твердые или Мягкие желатиновые капсулы, спрессовано в таблетки или включено непосредственно в диету пациента. Соединения также могут быть объединены с одним или более эксципиентами и использованы в виде таблеток для приема внутрь, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, пластин и тому подобное. Такие композиции и лекарственные средства обычно содержат по меньшей мере 0,1% активного соединения. Процент композиций и лекарственных средств может варьироваться и обычно может быть от приблизительно 2% до приблизительно 60% от массы данной единичной лекарственной форме. Количество активного соединения в таких терапевтически полезных композициях таково, что можно получить эффективное дозированное лекарственное средство.

Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и тому подобное могут также содержать один или более из следующих компонентов: связующие, такие как трагакантовая камедь, гуммиарабик, кукурузный крахмал или желатин; наполнители, такие как дикальцийфосфат; дезинтегрирующий агент, такой как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и тому подобное; и смазки, такие как стеарат магния. Но может быть добавлен подсластитель, такой как сахароза, фруктоза, лактоза или аспартам; или вкусовое вещество, такое как мята перечная, масло грушанки или вишневый ароматизатор. Когда единичная дозированная лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать, в дополнение к веществам указанного выше типа, жидкий носитель, такой как растительное масло или полиэтиленгликоль. Различные другие вещества могут присутствовать в качестве покрытий или для модификации физической формы твердой единичной дозированной лекарственной формы. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты желатином, воском, шеллаком или сахаром и тому подобным. Сироп или эликсир может содержать активное соединение, сахарозу или фруктозу в качестве подслащивающего агента, метил- и пропил-парабены в качестве консервантов, краситель и ароматизатор, например вишневый или апельсиновый. Любое вещество, используемое для получения любой дозированной единичной лекарственной формы, должно быть фармацевтически приемлемым и по существу нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, активное соединение может быть включено в препараты и изделия с замедленным высвобождением.

Активное соединение может быть введено внутривенно или внутрибрюшинно путем инфузии или инъекции. Растворы активного соединения или его соли можно получить в воде, необязательно, в смеси с нетоксичным поверхностно-активным веществом. Дисперсии можно приготовить в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, триацетине или их смеси, или в фармацевтически приемлемом масле. При обычных условиях хранения и использования препарат может содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические лекарственные формы, пригодные для инъекции или инфузии, могут включать в себя стерильные водные растворы, дисперсии или стерильные порошки, содержащие активный ингредиент, приспособленный для приготовления стерильных инъекций или растворов или дисперсий для вливаний, необязательно инкапсулированные в липосомы. Конечная лекарственная форма должна быть стерильной, текучей и стабильной в условиях производства и хранения. Жидкий носитель или наполнитель может представлять собой растворитель или жидкую дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкие полиэтиленгликоли и т.п.), растительные масла, нетоксичные сложные эфиры глицерина и их подходящие смеси. Требуемую текучесть можно поддерживать, например, путем образования липосом, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий или путем использования поверхностно-активных веществ. Предотвращения воздействия микроорганизмов можно достичь с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тиомерсала и тому подобное. Во многих случаях предпочтительно включать изотонические агенты, например, сахара, буферы или хлорид натрия. Пролонгированного всасывания инъекционных композиций можно достичь с помощью агентов, задерживающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и/или желатина.

Стерильные инъекционные растворы можно приготовить введением активного соединения в необходимое количество соответствующего растворителя с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, по мере необходимости, с последующим фильтрованием. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов, способы получения могут включать в себя методики вакуумной сушки и лиофилизации, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желательный ингредиент, присутствующий в ранее стерильно отфильтрованных растворах.

Для местного применения соединения можно применять в чистом виде, например, когда они являются жидкостями. Тем не менее, как правило, будет желательно вводить активный агент на кожу в виде препарата или состава, например, в сочетании с дерматологически приемлемым носителем, который может быть твердым или жидким.

Полезные твердые носители включают в себя тонко измельченные твердые вещества, такие как тальк, глину, микрокристаллическую целлюлозу, диоксид кремния, оксид алюминия и тому подобное. Полезные жидкие носители включают в себя воду, диметилсульфоксид (ДМСО), спирты, гликоли или водно-спиртовую смесь/гликоль, в котором соединение можно растворить или диспергировать в эффективных уровнях, если требуется с помощью нетоксичных поверхностно-активных веществ. Адъюванты, такие как ароматизаторы и дополнительные противомикробные агенты, можно добавить, чтобы оптимизировать свойства для данного вида применения. Полученные жидкие препараты можно применять посредством абсорбирующих прокладок, используемых для пропитки бинтов, и других повязок или распылять на пораженный участок с помощью насосного или аэрозольного распылителя.

Загустители, такие как синтетические полимеры, жирные кислоты, соли жирных кислот и сложных эфиров, жирных спиртов, модифицированные целлюлозы или модифицированные минеральные материалы также можно использовать с жидкими носителями для формирования растекающихся паст, гелей, мазей, мыла и т.п., для нанесения непосредственно на кожу пользователя.

Примеры дерматологических композиций для доставки активных агентов к коже известны в данной области техники; например, см. патенты США №4,992,478 (Geria), 4,820,508 (Wortzman), 4,608,392 (Jacquet et al.) и 4,559,157 (Smith et al.). Такие дерматологические препараты можно использовать в комбинации с описанными в данной заявке соединениями, где ингредиент таких композиций можно, если требуется, заменить соединением, описанным в данной заявке, или соединение, описанное в данной заявке, можно добавить в препараты.

Полезные дозировки соединений, описанных в данной заявке, могут быть определены путем сравнения их активности in vitro и in vivo на животных моделях. Способы экстраполяции эффективных доз у мышей и других животных, в организме человека, известны в данной области техники; например, см. US 4,938,949 (Borch et al.). Количество соединения или активной соли или его производного, необходимое для использования при лечении, варьируется в зависимости не только от конкретного выбранного соединения или соли, но также от пути введения, природы состояния, подлежащего лечению, возраста и состояние пациента, и будет в конечном счете, оставлено на усмотрение лечащего врача или клинического специалиста.

Соединение приемлемо вводить в дозированной лекарственной форме, например, содержащей от 5 до 1000 мг/м², преимущественно от 10 до 750 мг/м², наиболее преимущественно - от 50 до 500 мг/м² активного ингредиента на одну дозированную лекарственную форму. Требуемая доза может быть удобно представлена в виде разовой дозы или в виде разделенных доз, вводимых через соответствующие интервалы, например, в виде двух, трех, четырех или более малых доз в сутки. Сами малые дозы могут быть разделены, например, на несколько дискретных слабо разнесенных введений.

Соединения, описанные в данной заявке, могут быть эффективными противоопухолевыми агентами и иметь более высокую эффективность и/или пониженную токсичность по сравнению с PAC-1. Соединения изобретения могут быть более мощными и менее токсичными, чем PAC-1, и/или избегать потенциального центра катаболического метаболизма, встречаемого у PAC-1, т.е., они имеют другой метаболический профиль, нежели PAC-1.

Настоящее изобретение относится к терапевтическим способам лечения рака у млекопитающего, которые включают введение млекопитающему, имеющему рак, эффективного количества соединения или композиций, описанных в данной заявке. Млекопитающее включает в себя приматов, человека, грызунов, собак, кошек, крупный рогатый скот, овец, лошадей, свиней, коз, крупный рогатый скот и тому подобное. Рак относится к любому различному типу злокачественного новообразования, например, раку толстой кишки, раку молочной железы, меланоме и лейкозу, и в целом характеризуется нежелательной пролиферацией клеток, например, нерегулируемым ростом, отсутствием дифференциации, местной инвазией ткани и метастазами.

Способность соединения изобретения лечить рак можно определить с помощью анализов, хорошо известных в данной области техники. Например, тип протоколов лечения, оценка токсичности, анализ данных, количественная оценка гибели опухолевых клеток и биологическая значимость использования трансплантируемых опухолевых экранов известны. Кроме того, способность соединения лечить рак можно определить с помощью испытаний, как описано ниже.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации данного изобретения и не должны быть истолкованы как ограничивающие его объем. Специалист в данной области техники легко поймет, что эти примеры показывают много других способов, которыми изобретение можно осуществить на практике. Следует понимать, что многочисленные изменения и модификации можно внести, оставаясь в пределах объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Общая методика синтеза аналогов PAC-1

В пробирки 16×150 мм добавляют гидразид (1,7 экв.), альдегид (1,0 экв.), 2-этоксиэтанол (1 мл) и 1,2 М раствор HCl (10 моль %). Пробирки встряхивают на параллельном синтезаторе фирмы Büchi Syncore при 110°C, пока весь альдегид не вступит в реакцию (контроль по данным МС-ИЭ). Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры (~23°С) и добавляют полистирол-бензальдегид (3,5 экв.). Реакционную смесь встряхивают при 25-80°C до тех пор, пока не остается гидразида (контроль по данным МС-ИЭ). Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, а смолу фильтруют и промывают 2-этоксиэтанолом. Фильтрат сушат в высоком вакууме с получением аналога PAC-1.

Пример 2. Параллельный синтез аналогов PAC-1

Реакции, требующие безводных условий, проводят в положительной атмосфере азота или аргона в высушенной в печи стеклянной посуде. Стандартные методики шприцев используют для безводного добавления жидкостей. Если не указано иное, все исходные вещества, растворители, и реагенты приобретают из коммерческих источников и используют без дополнительной очистки. Флэш-хроматографию проводят с использованием силикагеля 230-400 меш. Соединения 1{1}, 1{2}, 1{3}, 1{4}, 1{5}, 1{6}, 2{24}, 2{25}, 2{26} и PAC-1 синтезируют, как упоминалось ранее.

Анализ соединения. ЯМР-эксперименты регистрируют либо в CDCl₃ (Sigma), CD₃OD (Sigma) или (CD₃)₂CO (Sigma) на спектрометре Varian Unity 400 МГц или 500 МГц с остаточным недейтерированным растворителем в качестве внутреннего стандарта для экспериментов ¹H-ЯМР и ¹³C-ЯМР и 1% CFCl₃/CDCl₃ - в качестве внешнего стандарта для экспериментов ¹⁹F-ЯМР. Приведены химический сдвиг, δ (мд); константы взаимодействия, J (Гц); мультиплетность (s = синглет, d = дублет, t = триплет, q = квартет, m = мультиплет, br = уширенный); и интеграция. Данные масс-спектрометрии высокого разрешения были зарегистрированы на гибридном квадрупольном / время-пролетном масс-спектрометре с ионизации электрораспылением фирмы Micromass Q-TOF Ultima в Лаборатории масс-спектрометрии Университета штата Иллинойс.

Общая методика А: Синтез 1-бензилпиперазинов. Безводный пиперазин (6,0 экв.) суспендируют в ТГФ (0,45 М бензил галогенида). Смесь нагревают при кипячении с обратным холодильником до полного растворения пиперазина. После растворения к реакционной смеси добавляют замещенный бензилгалогенид (1,0 экв.). Сразу же образуется белое твердое вещество. Реакционную смесь перемешивают при кипячении с обратным холодильником в течение 2,5 часов. Смесь охлаждают до комнатной температуры. Твердое вещество отфильтровывают и промывают ТГФ и этилацетатом. Объединенные фильтраты концентрируют до 10% от исходного объема. Концентрат выливают в делительную воронку с 5%-ным рассолом/H₂O подщелачивая (pH>12) с помощью KOH. Водный слой экстрагируют дихлорметаном и этилацетатом. Органические слои объединяют, сушат над Na₂SO₄ и концентрируют. Сырой продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с получением чистого 1-бензилпиперазина.

Общая методика В: Синтез этиловых эфиров. Замещенный 1-бензилпиперазин (1,0 экв.) растворяют в ацетоне (0,5 М), и хлороформ добавляют к некоторому количеству реакционной смеси по мере необходимости, чтобы полностью растворить 1-бензилпиперазин. Раствор NaHCO₃ (1,25 экв.) добавляют, и смесь перемешивают при комнатной температуре. Этилхлорацетат (1,1 экв.) затем добавляют по каплям. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при кипячении с обратным холодильником. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры. Твердое вещество отфильтровывают и промывают ацетоном. Фильтрат концентрируют. Сырой продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с получением чистого этилового эфира.

Общая методика С: Синтез гидразидов. Замещенный этил 2-(4-бензилпиперазин-1-ил)ацетат (1,0 экв.) растворяют в этаноле (0,5 М). Раствор перемешивают, и безводный гидразин (3,0-4,0 экв.) добавляют по каплям. Реакционную смесь перемешивают при кипячении с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Концентрат переносят в делительную воронку, содержащую 1:1 рассол: H₂O подщелачивают (pH>12) с помощью KOH. Водный слой экстрагируют дихлорметаном (3×) и этилацетатом (1×). Объединенные органические слои сушат над MgSO₄ и концентрируют. Сырой продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле или перекристаллизацией с получением чистого гидразида.

Соответствующие 1-бензоилпиперазины можно получить аналогичными способами, например, как описано и проиллюстрировано здесь, используя соответствующие необязательно замещенные бензоилгалогениды или бензойные кислоты, и амидобразующие условия, такие как аминное основание (например, Et₃N), или EDC-HCl и DMAP.

Различные полезные подготовительные способы описаны в заявках US №2011/0257398 (Hergenrother et al.), №2012/0040995 (Hergenrother et al.) и №2013/0096133 (Hergenrother et al.). Изобретение также относится к соединениям, описанным в вышеприведенных публикациях, где дистальный атом азота пиперазина в гидразидном фрагменте присоединяется к карбонилу в отличие от метилена.

Схема В. Исходные вещества, используемые для синтеза гидразидов.

Один из примеров общей методики синтеза описан ниже.

1-(4-(трет-бутил)бензил)пиперазин (5{20})

Синтезируют в соответствии с общей методикой А: 4-трет-бутилбензил бромид (4{20}, 4,05 мл, 22,0 ммоль, 1 экв.), пиперазин (11,4 г, 132,1 ммоль, 6 экв.), ТГФ (48,1 мл). Очистка с помощью флэш-хроматографии на колонке с силикагелем (4:1 этилацетат: метанол) дает 5{20} (3,75 г, 73%) в виде бежевого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃): δ 7,30 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,22 (d, 2H, J=8,5 Гц), 3,44 (s, 2H), 2,85 (t, 4H, J =5,0 Гц), 2,38 (br s, 4H), 1,54 (br s, 1H), 1,29 (s, 9H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃): δ 149,6, 134,7, 128,7, 124,8, 63,1, 54,3, 45,9, 34,2, 31,2.

Этил 2-(4-(4-(трет-бутил)бензил)пиперазин-1-ил)ацетат (6{20})

Синтезируют в соответствии с общей методикой В: 5{20} (3,46 г, 14,9 ммоль, 1 экв.), этилхлорацетат (1,8 мл, 16,4 ммоль, 1,1 экв.), NaHCO₃ (1,56 г, 18,6 ммоль, 1,25 экв.), ацетон (29,8 мл), хлороформ (10 мл). Очистка с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (1:1 гексан:этилацетат) дает 6{20} (4,25 г, 90%) в виде оранжевого масла. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃): δ 7,31 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,21 (d, 2H, J=8,5 Гц), 4,16 (d, 2H, J=7,0 Гц), 3,48 (s, 2H), 3,18 (s, 2H), 2,58 (br, 4H), 2,51 (br s, 4H), 1,29 (s, 9H), 1,24 (t, 3H, J=7,0 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃): δ 170,1, 149,7, 134,7, 128,8, 124,9, 62,5, 60,4, 59,4, 53,0, 52,6, 34,3, 31,3, 14,1.

2-(4-(4-(трет-бутил)бензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (1{20})

Синтезируют в соответствии с общей методикой С: 6{20} (4,12 г, 12,9 ммоль, 1 экв.), безводный гидразин (1,2 мл, 38,8 ммоль, 3 экв.), этанол (26,0 мл). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (4:1 этилацетат:метанол) дает 1{20} (3,36 г, 84%) в виде бежевого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃): δ 8,17 (s, 1H), 7,31 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,20 (d, 2H, J=8,5 Гц), 3,85 (br s, 2H), 3,46 (s, 2H), 3,05 (s, 2H), 2,52 (br s, 4H), 2,45 (br s, 4H), 1,30 (s, 9H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃): δ 170,4, 149,9, 134,5, 128,7, 125,0, 62,4, 60,5, 53,5, 52,9, 34,3, 31,3.

N'-(3-аллил-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-(трет-бутил)бензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид {3{20, 24})

К перемешиваемому раствору гидразида 1{20} (100 мг, 0,33 ммоль, 1,0 экв.) и альдегида 2{24} (53,5 мг, 0,33 ммоль, 1,0 экв.) в этаноле (2,2 мл, 0,15 М) добавляют 1,2 М раствор HCl (7 моль %). Реакционную смесь перемешивают при кипячении с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Сырой продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-10% метанол/этилацетат) с получением 3{20, 24} (102,0 мг, 0,23 ммоль, 68,9%) в виде светло-коричневого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃): δ 11,31 (s, 1H), 10,09 (s, 1H), 8,38 (s, 1H), 7,36 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,25 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,19 (d, 1H, J=7,5 Гц), 7,08 (dd, 1H, J=1,5, 7,5 Гц), 6,85 (t, 1H, J=7,5 Гц), 6,04 (tdd, 1H, J=6,5, 10,0, 16,5 Гц), 5,12-5,06 (m, 2H), 3,52 (s, 2H), 3,47 (d, 2H, J=6,5 Гц), 3,20 (s, 2H), 2,63 (br s, 4H), 2,54 (br s, 4H), 1,33 (s, 9H). ¹³C ЯМР (125 МГц, CDCl₃): δ 165,8, 156,3, 151,1, 150,0, 136,4, 134,6, 132,2, 129,1, 128,7, 128,1, 125,1, 118,9, 116,8, 115,6, 62,5, 60,9, 53,6, 53,0, 34,4, 33,8, 31,3. МСВР (ЭИ): 449,2915 (М+1); рассчитано для C₂₇H₃₇N₄O₂: 449,2917.

Пример 3. Биологическая оценка аналогов PAC-1

Материалы. Все реагенты получают от фирмы Fisher, если не указано иное. Все буферы готовят на воде, очищенной на MilliQ. Ac-DEVD-pNA синтезируют, как описано ранее.⁵ Бульон Лурия (LB) получают от фирмы EMD. Доксорубицин получают от фирмы Sigma. Буфер активности каспазы содержит 50 мМ HEPES, 300 мМ NaCl, 1,5 мм ТСЕР, 0,01% TritonX-100 и обработан Chelex®. Связывающий буферный раствор Ni NTA содержит 50 мМ Трис (pH 8,0), 300 мМ NaCl и 10 мМ имидазола. Промывочный буфер Ni NTA содержит 50 мМ Трис (pH 8,0), 300 мМ NaCl и 50 мМ имидазола. Буфер для элюции Ni NTA содержит 50 мМ Трис (pH 8,0), 300 мМ NaCl и 500 мМ имидазола. Аннексии V-связывающий буфер содержит 10 мМ HEPES pH 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl₂, 0,1% BSA. Белки С-концевой 6×His-меченой прокаспазы-3 экспрессируют, как описано ниже.

Клеточная культура. Клетки U-937 получают из Американской коллекции типовых культур, и выдерживают при низком числе прохождений. Культуры выдерживают в среде RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицином, и культивируют при 37°C и 5% CO₂.

Анализ гибели клеток для начального скрининга. Соединение (2 мкл 10 мМ раствора ДМСО) добавляют в синглет путем непосредственного добавления в лунку, содержащую 998 мкл клеток U-937 (1×10⁶) в среде RPMI 1640 (10% эмбриональной бычьей сыворотки) до конечной концентрации соединения 20 мкм. После инкубирования при 37°C в течение 24 ч клетки переносят в пробирки для проточной цитометрии, промывают и ресуспендируют в Аннексии V связывающем буфере. Клетки подвергают двойному окрашиванию Аннексином-FITC и йодидом пропидия, а клеточную популяцию из, по меньшей мере, 10000 объектов собирают с помощью поточного цитометра LSR II. Процент жизнеспособных клеток (отрицательных по аннексину V, отрицательных по йодиду пропидия) определяют с помощью программного обеспечения PCS Express.

IC₅₀ Анализ гибели клеток через 72 часа. Клетки лимфомы человека U-937 высевали в лунки 96-луночного планшета при плотности 15000 клеток на лунку в среду для выращивания 99 мкл RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина. В каждую лунку добавляют 1 мкл исходных растворов соединений в ДМСО при различных концентрациях таким образом, что клетки обрабатываются соединениями в концентрациях от 0 мкМ до 100 мкМ. Каждую концентрацию тестировали по пять раз на пластине. На каждой пластине в 5 лунках используют 20 мкМ доксорубицина в качестве положительного контроля гибели и в 5 лунках используют 1 мкл ДМСО в качестве отрицательного контроля. Затем планшеты инкубируют при 37°C и 5% CO₂ в течение 72 часов.

После 72-часового периода инкубации планшеты анализируют с использованием теста с сульфородамином В (Vichai and Kirtikara, Nat Protoc 2006, 1, 1112-1116). В частности, в каждую лунку планшета добавляют 25 мкл 50% (вес/объем) раствора трихлоруксусной кислоты в H₂O и планшеты инкубируют в течение 4 часов при 4°C. Затем планшеты осторожно промывают водой пять раз. Планшеты высушивают на воздухе, после чего по 100 мкл 0,057% (вес/объем) сульфородамина В в 1% (об/об) растворе уксусной кислоты добавляют в каждую лунку в течение 30 минут при комнатной температуре. Планшеты осторожно промывают 5 раз 1% (об/об) раствором уксусной кислоты и сушат на воздухе. 200 мкл 10 мМ Трио-основания (pH 10,4) добавляют в каждую лунку и планшеты помещают в орбитальный шейкер на тридцать минут. Уровень сульфородамина В количественно определяют флуорометрическим методом при возбуждении и излучении при длине волны 488 и 585 нм, соответственно, с помощью планшета-радера Molecular Devices, и процент гибели клеток рассчитывают и стандартизируют с положительным контролем (100% гибели клеток) и отрицательным контролем (0% гибели клеток). Процент гибели клеток в среднем и для каждой концентрации соединения наносят на график как функцию от концентрации соединения. Эти данные выводят в логистическую кривую доза-реакция, используя Таблицу кривых 2D, и рассчитывают значение IC₅₀. Эксперимент повторяют три раза, и фиксируют среднее значение вычисленных значений IC₅₀. Стандартную погрешность среднего (SEM) определяют и фиксируют для трех опытов.

Индукция апоптоза посредством найденных соединений. Клетки U-937 (1 мл 6×10⁵ клеток/мл) обрабатывают 10 мкл 750 мкМ растворами соединений в ДМСО, чтобы достичь конечной концентрации 7,5 мкМ. Клетки инкубируют при 37°C в течение 24 часов. Клетки собирают центрифугированием (200 g в течение 5 минут), промывают ФСБ (2 мл), и ресуспендируют в 450 мкл буферного раствора аннексина V. В каждый образец добавляют 3,5 мкл FITC конъюгированного красителя Аннексии V (Southern Biotech) и 3,5 мкл иодида пропидия (Sigma) до конечной концентрации 50 мкг/мл. Клеточные популяции анализировали на проточном цитометре фирмы Benton Dickinson LSR II.

Рекомбинантная экспрессия и очистка прокаспазы-3. Способы, адаптированные Hergenrother с соавторами (Putt et al., Nat Chem Biol 2006, 2, 543-550). 20 мл объема суточной культуры Rosetta Е. со//, содержащей прокаспазо-3 (дикого типа) выраженный плазмид, высеивают в 2 л среды бульона Лурия, содержащей ампициллин.

Культуру выращивают до OD600=1,0, после чего точечную экспрессию белка индуцируют путем добавления ИПТГ (1 мм); культуре дают расти в течение 30 дополнительных минут. Затем клетки собирают (10 минут вращения при 10000×g и ресуспендировали в буфере связывания NTA (300 мМ NaCl, 50 мМ Трис, 10 мМ имидазола, pH 8,0). Клетки лизируют на льду с помощью ультразвука. Клеточный лизат затем центрифугируют при 35000×g в течение 35 мин. Супернатант декантируют и добавляют 1 мл никель-NTA смолы. Клеточный лизат инкубируют в течение 45 минут при 4°C. Смолу загружают на колонку, промывают 10 мл буферного раствора НТА, а затем 10 мл промывочного буфера NTA (300 мМ NaCl, 50 мМ Трис, 50 мМ имидазола, pH 8,0). Белки элюируют в 0,5 мл фракции 10 мл буфера для элюции NTA (300 мМ NaCl, 50 мМ Трис, 500 мМ имидазола, pH 8,0). Фракции, содержащие белок, объединяют и дополнительно очищают, чтобы удалить любые загрязнения цинка с применением белка на колонке PD-10 (GE Healthcare), загруженной буфером активности каспазы, который обрабатывают смолой Chelex®. Полученную концентрацию определяли по методу Эдельхока и при помощи молярного коэффициента поглощения прокаспазы-3 26150 М^-1 см^-1. Запасы белка быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C.

Анализ активности прокаспазы-3. В 384-луночный планшет инкубировали рекомбинантно экспрессированную, не содержащую цинк прокаспазу-3 (дикого типа, в 1 мкм) в буфере активности каспазы (50 мМ HEPES, 300 мМ NaCl, 1,5 мМ ТСЕР, 0,01% TritonX-100), при 37°C в присутствии 3,5 мкм ZnSO₄, и базальную активность оценивали с помощью добавления Ac-DEVD-pNa (конечная концентрация в лунке 200 мкм). Поглощение при 405 нм контролировали с помощью планшета-ридера SpectraMax (Molecular Devices). После определения базальной активности, ДМСО, PAC-1 и аналоги добавляли к каждому образцу до конечной концентрации 25 мкм. Активность каждой обработки оценивалась через 5, 20, 40 и 60 минут с помощью 5-минутных кинетических считываний. Перепад каждого набора данных использовался для определения активности белка. Активность была приведена к процентам активности в каждый момент времени с помощью безцинкового образца и цинк-ингибированного образца, обработанного ДМСО.

Пример 4. Получение соединений

Материалы и способы. Общий. Все реакции, требующие безводных условий, проводят при положительной атмосфере азота или аргона в высушенной в печи стеклянной посуде. Стандартные методики шприцев используют для безводного добавления жидкостей. Если не указано иное, все исходные материалы, растворители, и реагенты приобретают из коммерческих источников и используются без дополнительной очистки. Флэш-хроматографию проводят с использованием силикагеля 230-400 меш. Соединения 46а,¹ 46b,² 46h,³ 47а,² 50,² PAC-1 (1)¹ и S-PAC-1 (2)² были синтезированы, как упоминалось ранее.

Анализ соединений. ЯМР-эксперименты регистрируют либо в CDCl₃ (Sigma или Cambridge), CD₃OD (Sigma) или (CD₃)₂CO (Sigma или Cambridge) на спектрометре Varian Unity 500 МГц с остаточным недейтерированным растворителем в качестве внутреннего стандарта для экспериментов ¹H-ЯМР и ¹³C-ЯМР и 1 C₆F₆ - в качестве внутреннего стандарта для экспериментов ¹⁹F-ЯМР. Приведены химический сдвиг, δ (мд); константы взаимодействия, J (Гц); мультиплетность (s = синглет, d = дублет, t = триплет, q = квартет, m = мультиплет, br = уширенный); и интеграция. Данные масс-спектрометрии высокого разрешения были зарегистрированы на гибридном квадрупольном/время-пролетном масс-спектрометре с ионизации электрораспылением фирмы Micromass Q-TOF Ultima или Micromass 70-VSE в Лаборатории масс-спектрометрии Университета штата Иллинойс.

Общая методика А: Синтез диалкилированных пиперазинов. В круглодонную колбу добавляют бензил галогенид (1,0 экв.), K₂CO₃ (3,0 экв.) и ацетон (0,2 M). Смесь перемешивают и добавляют соединение 50 (1,5 экв.). Реакционную смесь перемешивают при кипячении с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры. Твердое вещество отфильтровывают и промывают ацетоном. Фильтрат концентрируют, и продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле.

Общая методика В: Синтез амидов. В круглодонную колбу, высушенную в сушильном шкафу, добавляют соединение 50 (1,0 экв.), безводный тетрагидрофуран (0,2 M), и свежеперегнанный Et₃N (2,0 экв.). Раствор перемешивают при 0°C в атмосфере N₂ и добавляют хлористый бензоил (1,0 экв.). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере N₂. Реакционную смесь разбавляют этилацетатом и промывают насыщенным раствором NaHCO₃ (2 раза), H₂O и рассолом. Органический слой сушат над MgSO₄, фильтруют и концентрируют. Продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле.

Общая методика С: Синтез гидразидов. В круглодонную колбу добавляют этиловый эфир (1,0 экв.) и этанол или смесь 2:1 этанол: метанол (0,5 M). Раствор перемешивают, и безводный гидразин (4,0 экв.) добавляют по каплям. Реакционную смесь перемешивают при кипячении с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют. Полученный остаток распределяют между CH₂Cl₂/1:1 насыщенным раствором соли: 0,1 М KOH. Слои разделяют, и водный слой экстрагируют CH₂Cl₂(2×). Объединенные органические слои сушат над MgSO₄, фильтруют и концентрируют. Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле или перекристаллизацией дает чистый гидразид.

Этил 2-(4-бензоилпиперазин-1-ил)ацетат (51с)

Синтезируют в соответствии с общей методикой В: 50 (2,45 г, 14,2 ммоль, 1,0 экв.), безводный тетрагидрофуран (70 мл, 0,2 М), свежеперегнанный Et₃N (4,0 мл, 28,4 ммоль, 2,0 экв.), бензоилхлорид (54с, 2,0 г, 1,7 мл, 1,0 экв.). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (50-100% этилацетат/гексан) дает 51с (2,87 г, 73,1%) в виде бледно-желтого масла. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 7,41-7,38 (m, 5H), 4,19 (q, 2H, J=7,0 Гц), 3,85 (br s, 2H), 3,48 (br s, 2H), 3,25 (s, 2H), 2,68 (br s), 2,54 (br s, 2H), 1,27 (t, 3H, J=7,0 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,5, 170,2, 135,9, 129,9, 128,7, 127,3, 61,0, 59,4, 53,3 (br), 52,8 (br), 47,8 (br), 42,1 (br), 14,4. МСВР (ИЭ): 277,1552 (М+1); рассчитано для C₁₅H₂₁N₂O₃: 277,1552.

2-(4-бензоилпиперазин-1-ил)ацетогидразид (46с)

Синтезируют в соответствии с общей методикой С: 51с (2,87 г, 10,4 ммоль, 1,0 экв.), безводный гидразин (1,31 мл, 41,6 ммоль, 4,0 экв.), этанол (20 мл, 0,5 М), 46 с (1,41 г, 51,5%) получают в виде белого твердого вещества без дополнительной очистки после экстракции. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 8,10 (s, 1H), 7.39-7.34 (m, 5H), 3,84 (br s, 2H), 3,77 (br s, 2H), 3,43 (br s, 2H), 3,08 (s, 2H), 2,56 (br s, 2H), 2,44 (br s, 2H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,5, 169,9, 135,5, 130,0, 128,7, 127,1, 60,6, 53,9 (br), 53,4 (br), 47,7 (br), 42,2 (br). МСВР (ИЭ): 263,1513 (М+1); рассчитано для C₁₃H₁₉N₄O₂: 263,1508.

Этил 2-(4-(4-цианобензил)пиперазин-1-ил)ацетат (51d)

Синтезируют в соответствии с общей методикой А: 4-(бромметил)бензонитрил (54d, 2,0 г, 10,2 ммоль, 1,0 экв.), 50 (2,64 г, 15,3 ммоль, 1,5 экв.), K₂CO₃ (4,22 г, 30,6 ммоль, 3,0 экв.), ацетон (50 мл, 0,2 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (50-100% этилацетат/гексаны) дает 51d (2,71 г, 92,3%) в виде желтого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 7,60 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,44 (d, 2H, J=8,0 Гц), 4,18 (d, 2H, J=7,0 Гц), 3,55 (s, 2H), 3,20 (s, 2H), 2,61 (br s, 4H), 2,51 (br s, 4H), 1,26 (t, 3H, J=7,0 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,4, 144,4, 132,3, 129,7, 119,2, 111,0, 62,5, 60,8, 59,6, 53,1 53,1, 14,4. МСВР (ИЭ): 288,1718 (М+1); рассчитано для C₁₆H₂₂N₃O₂: 288,1712.

2-(4-(4-цианобензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (46d)

Синтезируют в соответствии с общей методикой С: 51d (2,71 г, 9,43 ммоль, 1,0 экв.), безводный гидразин (1,18 мл, 37,7 ммоль, 4,0 экв.), этанол (19 мл, 0,5 М). 46d (1,73 г, 67,1%) получают в виде не совсем белого твердого вещества без дополнительной очистки после экстракции. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 8,10 (s, 1H), 7,60 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,43 (d, 2H, J=8,5 Гц), 3,84 (br d, 2H, J=5,0 Гц), 3,55 (s, 2H), 3,08 (s, 2H), 2,55 (br s, 4H), 2,46 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,6, 144,1, 132,4, 129,6, 119,1, 111,2, 62,5, 60,8, 53,8, 53,3. МСВР (ИЭ): 274,1673 (М+1); рассчитано для C₁₄H₂₀N₅O: 274,1668.

Этил 2-(4-(4-цианобензоил)пиперазин-1-ил)ацетат (51е)

Синтезируют в соответствии с общей методикой В: 50 (5,20 г, 30,2 ммоль, 1,0 экв.), безводный тетрагидрофуран (150 мл, 0,2 М), свежеперегнанный Et₃N (8,4 мл, 60,4 ммоль, 2,0 экв.), 4-цианобензоил хлорид (54е, 5,0 г, 30,2 ммоль, 1,0 экв.). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (0-10% метанол/этилацетат) дает 51е (5,95 г, 65,4%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 7,68 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,47 (d, 2H, J=8,0 Гц), 4,14 (d, 2H, J=7,0 Гц), 3,80 (br s, 2H), 3,37 (br s, 2H), 3,23 (s, 2H), 2,67 (br s, 2H), 2,53 (br s, 2H), 1,23 (t, 3H, J=7,0 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,0, 168,3, 140,1, 132,5, 127,9, 118,2, 113,6, 60,9, 59,0, 52,9, 52,3, 47,5, 42,1, 14,3. МСВР (ИЭ): 302,1501 (М+1); рассчитано для C₁₆H₂₀N₃O₃: 302,1505.

2-(4-(4-цианобензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (46е)

Синтезируют в соответствии с общей методикой С с указанной модификацией: 51е (5,59 г., 18,6 ммоль, 1,0 экв.), безводный гидразин (2,4 мл, 74,4 ммоль, 4,0 экв.), этанол (35 мл, 0,5 М). После экстракции CH₂Cl₂, водный слой экстрагируют этилацетатом (3×), 46е (2,98 г, 55,8%) получают в виде не совсем белого твердого вещества без дополнительной очистки после экстракции. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 8,02 (s, 1H), 7,70 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,48 (d, 2H, J=8,5 Гц), 3,86 (br d, 2H, J=3,5 Гц), 3,78 (br s, 2H), 3,37 (br s, 2H), 3,11 (s, 2H), 2,60 (br s, 2H), 2,46 (br s, 2H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,8, 168,4, 139,8, 132,6, 127,9, 118,1, 113,8, 60,6, 53,8 (br), 53,3 (br), 47,6 (br), 42,2 (br). MCBP (ИЭ): 288,1464 (М+1); рассчитано для C₁₄H₁₈N₅O₂: 288,1461.

Этил 2-(4-(4-фторбензил)пиперазин-1-ил)ацетат (51f)

Синтезируют в соответствии с общей методикой А: 4-фторбензилхлорид (54f, 2,5 г, 2,1 мл, 17,3 ммоль, 1,0 экв.), 50 (4,48 г, 26,0 ммоль, 1,5 экв.), K₂CO₃ (7,19 г, 52,0 ммоль, 3,0 экв.), ацетон (90 мл, 0,2 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 50-100% этилацетат/гексаны) дает 51f (3,66 г, 75,4%) в виде желтого масла. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 7.24-7.20 (m, 2H), 6.95-6.91 (m, 2H), 4,13 (d, 2H, J=7,0 Гц), 3,42 (s, 2H), 3,15 (s, 2H), 2,55 (br s, 4H), 2,46 (br s, 4H), 1,21 (t, 3H, J=7,0 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,3, 162,0 (d, J_CF=243,5 Гц), 133,9, 130,6 (d, J_CF=8,0 Гц), 115,0 (d, J_CF=21,0 Гц), 62,2, 60,6, 59,6, 53,1, 52,8, 14,3. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 119,1. MCBP (ИЭ): 281,1659 (М+1); рассчитано для C₁₅H₂₂FN₂O₂: 281,1665.

2-(4-(4-фторбензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (46f)

Синтезируют в соответствии с общей методикой С: 51f (3,0 г, 10,7 ммоль, 1,0 экв.), безводный гидразин (1,4 мл, 42,8 ммоль, 4,0 экв.), этанол (20 мл, 0,5 М) 46f (2,59 г, 91,1%) получают в виде белого твердого вещества без дополнительной очистки после экстракции. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 8,15 (s, 1H), 7.22-7.19 (m, 2H), 6.95-6.91 (m, 2H), 3,84 (s, 2H), 3,40 (s, 2H), 3,01 (s, 2H), 2,47 (br s, 4H), 2,39 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,5, 162,0 (d, J_CF=243,6 Гц), 133,7 (d, J_CF=2,8 Гц), 130,6 (d, J_CF=8,3 Гц), 115,1 (d, J_CF=21,1 Гц), 62,0, 60,6, 53,7, 53,0. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 118,9. MCBP (ИЭ): 267,1630 (М+1); рассчитано для C₁₃H₂₀FN₄O: 267,1621.

Этил 2-(4-(4-фторбензоил)пиперазин-1-ил)ацетат (51g)

Синтезируют в соответствии с общей методикой В: 50 (2,58 г, 15,0 ммоль, 1,0 экв.), безводный тетрагидрофуран (30 мл, 0,5 М), свежеперегнанный Et₃N (4,2 мл, 30,0 ммоль, 2,0 экв.), 4-фторбензоил хлорид (54g, 1,8 мл, 15,0 ммоль, 1,0 экв.). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (50-100% этилацетат/гексан) дает 51g (3,74 г, 84,7%) в виде бледно-желтого масла. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 7,38-7,34 (m, 2H), 7.06-7.01 (m, 2H), 4,13 (d, 2H, J=7,0 Гц), 3,77 (br s, 2H), 3,43 (br s, 2H), 3,21 (s, 2H), 2,61 (br s, 2H), 2,52 (br s, 2H), 1,22 (t, 3H, J=7,0 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,0, 169,4, 163,5 (d, J_CF=248,1 Гц), 131,8, 129,5 (d, J_CF=8,3 Гц), 115,6 (d, J_CF=22,0 Гц), 60,8, 59,1, 52,8 (br), 47,8 (br), 42,2 (br), 14,3. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 113,4. МСВР (ИЭ): 295,1457 (М+1); рассчитано для C₁₅H₂₀FN₂O₃: 295,1458.

2-(4-(4-фторбензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (46g)

Синтезируют в соответствии с общей методикой С: 51g (3,73 г, 12,7 ммоль, 1,0 экв.), безводный гидразин (1,6 мл, 50,8 ммоль, 4,0 экв.), этанол (25 мл, 0,5 M), 46g (2,28 г, 64,1%) получают в виде белого твердого вещества без дополнительной очистки после экстракции. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 8,09 (s, 1H), 7,37-7,33 (m, 2H), 7,06-7,02 (m, 2H), 3,85 (br s, 2H), 3,70 (br s, 2H), 3,42 (br s, 2H), 3,06 (s, 2H), 2,48 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,8, 169,5, 163,5 (d, J_CF=249,1 Гц), 131,5 (d, J_CF=2,8 Гц), 129,4 (d, J_CF=9,1 Гц), 115,7 (d, J_CF=22,0 Гц), 60,6, 53,5 (br), 47,7 (br), 42,3 (br). ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 113,1. МСВР (ИЭ): 281,1409 (М+1); рассчитано для C₁₃H₁₈FN₄O₂: 281,1414.

Этил 2-(4-(4-(трифторметил)бензоил)пиперазин-1-ил)ацетат (51i)

Синтезируют в соответствии с общей методикой В: 50 (2,58 г, 15,0 ммоль, 1,0 экв.), безводный тетрагидрофуран (30 мл, 0,5 M), свежеперегнанный Et₃N (4,2 мл, 30,0 ммоль, 2,0 экв.), 4-(трифторэмтил) бензоилхлорид (54i, 2,2 мл, 15,0 ммоль, 1,0 экв.). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (50-100% этилацетат/гексаны) дает 51i (4,01 г, 77,5%) в виде желтого масла. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 7,65 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,49 (d, 2H, J=8,0 Гц), 4,16 (q, 2H, J=7,0 Гц), 3,82 (br s, 2H), 3,41 (br s, 2H), 3,24 (s, 2H), 2,68 (s, 2H), 2,54 (br s, 2H), 1,24 (t, 3H, J=7,0 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,1, 168,9, 139,4 131,8 (d, J_CF=32,6 Гц), 127,6, 125,7 (q, J_CF=3,8 Гц), 123,8 (d, J_CF=271,0 Гц), 60,9, 59,1, 53,0 (br), 52,5 (br), 47,6 (br), 42,2 (br), 14,3. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 66,0. МСВР (ИЭ): 345,1430 (М+1); рассчитано для C₁₆C₂₀F₃N₂O₃: 345,1426.

2-(4-(4-(трифторметил)бензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид(46i)

Синтезируют в соответствии с общей методикой С: 51i (4,00 г, 11,6 ммоль, 1,0 экв.), безводный гидразин (1,5 мл, 46,4 ммоль, 4,0 экв.), этанол (25 мл, 0,5 М), 46i (2,35 г, 61,4%) получают в виде белого твердого вещества без дополнительной очистки после экстракции. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 8,09 (s, 1Н), 7,62 (d, 2Н, J=8,0 Гц), 7,45 (d, 2H, J=8,0 Гц), 3,88 (br s, 2H) 3,75 (s, 2H), 3,35 (br s, 2H), 3,07 (s, 2H), 2,56 (br s, 2H), 2,42 (br s, 2H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,8, 168,9, 139,1 131,8 (d, J_CF=32,1 Гц), 127,5, 125,7 (q, J_CF=3,6 Гц), 123,7 (d, J_CF=271,1 Гц), 60,5, 53,7 (br), 53,2 (br), 47,6 (br), 42,2 (br). ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 66,0. МСВР (ИЭ): 331,1374 (М+1); рассчитано для C₁₄H₁₈F₃N₄O₂: 331,1382.

3-пропилсалицилальдегид (47b)

В круглодонную колбу добавляют альдегид 47а (1,62 г, 10,0 ммоль, 1,0 экв.), 5% Pd/C (324 мг, 20% по весу 47а), дифенил сульфид (17 мкл, 0,10 ммоль, 0,010 экв.), и этилацетат (40 мл, 0,25 М). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере H₂ (баллон под давлением). Реакционную смесь фильтруют через целит и тщательно промывают этилацетатом. Фильтрат концентрируют с получением альдегида 47b (1,50 г, 91,7%) в виде желтого масла. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,27 (s, 1Н), 9,88 (s, 1Н), 7,41-7,38 (m, 2H), 6,95 (t, 1Н, J=7,5 Гц), 2,64 (t, 2H, J=7,5 Гц), 1,65 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,96 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 197,0, 160,0, 137,4, 131,7, 131,4, 120,4, 119,6, 31,3, 22,7, 14,1. МСВР (ИЭ): 164,08383 (M⁺); рассчитано для C₁₀H₁₂O₂: 164,08373.

2-(аллилокси)-5-фторбензальдегид(53b)

В круглодонную колбу добавляют 5-фторсалицилальдегид (47с, 4,0 г, 28,5 ммоль, 1,0 экв.), карбонат калия (4,92 г, 35,6 ммоль, 1,25 экв.) и ДМФ (20 мл). К смеси медленно добавляют аллилбромид (3,7 мл, 42,8 ммоль, 1,5 экв.). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляют водой (50 мл) и экстрагируют этилацетатом (3×50 мл). Объединенные органические слои промывают водой (2×25 мл), 0,1 М KOH (2×25 мл), водой (2×25 мл) и насыщенным раствором соли (2×25 мл), сушат над MgSO₄, фильтруют и концентрируют с получением 53b (4,64 г, 90,2%) в виде бледно-желтой жидкости. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 10,47 (d, 1H, J=3,0 Гц), 7,50 (dd, 1H, J=3,0, 8,0 Гц), 7,23 (dd, 1H, J=3,0, 7,5, 11,0 Гц), 6,95 (dd, 1H, J=4,0, 9,0 Гц), 6,06 (tdd, 1H, J=5,0, 10,5, 17,5 Гц), 5,44 (qd, 1H, J=1,5, 17,0 Гц), 5,34 (dd, 1H, J=1,5, 2,5, 10,5 Гц), 4,64 (td, 2H, J=1,5, 5,0 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 188,8, 157,4 (d, J_CF=1,9 Гц), 157,2 (d, J_CF=240,5 Гц), 132,4, 126,1 (d, J_CF=5,9 Гц), 122,6 (d, J_CF=23,8 Гц), 118,5, 114,8 (d, J_CF=7,1 Гц), 114,2 (d, J_CF=23,1 Гц), 70,1. ¹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 125,5. МСВР (ИЭ): 180,05789 (М⁺); рассчитано для C₁₀H₉FO₂: 180,05866.

3-аллил-5-фторсалицилальдегид(47d)

53b (4,64 г, 25,8 ммоль) нагревают в чистом виде в течение ночи при 200°C. Сырой продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан) с получением 47d (2,24 г, 48,3%) в виде ярко-желтого масла. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,10 (s, 1H), 9,83 (s, 1H), 7,17 (dd, 1H, J=3,0, 9,0 Гц), 7,11 (dd, 1H, J=3,0, 7,5 Гц) 5,96 (tdd, 1H,J=6,5, 10,0, 17,0 Гц), 5.16-5,14 (m, 1H),5,12(qd, 1H, J=1,5, 11,0 Гц), 3,42 (d, 2H, J=6,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 195,9 (d, J_CF=2,5 Гц), 156,0 (d, J_CF=1,0 Гц), 155,7 (d, J_CF=238,8 Гц), 135,1, 131,6 (d, J_CF=6,4 Гц), 124,8 (d, J_CF=23,6 Гц), 119,8 (d, J_CF=6,4 Гц), 117,3, 116,0 (d, J_CF=22,3 Гц), 33,2. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 126,9. МСВР (ИЭ): 180,05761 (М⁺); рассчитано для C₁₀H₉FO₂: 180,05866.

5-фтор-2-гидрокси-3-пропилбензальдегид (47е)

В круглодонную колбу добавляют альдегид 47d (1,10 г, 6,11 ммоль, 1,0 экв.), 5% Pd/C (220 мг, 20% мас 47d), дифениловый сульфид (10 мкл, 0,061 ммоль, 0,010 экв.) и этилацетат (25 мл, 0,25 М). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере H₂ (баллон под давлением). Реакционную смесь фильтровали через целит и тщательно промывали этилацетатом. Фильтрат концентрируют с получением альдегида 47е (991 мг, 89,3%) в виде желтого масла. ¹Н-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,06 (s, 1H), 9,80 (s, 1H), 7,12 (dd, 1H, J=3,0, 9,0 Гц), 7,06 (dd, 1H, J=3,0, 7,5 Гц), 2,62 (t, 2H, J=7,5 Гц), 1,63 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,96 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 195,9 (d, J_CF=2,5 Гц), 156,3 (d, J_CF=1,0 Гц), 155,5 (d, J_CF=238,1 Гц), 133,9 (d, J_CF=6,3 Гц), 124,7 (d, J_CF=23,1 Гц), 119,6 (d, J_CF=6,5 Гц), 115,4 (d, J_CF=22,4 Гц), 31,2, 22,4, 14,0. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 127,3. МСВР (ИЭ): 182,07392 (М⁺); рассчитано для C₁₀H₁₁FO₂: 182,07431.

Общая методика D: Синтез аналогов PAC-1

В пробирку 16×150 мм добавляют гидразид, альдегид (1,0 экв.), этанол или 2 (1,0 экв.): 1 метанол: MeCN (0,15 м) и 1,2 М раствор HCl (7 моль %). Реакционную смесь встряхивают в течение ночи при кипячении с обратным холодильником в параллельном синтезаторе фирмы Büchi Syncore. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, концентрируют и очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле или перекристаллизацией с получением чистого аналога PAC-1.

N'-(3-аллил-2-гидроксибензилиден)-2-(4-бензоилпиперазин-1-ил)ацетогидразид (3)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D, но в круглодонной колбе: 46с (262 мг, 1,0 ммоль, 1,0 экв.), 47а (162 мг, 1,0 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (58 мкл, 0,070 ммоль, 0,070 экв.), этанол (7 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-10% метанол/этилацетат) дает соединение 3 (284 мг, 69,8%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,19 (s, 1H), 9,94 (s, 1H), 8,45 (s, 1H), 7,46-7,41 (m, 5H), 7,20 (d, 1H, J=6,5 Гц), 7,08 (dd, 1H, J=1,5, 7,5 Гц), 6,85 (t, 1H, J=7,0 Гц), 6,03 (tdd, 1H, J=6,5, 10,0, 16,5 Гц), 5,10-5,05 (m, 2H), 3,88 (br s, 2H), 3,58 (s, 2H), 3,52 (br s, 2H), 3,45 (d, 2H, J=6,5 Гц), 3,25 (s, 2H), 2,68 (br s, 2H), 2,61 (br s, 2H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,6, 165,4, 156,4, 151,6, 136,5, 135,4, 132,5, 130,2, 129,3, 128,8, 128,3, 127,1, 119,2, 116,9, 115,8, 61,0, 53,7, 53,1, 47,6, 42,1, 33,9. МСВР (ИЭ): 407,2077 (М+1); рассчитано для C₂₃H₂₇N₄O₃: 407,2083.

N'-(3-аллил-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-цианобензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (4)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: 46d (273 мг, 1,0 ммоль, 1,0 экв.), 47а (162 мг, 1,0 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М HCl (58 мкл, 0,070 ммоль, 0,070 экв.), этанол (7 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% метанол/этилацетат) дает соединение 4 (367 мг, 87,7%) в виде белого твердого вещества. ¹Н-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,25 (s, 1Н), 9,99 (s, 1Н), 8,40 (s, 1H), 7,61 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,44 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,18 (dd, 1Н, J=1,5, 7,5 Гц), 7,07 (dd, 1Н, J=1,5, 7,5 Гц), 6,84 (t, 1Н, J=7,5 Гц), 6,02 (tdd, 1Н, J=6,5, 10,0, 16,5 Гц), 5,11-5,04 (m, 2H), 3,58 (s, 2H), 3,44 (d, 2H, J=7,0 Гц), 3,19 (s, 2H), 2,63 (br s, 4H), 2,53 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 165,9, 156,5, 151,5, 144,0, 136,6, 132,5, 132,4, 129,6, 129,3, 128,4, 119,2, 119,1, 117,0, 115,8, 111,2, 62,4, 61,1, 53,8, 53,2, 34,0. МСВР (ИЭ): 418,2242 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₈N₅O₂: 418,2243.

N'-(3-аллил-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-цианобензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (5)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: 46е (287 мг, 1,0 ммоль, 1,0 экв.), 47а (162 мг, 1,0 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (58 мкл, 0,070 ммоль, 0,070 экв.), этанол (7 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-10% метанол/этилацетат) дает 5 (378 мг, 87,6%) в виде светло-желтого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,23 (s, 1H), 9,98 (s, 1H), 8,32 (s, 1H), 7,69 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,48 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,17 (d, 1H, J=7,0 Гц), 6,99 (dd, 1H, J=1,5, 8,0 Гц), 6,81 (t, 1H, J=7,5 Гц), 5,98 (tdd, 1H, J=6,5, 10,0, 17,0), 5,08-5,02 (m, 2H), 3,85 (br s, 2H), 3,42-3,39 (m, 4H), 3,23 (s, 2H), 2,68 (br s, 2H), 2,86 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 168,4, 165,3, 156,4, 151,7, 139,7, 136,5, 132,6, 132,6, 129,4, 128,2, 127,9, 119,3, 118,1, 116,8, 115,9, 113,8, 60,9, 53,7 (br), 53,3 (br), 47,5 (br), 42,1 (br), 33,9. МСВР (ИЭ): 432,2034 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₆N₅O₃: 432,2036.

N'-(3-аллил-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-фторбензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (6)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: Н11 (133 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47а (81 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-10% метанол/этилацетат) с последующим осаждением из Et₂O дает соединение 6 (182 мг, 89,0%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,26 (s, 1H), 10,02 (s, 1H), 8,41 (s, 1H), 7.29-7.26 (m, 2H), 7,19 (dd, 1H, J=1,5, 7,5 Гц), 7,08 (dd, 1H, J=1,5, 8,0 Гц), 7.02-6.99 (m, 2H), 6,85 (t, 1H, J=7,5 Гц), 6,03 (tdd, 1H, J=6,5, 10,0, 16,5 Гц), 5.11-5.04 (m, 2H), 3,50 (s, 2H), 3,45 (d, 2H, J=6,5 Гц), 3,19 (s, 2H), 2,62 (br s, 4H), 2,51 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,0, 162,2 (d, J_CF=243,9 Гц), 156,6, 151,5, 136,7, 133,7 (d, J_CF=3,1 Гц), 132,5, 130,7 (d, J_CF=7,8 Гц), 129,3, 128,4, 119,2, 117,0, 115,8, 115,3 (d, J_CF=21,0 Гц), 62,2, 61,2, 53,9, 53,1, 34,0. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 118,8. МСВР (ИЭ): 411,2203 (М+1); рассчитано для C₂₃H₂₈FN₄O₂: 411,2196.

N'-(3-аллил-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-фторбензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (7)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H12 (140 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47а (81 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 M). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-10% MeOH/этилацетат) дает соединение 7 (171 мг, 80,5%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) 5 11,19 (s, 1H), 9,91 (s, 1H), 8,43 (s, 1H), 7.43-7.40 (m, 2H), 7,19 (dd, 1H, J=1,0, 7,5 Гц), 7.12-7.09 (m, 2H), 7,06 (dd, 1H, J=1,5, 8,0 Гц), 6,85 (t, 1H, J=7,5 Гц), 6,02 (tdd, 1H, J=6,5, 10,0, 16,5 Гц), 5,10-5,04 (m, 2H), 3,69 (br s, 4H), 3,44 (d, 2H, J=6,5 Гц), 3,24 (s, 2H), 2,64 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,6, 165,4, 163,6 (d, J_CF=249,1 Гц), 156,4, 151,6, 136,5, 132,5, 131,4 (d, J_CF=3,4 Гц), 129,5 (d, J_CF=8,4 Гц), 129,3, 128,2, 119,2, 116,8, 115,8, 115,8 (d, J_CF=21,5 Гц), 60,9, 53,6 (br), 47,7 (br), 42,3 (br), 33,9. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 112,8. МСВР (ИЭ): 425,1989 (М+1); рассчитано для C₂₃H₂₆FN₄O₃: 425,1989.

N'-(3-аллил-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-(трифторметил)бензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (8)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H13 (158 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47а (81 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 M). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 8 (125 мг, 54,4%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,32 (s, 1Н), 10,11 (s, 1Н), 8,33 (s, 1H), 7,56 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,43 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,17 (dd, 1Н, J=1,5, 7,5 Гц), 7,04 (dd, 1Н, J=1,5, 8,0 Гц), 6,83 (t, 1Н, J=7,5 Гц), 6,02 (tdd, 1Н, J=6,5, 10,0, 16,5 Гц), 5,10-5,04 (m, 2H), 3,57 (s, 2H), 3,44 (d, 2H, J=7,0 Гц), 3,19 (s, 2H), 2,63 (br s, 4H), 2,53 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,0, 156,4, 151,2, 142,4, 136,6, 132,4, 129,5 (q, J_CF=32,0 Гц), 129,3, 129,3, 128,3, 125,3 (q, J_CF=3,8 Гц), 123,9 (d, J_CF=270,6 Гц), 119,2, 117,0, 115,8, 62,3, 61,0, 53,7, 53,1, 34,0. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 65,4. МСВР (ИЭ): 461,2160 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₈F₃N₄O₂: 461,2164.

N'-(3-аллил-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-(трифторметил)бензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (9)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H14 (165 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47а (81 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 M). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% метанол/этилацетат) дает соединение 9 (211 мг, 89,1%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,28 (s, 1Н), 10,13 (s, 1Н), 8,27 (s, 1Н), 7,65 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,48 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,15 (d, 1Н, J=8,0 Гц), 6,94 (d, 2H, J=7,0 Гц), 6,79 (t, 1Н, J=7,5 Гц), 5,97 (tdd, 1Н, J=6,5, 10,0, 17,0 Гц), 5,05-5,00 (m, 2H), 3,86 (s, 2H), 3,43 (br s, 2H), 3,39 (d, 2H, J=6,5 Гц), 3,21 (s, 2H), 2,66 (br s, 2H), 2,58 (br s, 2H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,0, 165,4, 156,3, 151,5, 139,0, 136,4, 132,5, 131,9 (q, J_CF=32,6 Гц), 129,3, 128,2, 127,5, 125,8 (q, J_CF=3,5 Гц), 123,7 (d, J_CF=271,1 Гц), 119,3, 116,8, 115,8, 60,8, 53,5 (br), 47,5 (br), 42,0 (br), 33,8. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 66,0. МСВР (ИЭ): 475,1964 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₆F₃N₄O₃: 475,1957.

2-(4-бензилпиперазин-1-ил)-N'-(2-гидрокси-3-пропилбензилиден)ацетогидразид (10)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D, но в круглодонной колбе: 46а (248 мг, 1,0 ммоль, 1,0 экв.), 47b (164 мг, 1,0 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (58 мкл, 0,070 ммоль, 0,070 экв.), этанол (7 мл, 0,15 M). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 10 (345 мг, 87,3%) в виде не совсем белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,30 (s, 1H), 10,12 (s, 1H), 8,31 (s, 1H), 7,35-7,30 (m, 4H), 7,30-7,25 (m, 1H), 7,17 (d, 1H, J=7,5 Гц), 7,03 (d, 1H, J=7,5 Гц), 6,82 (t, 1H, J=7,5 Гц), 3,54 (s, 2H), 3,19 (s, 2H), 2,67 (t, 2H, J=7,5 Гц), 2,62 (br s, 4H), 2,54 (br s, 4H), 1,67 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,97 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 165,9, 156,7, 151,2, 137,9, 132,5, 130,7, 129,2, 128,8, 128,4, 127,3, 118,9, 116,8, 62,9, 61,0, 53,7, 53,0, 32,0, 22,7, 14,2. МСВР (ИЭ): 395,2436 (M+1); рассчитано для C₂₃H₃₁N₄O₂: 395,2447.

4-((4-(2-(2-(2-гидрокси-3-пропилбензилиден)гидразинил)-2-оксоэтил)пиперазин-1-ил)метил)бензолсульфамид (11)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H2 (164 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47b (82 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), 2:1 метанол: MeCN (3 мл, 0,15 M). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 11 (211 мг, 89,0%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, (CD₃)₂CO) δ 11,78 (s, 1H), 10,76 (s, 1H), 8,48 (s, 1H), 7,84 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,51 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,17 (d, 1H, J=7,0 Гц), 7,14 (dd, 1H, J=1,5, 8,0 Гц), 6,82 (t, 1H, J=7,5 Гц), 6,54 (br s, 2H), 3,59 (s, 2H), 3,17 (s, 2H), 2.64-2.59 (m, 6H), 2,52 (br s, 4H), 1,63 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,93 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, (CD₃)₂CO) δ 166,3, 157,3, 150,9, 144,0, 143,8, 132,7, 130,8, 129,9, 129,6, 126,9, 119,6, 118,3, 62,6, 61,7, 54,3, 53,6, 32,5, 23,4, 14,2. МСВР (ИЭ): 474,2175 (M+1); рассчитано для C₂₃H₃₂N₅O₄S: 474,2175.

2-(4-бензоилпиперазин-1-ил)-N'-(2-гидрокси-3-пропилбензилиден)ацетогидразид (12)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H3 (131 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47b (82 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 M). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 50-100% этилацетат/гексан, затем 5% метанол/этилацетат) дает соединение 12 (174 мг, 85,5%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,29 (s, 1H), 10,29 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 7,41-7,34 (m, 5H), 7,13 (dd, 1H, J=1,5, 7,5 Гц), 6,90 (dd, 1H, J=1,5, 7,5 Гц), 6,76 (t, 1H, J=7,5 Гц), 3,80 (br s, 2H), 3,47 (br s, 2H), 3,18 (s, 2H), 2.71-2.52 (m, 6H, Ar-CH₂-CH₂), 1,61 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,91 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,5, 165,5, 156,6, 151,5, 135,3, 132,5, 130,6, 130,1, 128,8, 128,7, 127,0, 118,9, 116,7, 60,8, 53,6 (br), 53,0 (br), 47,5 (br), 42,0 (br), 31,9, 22,7, 14,1. МСВР (ИЭ): 409,2238 (М+1); рассчитано для C₂₃H₂₉N₄O₃: 409,2240.

2-(4-(4-циано6ензил)пиперазин-1-ил)-N'-(2-гидрокси-3-пропилбензилиден)ацетогидразид (13)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H9 (273 мг, 1,0 ммоль, 1,0 экв.), 47b (164 мг, 1,0 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (58 мкл, 0,070 ммоль, 0,070 экв.), этанол (7 мл, 0,15 M). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 13 (373 мг, 88,8%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,19 (s, 1H), 9,99 (s, 1H), 8,37 (s, 1H), 7,60 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,44 (d, 2H, J=7,5 Гц), 7,16 (dd, 1H, J=1,5, 7,5 Гц), 7,04 (dd, 1H, J=1,5, 7,5 Гц), 6,82 (t, 1H, J=7,5 Гц), 3,58 (s, 2H), 3,19 (s, 2H), 2,66-2,63 (m, 6H), 2,52 (br s, 4H), 1,64 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,95 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 165,8, 156,8, 151,6, 144,0, 132,7, 132,3, 130,8, 129,6, 128,9, 119,1, 119,0, 116,8, 111,2, 62,4, 61,1, 53,8, 53,2, 32,0, 22,8, 14,2. МСВР (ИЭ): 420,2396 (М+1); рассчитано для C₂₄H₃₀N₅O₂: 420,2400.

2-(4-(4-цианобензоил)пиперазин-1-ил)-N'-(2-гидрокси-3-пропилбензилиден)ацетогидразид (14)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H10 (287 мг, 1,0 ммоль, 1,0 экв.), 47b (164 мг, 1,0 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (58 мкл, 0,070 ммоль, 0,070 экв.), этанол (7 мл, 0,15 M). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 14 (377 мг, 86,9%) в виде светло-желтого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,15 (s, 1H), 9,92 (s, 1H), 8,32 (s, 1H), 7,71 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,49 (d, 2H, J=7,5 Гц), 7,16 (d, 1H, J=7,0 Гц), 6,98 (dd, 1H, J=1,5, 7,5 Гц), 6,80 (t, 1H, J=7,5 Гц), 3,86 (br s, 2H), 3,44 (br s, 2H), 3,24 (s, 2H), 2,70 (br s, 2H), 2,64-2,57 (m, 4H), 1,62 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,93 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 168,5, 165,2, 156,7, 152,0, 139,8, 132,9, 132,7, 130,8, 129,0, 127,9, 119,1, 118,1, 116,7, 113,9, 61,0, 53,5 (br), 47,5 (br), 42,1 (br), 32,0, 22,8, 14,2. МСВР (ИЭ): 434,2188 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₈N₅O₃: 434,2192.

2-(4-(4-фторбензил)пиперазин-1-ил)-N'-(2-гидрокси-3-пропилбензилиден)ацетогидразид (15)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: Н11 (133 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47b (82 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% метанол/этилацетат) с последующим осаждением из Et₂O дает соединение 15 (137 мг, 66,4%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,26 (s, 1H), 10,09 (s, 1H), 8,31 (s, 1H), 7,26 (dd, 2H, J=6,0, 8,0 Гц), 7,16 (dd, 1H, J=1,5, 6,5 Гц), 7,02-6,97 (m, 3H), 6,80 (t, 1H, J=7,5 Гц), 3,48 (s, 2H), 3,18 (s, 2H), 2,65 (t, 2H, J=7,5 Гц), 2,61 (br s, 4H), 2,50 (br s, 4H), 1,65 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,95 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 165,9, 162,1 (d, J_CF=243,6 Гц), 156,7, 151,3, 133,7 (d, J_CF=3,0 Гц), 132,5, 130,7, 130,6 (d, J_CF=7,8 Гц), 128,9, 118,9, 116,8, 115,2 (d, J_CF=21,0 Гц), 62,1, 61,0, 53,8, 53,0, 32,0, 22,8, 14,2. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 118,8. МСВР (ИЭ): 413,2361 (М+1); рассчитано для C₂₃H₃₀FN₄O₂: 413,2353.

2-(4-(4-фторбензоил)пиперазин-1-ил)-N'-(2-гидрокси-3-пропилбензилиден)ацетогидразид (16)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H12 (140 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47b (82 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 16 (133 мг, 62,4%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,24 (s, 1H), 10,17 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 7,37 (dd, 2H, J=5,5, 8,5 Гц), 7,13 (dd, 1H, J=1,5, 7,5 Гц), 7,06 (t, 2H, J=8,5 Гц), 6,91 (dd, 1H, J=1,5, 7,5 Гц), 6,77 (t, 1H, J=7,5 Гц), 3,83 (br s, 2H), 3,49 (br s, 2H), 3,20 (s, 2H), 2.62-2.58 (m, 6H), 1,60 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,91 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,6, 165,4, 163,6 (d, J_CF=249,3 Гц), 156,6, 151,7, 132,6, 131,4 (d, J_CF=3,4 Гц), 129,5 (d, J_CF=8,5 Гц), 128,9, 119,0, 116,7, 115,8 (d, J_CF=21,8 Гц), 60,9, 53,5 (br), 47,7 (br), 42,2 (br), 31,9, 22,7, 14,1. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 112,8. МСВР (ИЭ): 427,2141 (М+1); рассчитано для C₂₃H₂₈FN₄O₃: 427,2145.

N'-(2-гидрокси-3-пропилбензилиден)-2-(4-(4-(трифторметил)бензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (17)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H13 (158 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47b (82 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 17 (93,9 мг, 40,6%) в виде желтого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,23 (s, 1Н), 10,05 (s, 1Н), 8,33 (s, 1H), 7,57 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,44 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,16 (dd, 1Н, J=1,5, 7,5 Гц), 7,02 (dd, 2H, J=1,5, 7,5 Гц), 6,81 (t, 1Н, J=7,5 Гц), 3,58 (s, 2H), 3,19 (s, 2H), 2,67-2,62 (m, 6H), 2,53 (br s, 4H), 1,65 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,95 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 165,9, 156,8, 151,5, 142,4, 132,6, 130,8, 129,6 (q, J_CF=32,0 Гц), 129,3, 128,9, 125,4 (q, J_CF=3,6 Гц), 124,4 (d, J_CF=270,5 Гц), 119,0, 116,9, 62,4, 61,1, 53,8, 53,2, 32,0, 22,8, 14,2. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 65,5. МСВР (ИЭ): 463,2321 (М+1); рассчитано для C₂₄H₃₀F₃N₄O₂: 463,2321.

N'-(2-гидрокси-3-пропилбензилиден)-2-(4-(4-(трифторметил)бензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (18)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H14 (165 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47b (82 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 18 (216 мг, 90,8%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,24 (s, 1Н), 10,14 (s, 1Н), 8,23 (s, 1Н), 7,64 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,47 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,13 (d, 1Н, J=8,0 Гц), 6,89 (d, 1Н, J=7,5 Гц), 6,76 (t, 1Н, J=7,5 Гц), 3,85 (br s, 2H), 3,43 (br s, 2H), 3,21 (s, 2H), 2,73-2,58 (m, 6H), 1,60 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,90 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,0, 165,4, 156,5, 151,6, 139,0, 132,7, 131,9 (q, J_CF=32,5 Гц), 130,6, 128,8, 127,5, 125,8 (q, J_CF=3,5 Гц), 123,7 (d, J_CF=271,3 Гц), 119,0, 116,7, 60,8, 53,5 (br), 47,5 (br), 42,0 (br), 31,9, 22,7, 14,1. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 66,0. МСВР (ИЭ): 477,2108 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₈F₃N₄O₂: 477,2114.

2-(4-бензилпиперазин-1-ил)-N'-(5-фтор-2-гидроксибензилиден)ацетогидразид (19)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H1 (124 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47с (70 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 19 (173 мг, 93,7%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 10,81 (s, 1Н), 10,13 (s, 1Н), 8,39 (s, 1H), 7.33-7.30 (m, 4H), 7.28-7.25 (m, 1Н), 7,00 (dt, 1Н, J=3,0, 9,0 Гц), 6,94-6,89 (m, 2H), 3,55 (s, 2H), 3,19 (s, 2H), 2,63 (br s, 4H), 2,53 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,3, 155,9 (d, J_CF=235,8 Гц), 154,8, 150,0, 137,9, 129,3, 128,5, 127,4, 118,9 (d, J_CF=23,1 Гц), 118,4 (d, J_CF=7,6 Гц), 117,6 (d, J_CF=7,5 Гц), 116,1 (d, J_CF=23,8 Гц), 63,0, 61,1, 53,9, 53,1. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 128,5. МСВР (ИЭ): 371,1877 (М+1); рассчитано для C₂₀H₂₄FN₄O₂: 371,1883.

4-((4-(2-(2-(5-фтор-2-гидроксибензилиден)гидразинил)-2-оксоэтил)пиперазин-1-ил)метил)бензолсульфамид (20)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H2 (164 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47с (70 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), 2: 1 метанол: MeCN (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 20 (172 мг, 82,1%) в виде желтого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, (CD₃)₂CO) δ 11,33 (br s, 1Н), 10,95 (s, 1Н), 8,49 (s, 1Н), 7,85 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,49 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,12 (dd, 1Н, J=3,0, 9,0 Гц), 7,07 (dt, 1Н, J=3,0, 8,5 Гц), 6,91 (dd, 1H,J=5,0, 9,0 Гц), 6,62 (br s, 2H), 3,55 (s, 2H), 3,19 (s, 2H), 2,59 (br s, 4H), 2,49 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, (CD₃)₂CO) δ 166,8, 156,4 (d, J_CF=233,5 Гц), 155,4, 155,1 (d, J_CF=2,8 Гц), 143,9, 143,6, 129,9, 126,7, 119,2 (d, J_CF=7,6 Гц), 118,7 (d, J_CF=17,8 Гц), 118,6, 116,6 (d, J_CF=23,9 Гц), 62,5, 61,5, 54,1, 53,4. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, (CD₃)₂CO) δ - 127,3. МСВР (ИЭ): 450,1609 (М+1); рассчитано для C₂₀H₂₅FN₅O₄S: 450,1611.

2-(4-бензоилпиперазин-1-ил)-N'-(5-фтор-2-гидроксибензилиден)ацетогидразид (21)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H3 (131 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47с (70 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 21 (157 мг, 81,6%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 10,89 (s, 1Н), 10,50 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,40-7,33 (m, 5H), 6,93 (dt, 1H, J=2,5, 8,5 Гц), 6,84 (dd, 1H, J=4,5, 9,0 Гц), 6,74 (dd, 1H, J=2,5, 8,5 Гц), 3,79 (br s, 2H), 3,48 (br s, 2H), 3,17 (s, 2H), 2,60 (br s, 2H), 2,53 (br s, 2H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,5, 165,8, 155,7 (d, J_CF=235,8 Гц), 154,5, 149,7, 135,3, 130,1, 128,7, 127,0, 118,8 (d, J_CF=23,1 Гц), 118,2 (d, J_CF=7,5 Гц), 117,6 (d, J_CF=7,4 Гц), 116,0 (d, J_CF=23.6 Гц), 60,7, 53,6 (br), 53,4 (br), 47,6 (br), 42,0 (br). ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 128,3. МСВР (ИЭ): 385,1674 (М+1); рассчитано для C₂₀H₂₂FN₄O₃: 385,1676.

2-(4-(4-цианобензил)пиперазин-1-ил)-N'-(5-фтор-2-гидроксибензилиден)ацетогидразид (22)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H9 (137 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47с (70 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 22 (169 мг, 85,5%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 10,84 (s, 1H), 10,20 (s, 1H), 8,31 (s, 1H), 7,56 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,41 (d, 1H, J=8,0 Гц), 6,95 (dt, 1H, J=3,0, 9,0 Гц), 6,88-6,85 (m, 2H), 3,54 (s, 2H), 3,18 (s, 2H), 2,60 (br s, 4H), 2,50 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,2, 155,7 (d, J_CF=235,9 Гц), 154,6, 149,6, 144,0, 132,2, 129,5, 118,9 (d, J_CF=22,6 Гц), 118,6, 118,2 (d, J_CF=7,6 Гц), 117,5 (d, J_CF=7,5 Гц), 116,0 (d, J_CF=23,8 Гц), 110,9, 62,2, 61,0, 53,6, 53,0. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 128,4. МСВР (ИЭ): 396,1838 (М+1); рассчитано для C₂₁H₂₃FN₅O₂: 396,1836.

2-(4-(4-цианобензоил)пиперазин-1-ил)-N'-(5-фтор-2-гидроксибензилиден)ацетогидразид (23)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H10 (144 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47с (70 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 23 (144 мг, 70,1%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 10,79 (s, 1Н), 10,16 (s, 1Н), 8,28 (s, 1H), 7,67 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,47 (d, 2H, J=8,5 Гц), 6,95 (dt, 1H, J=3,0, 8,0 Гц), 6,85 (dd, 1H, J=4,5, 9,0 Гц), 6,79 (dd, 1Н, J=3,0, 8,5 Гц), 3,82 (br s, 2H), 3,41 (br s, 2H), 3,22 (s, 2H), 2,67 (br s, 2H), 2,54 (br s, 2H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 168,4, 165,5, 155,7 (d, J_CF=236,1 Гц), 154,5, 149,9, 139,7, 132,6, 127,8, 119,0 (d, J_CF=23,1 Гц), 118,2 (d, J_CF=7,6 Гц), 118,1, 117,4 (d, J_CF=7,5 Гц), 116,0 (d, J_CF=23,6 Гц), 113,7, 60,8, 53,4 (br), 52,7 (br), 47,4 (br), 42,0 (br). ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 128,1. МСВР (ИЭ): 410,1623 (М+1); рассчитано для C₂₁H₂₁FN₅O₃: 410,1628.

N'-(5-фтор-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-фторбензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (24)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H11 (133 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47с (70 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 24 (152 мг, 78,2%) в виде бледно-желтого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 10,83 (s, 1Н), 10,19 (s, 1Н), 8,33 (s, 1Н), 7,25 (dd, 2H, J=5,5, 8,5 Гц), 6.99-6.95 (m, 3H), 6.90-6.86 (m, 2H), 3,47 (s, 2H), 3,18 (s, 2H), 2,60 (br s, 4H), 2,49 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,3, 162,1 (d, J_CF=243,9 Гц), 155,8 (d, J_CF=236,0 Гц), 154,7 (d, J_CF=1,4 Гц), 149,7 (d, J_CF=2,6 Гц), 133,7 (d, J_CF=3,0 Гц), 130,6 (d, J_CF=7,9 Гц), 118,8 (d, J_CF=23,3 Гц), 118,3 (d, J_CF=7,6 Гц), 117,6 (d, J_CF=7,5 Гц), 116,0 (d, J_CF=23,8 Гц), 115,2 (d, J_CF=21,1 Гц), 62,1, 61,0, 53,8, 52,9. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 118,8, - 128,4. МСВР (ИЭ): 389,1787 (М+1); рассчитано для C₂₀H₂₃F₂N₄O₂: 389,1789.

N'-(5-фтор-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-фторбензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (25)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H12 (140 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47с (70 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 25 (101 мг, 50,1%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 10,81 (s, 1Н), 10,25 (s, 1Н), 8,29 (s, 1Н), 7,38 (dd, 2H, J=5,5, 8,5 Гц), 7,07 (t, 2H, J=8,5 Гц), 6,98-6,94 (m, 1Н), 6,86 (dd, 1Н, J=4,0, 9,0 Гц), 6,79 (dd, 1H, J=2,0, 8,0 Гц), 3,63 (br s, 4H), 3,21 (s, 2H), 2,59 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,7, 165,7, 163,6 (d, J_CF=249,4 Гц), 155,8 (d, J_CF=236,3 Гц), 154,6 (d, J_CF=0,9 Гц), 150,0 (d, J_CF=2,3 Гц), 131,3 (d, J_CF=3,4 Гц), 129,5 (d, J_CF=8,4 Гц), 119,0 (d, J_CF=23,1 Гц), 118,3 (d, J_CF=7,5 Гц), 117,5 (d, J_CF=7,3 Гц), 116,0 (d, J_CF=24,6 Гц), 115,8 (d, J_CF=21,9 Гц), 60,9, 53,5, 47,7, 42,2. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 112,6, - 128,2. МСВР (ИЭ): 403,1573 (М+1); рассчитано для C₂₀H₂₁F₂N₄O₃: 403,1582.

N'-(5-фтор-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-(трифторметил)бензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (26)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H13 (158 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47с (70 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 26 (194 мг, 88,6%) в виде бледно-желтого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 10,83 (s, 1H), 10,17 (s, 1H), 8,34 (s, 1H), 7,56 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,43 (d, 2H, J=8,0 Гц), 6,98 (dt, 1H, J=3,0, 8,0 Гц), 6,91-6,86 (m, 2H), 3,57 (s, 2H), 3,19 (s, 2H), 2,62 (br s, 4H), 2,52 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,3, 155,8 (d, J_CF=236,0 Гц), 154,7 (d, J_CF=1,5 Гц), 149,8 (d, J_CF=2,4 Гц), 142,4 (d, J_CF=0,8 Гц), 129,5 (d, J_CF=32,1 Гц), 129,3, 125,3 (q, J_CF=3,8 Гц), 124,4 (d, J_CF=270,6 Гц), 118,9 (d, J_CF=23,0 Гц), 118,3 (d, J_CF=7,6 Гц), 117,6 (d, J_CF=7,5 Гц), 116,1 (d, J_CF=23,6 Гц), 62,3, 61,0, 53,8, 53,1. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 65,4, - 128,4. МСВР (ИЭ): 439,1765 (М+1); рассчитано для C₂₁H₂₃F₄N₄O₂: 439,1757.

N'-(5-фтор-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-(трифторметил)бензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (27)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H14 (165 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47с (70 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 27 (173 мг, 76,5%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 10,80 (s, 1H), 10,20 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 7,65 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,48 (d, 2H, J=7,5 Гц), 6,96 (dt, 1H, J=2,5, 8,0 Гц), 6,87 (dd, 1H, J=4,5, 8,5 Гц), 6,79 (dd, 1H, J=2,5, 8,0 Гц), 3,84 (br s, 2H), 3,44 (br s, 2H), 3,22 (s, 2H), 2,70 (br s, 2H), 2,55 (br s, 2H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,1, 165,6, 155,8 (d, J_CF=236,3 Гц), 154,6 (d, J_CF=1,3 Гц), 150,0 (d, J_CF=1,9 Гц), 138,9, 132,0 (q, J_CF=32,6 Гц), 127,5, 125,8 (q, J_CF=3,6 Гц), 123,7 (d, J_CF=271,3 Гц), 119,0 (d, J_CF=23,1 Гц), 118,3 (d, J_CF=7,6 Гц), 117,4 (d, J_CF=7,5 Гц), 116,0 (d, J_CF=23,8 Гц), 60,8, 53,5 (br), 47,5 (br), 42,0 (br). ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 66,0, - 128,1. МСВР (ИЭ): 453,1552 (М+1); рассчитано для C₂₁H₂₁F₄N₄O₃: 453,1550.

N'-(3-аллил-5-фтор-2-гидроксибензилиден)-2-(4-бензилпиперазин-1-ил)ацетогидразид (28)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H1 (124 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47d (90 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 28 (186 мг, 90,8%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,16 (s, 1Н), 10,20 (s, 1Н), 8,28 (s, 1H), 7,34-7,30 (m, 4H), 7,28-7,25 (m, 1Н), 6,91 (dd, 1Н, J=3,0, 9,0 Гц), 6,74 (dd, 1Н, J=3,0, 8,0 Гц), 5,98 (tdd, 1Н, J=6,5, 10,0, 16,5 Гц), 5,13-5,08 (m, 2H), 3,54 (s, 2H), 3,42 (d, 2H, J=7,0 Гц), 3,20 (s, 2H), 2,63 (br s, 4H), 2,53 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,2, 155,5 (d, J_CF=235,8 Гц), 152,5 (d, J_CF=1,4 Гц), 149,8 (d, J_CF=2,5 Гц), 137,9, 135,7, 130,2 (d, J_CF=6,8 Гц), 129,2, 128,4, 127,3, 119,0 (d, J_CF=23,1 Гц), 116,8 (d, J_CF=7,9 Гц), 116,6, 113,9 (d, J_CF=23,5 Гц), 62,9, 61,0, 53,8, 53,0, 33,8. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 128,6. МСВР (ИЭ): 411,2191 (М+1); рассчитано для C₂₃H₂₈FN₄O₂: 411,2196.

4-((4-(2-(2-(3-аллил-5-фтор-2-гидроксибензилиден)гидразинил)-2-оксоэтил)пиперазин-1-ил)метил)бензолсульфамид (29)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H2 (164 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47d (90 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 29 (214 мг, 87,2%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, (CD₃)₂CO) δ 11,73 (br s, 1Н), 10,94 (s, 1Н), 8,46 (s, 1Н), 7,85 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,48 (d, 2H, J=8,5 Гц), 6,96 (d, 2H, J=9,0 Гц), 6,62 (br s, 2H), 5,99 (tdd, 1H, J=6,5, 10,0, 16,5 Гц), 5,10 (qd, 1H, J=1,5, 17,0 Гц), 5,04 (qd, 2H, J=1,5, 10,0 Гц), 3,55 (s, 2H), 3,40 (d, 2H, J=7,0 Гц), 3,19 (s, 2H), 2,59 (br s, 4H), 2,49 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, (CD₃)₂CO) δ 166,8, 156,1 (d, J_CF=233,6 Гц), 153,1 (d, J_CF=1,3 Гц), 149,6, 143,9, 143,5, 136,6, 130,5 (d, J_CF=7,0 Гц), 129,8, 126,7, 118,7 (d, J_CF=23,1 Гц), 118,4 (d, J_CF=8,0 Гц), 116,5, 114,6 (d, J_CF=23,6 Гц), 62,5, 61,5, 54,1, 53,4, 34,2. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, (CD₃)₂CO) δ - 127,4. МСВР (ИЭ): 490,1930 (М+1); рассчитано для C₂₃H₂₉FN₅O₄S: 490,1924.

N'-(3-аллил-5-фтор-2-гидроксибензилиден)-2-(4-бензоилпиперазин-1-ил)ацетогидразид (30)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H3 (131 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47d (90 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 30 (186 мг, 87,8%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,17 (s, 1H), 10,45 (s, 1H), 8,19 (s, 1H), 7,40-7,33 (m, 5Н), 6,86 (dd, 1H, J=3,0, 9,0 Гц), 6,60 (dd, 1H, J=3,0, 8,5 Гц), 5,91 (tdd, 1H, J=6,5, 9,5, 18,0 Гц), 5.09-5.03 (m, 2H), 3,80 (br s, 2H), 3,47 (br s, 2H), 3,35 (d, 2H, J=6,5 Гц), 3,19 (s, 2H), 2,56 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,5, 165,6, 155,4 (d, J_CF=235,5 Гц), 152,4 (d, J_CF=1,4 Гц), 150,1 (d, J_CF=1,8 Гц), 135,6, 135,3, 130,1, 130,1, 128,7, 127,0, 119,0 (d, J_CF=23,0 Гц), 116,8 (d, J_CF=7,9 Гц), 116,5, 113,9 (d, J_CF=23,5 Гц), 60,7, 53,6 (br), 47,6 (br), 42,0 (br), 33,7. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ -128,5. МСВР (ИЭ): 425,1991 (М+1); рассчитано для C₂₃H₂₆FN₄O₃: 425,1989.

N'-(3-аллил-5-фтор-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-цианобензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (31)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H9 (137 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47d (90 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 31 (164 мг, 75,3%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,12 (s, 1H), 10,16 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 7,57 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,42 (d, 2H, J=8,0 Гц), 6,88 (dd, 1H, J=3,0, 9,0 Гц), 6,72 (dd, 1H, J=3,0, 8,0 Гц), 5,94 (tdd, 1H, J=6,5, 10,0, 17,0 Гц), 5,09-5,05 (m, 2H), 3,55 (s, 2H), 3,38 (d, 2H, J=7,0 Гц), 3,19 (s, 2H), 2,62 (br s, 4H), 2,51 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,0, 155,5 (d, J_CF=235,5 Гц), 152,5 (d, J_CF=1,4 Гц), 149,9, 144,0, 135,7, 132,2, 130,1 (d, J_CF=6,8 Гц), 129,5, 119,0 (d, J_CF=23,0 Гц), 119,0, 116,8 (d, J_CF=7,8 Гц), 116,5, 113,9 (d, J_CF=23,5 Гц), 111,0, 62,3, 60,9, 53,8, 53,1, 33,8. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 128,6. МСВР (ИЭ): 436,2144 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₇FN₅O₂: 436,2149.

N'-(3-аллил-5-фтор-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-цианобензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (32)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H10 (144 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47d (90 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 32 (196 мг, 87,2%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,10 (s, 1H), 10,21 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 7,65 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,45 (d, 2H, J=8,5 Гц), 6,84 (dd, 1H, J=3,0, 9,0 Гц), 6,61 (dd, 1H, J=3,0, 8,0 Гц), 5,88 (tdd, 1H, J=7,0, 10,0, 16,5 Гц), 5,03-5,00 (m, 2H), 3,81 (br s, 2H), 3,40 (s, 2H), 3,31 (d, 2H, J=6,5 Гц), 3,21 (s, 2H), 2,66 (br s, 2H), 2,54 (br s, 2H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 168,3, 165,4, 155,4 (d, J_CF=235,9 Гц), 152,3, 150,1, 139,7, 135,4, 132,5, 130,0 (d, J_CF=6,8 Гц), 127,7, 119,1 (d, J_CF=23,1 Гц), 118,0, 116,6 (d, J_CF=7,9 Гц), 116,5, 113,8 (d, J_CF=23,5 Гц), 113,6, 60,7, 53,3 (br), 47,3 (br), 42,0 (br), 33,6. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 128,3. МСВР (ИЭ): 450,1931 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₅FN₅O₃: 450,1941.

N'-(3-аллил-5-фтор-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-фторбензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (33)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: Н11 (133 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47d (90 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 33 (176 мг, 82,0%) в виде желтого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,15 (s, 1H), 10,22 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 7,25 (dd, 2H, J=5,5, 8,5 Гц), 6,98 (t, 2H, J=8,5 Гц), 6,89 (dd, 1H, J=3,0, 9,0 Гц), 6,72 (dd, 1H, J=3,0, 8,0 Гц), 5,95 (tdd, 1H, J=6,5, 10,0, 17,0 Гц), 5,10-5,06 (m, 2H), 3,47 (s, 2H), 3,39 (d, 2H, J=6,5 Гц), 3,18 (s, 2H), 2,61 (br s, 4H), 2,49 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,2, 162,1 (d, J_CF=243,8 Гц), 155,5 (d, J_CF=235,5 Гц), 152,5 (d, J_CF=0,9 Гц), 149,8, 135,7, 133,6 (d, J_CF=3,0 Гц), 130,6 (d, J_CF=7,8 Гц), 130,1 (d, J_CF=6,8 Гц), 119,0 (d, J_CF=23,0 Гц), 116,8 (d, J_CF=7,8 Гц), 116,5, 115,1 (d, J_CF=21,0 Гц), 113,9 (d, J_CF=23,5 Гц), 62,1, 61,0, 53,7, 52,9, 33,8. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 118,8, - 128,6. МСВР (ИЭ): 429,2095 (M+1); рассчитано для C₂₃H₂₇F₂N₄O₂: 429,2102.

N'-(3-аллил-5-фтор-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-фторбензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (34)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H12 (140 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47d (90 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 34 (163 мг, 73,8%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,10 (s, 1Н), 10,23 (s, 1Н), 8,25 (s, 1H), 7,38 (dd, 2H, J=5,5, 8,5 Гц), 7,07 (t, 2H, J=8,5 Гц), 6,88 (dd, 1Н, J=3,0, 9,0 Гц), 6,65 (dd, 1Н, J=3,0, 8,5 Гц), 5,92 (tdd, 1Н, J=6,5, 9,5, 17,0 Гц), 5,10-5,04 (m, 2H), 3,82 (br s, 2H), 3,50 (br s, 2H), 3,36 (d, 2H, J=6,5 Гц), 3,21 (s, 2H), 2,59 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,7, 165,6, 163,6 (d, J_CF=249,8 Гц), 155,5 (d, J_CF=235,6 Гц), 152,5 (d, J_CF=1,4 Гц), 150,3 (d, J_CF=2,5 Гц), 135,6, 131,3 (d, J_CF=3,5 Гц), 130,2 (d, J_CF=6,9 Гц), 129,5 (d, J_CF=8,4 Гц), 119,2 (d, J_CF=23,1 Гц), 116,7 (d, J_CF=7,8 Гц), 116,6, 115,9 (d, J_CF=21,8 Гц), 113,9 (d, J_CF=23,5 Гц), 60,9, 53,6 (br), 47,7 (br), 42,2 (br), 33,8. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 112,6, - 128,4. МСВР (ИЭ): 443,1886 (M+1); рассчитано для C₂₃H₂₅F₂N₄O₃: 443,1895.

N'-(3-аллил-5-фтор-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-(трифторметил)бензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (35)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H13 (158 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47d (90 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 35 (176 мг, 73,7%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,14 (s, 1Н), 10,19 (s, 1Н), 8,28 (s, 1Н), 7,56 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,43 (d, 2H, J=8,0 Гц), 6,90 (dd, 1Н, J=3,0, 9,0 Гц), 6,72 (dd, 2H, J=3,0, 8,0 Гц), 5,96 (tdd, 1Н, J=6,5, 10,0, 17,0 Гц), 5,11-5,08 (m, 2H), 3,57 (s, 2H), 3,40 (d, 2H, J=6,5 Гц), 3,20 (s, 2H), 2,63 (br s, 4H), 2,53 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,1, 155,6 (d, J_CF=235,5 Гц), 152,5 (d, J_CF=1,3 Гц), 149,9 (d, J_CF=2,4 Гц), 142,4, 135,7, 130,2 (d, J_CF=6,8 Гц), 129,5 (q, J_CF=32,0 Гц), 129,3, 125,3 (q, J_CF=3,8 Гц), 124,4 (d, J_CF=270,5 Гц), 119,1 (d, J_CF=23,1 Гц), 116,9 (d, J_CF=7,8 Гц), 116,6, 114,0 (d, J_CF=23,5 Гц), 62,3, 61,0, 53,8, 53,1, 33,8. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 65,4, - 128,5. МСВР (ИЭ): 479,2066 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₇F₄N₄O₂: 479,2070.

N'-(3-аллил-5-фтор-2-гидроксибензилиден)-2-(4-(4-(трифторметил)бензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (36)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H14 (165 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47d (90 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 36 (139 мг, 56,3%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,07 (s, 1H), 10,14 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 7,66 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,50 (d, 2H, J=8,0 Гц), 6,89 (dd, 1H, J=3,0, 9,0 Гц), 6,66 (dd, 1H, J=3,0, 8,5 Гц), 5,93 (tdd, 1H, J=7,0, 10,0, 16,5 Гц), 5,10-5,04 (m, 2H), 3,86 (br s, 2H), 3,45 (s, 2H), 3,37 (d, 2H, J=6,5 Гц), 3,23 (s, 2H), 2,69 (br s, 2H), 2,57 (br s, 2H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,1, 165,5, 155,6 (d, J_CF=235,9 Гц), 152,5, 150,4 (d, J_CF=2,1 Гц), 138,9, 135,6, 132,0 (q, J_CF=32,6 Гц), 130,3 (d, J_CF=6,8 Гц), 127,5, 125,9 (q, J_CF=3,8 Гц), 123,7 (d, J_CF=271,1 Гц), 119,3 (d, J_CF=23,0 Гц), 116,7 (d, J_CF=4,6 Гц), 116,7, 114,0 (d, J_CF=23,5 Гц), 60,9, 53,6 (br), 47,5 (br), 42,2 (br), 33,8. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 66,0, - 128,4. МСВР (ИЭ): 493,1868 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₅F₄N₄O₃: 493,1863.

2-(4-бензилпиперазин-1-ил)-N'-(5-фтор-2-гидрокси-3-пропилбензилиден)ацетогидразид (37)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H1 (124 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47е (91 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 37 (174 мг, 84,6%) в виде не совсем белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,10 (s, 1H), 10,19 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 7,32-7,30 (m, 4H), 7.28-7.25 (m, 1H), 6,89 (dd, 1H, J=3,0, 9,0 Гц), 6,71 (dd, 1H, J=3,0, 8,5 Гц), 3,54 (s, 2H), 3,20 (s, 2H), 2,66-2,59 (m, 6H), 2,53 (br s, 4H), 1,64 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,95 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³С-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,1, 155,4 (d, J_CF=235,1 Гц), 152,8, 150,0, 137,9, 132,7 (d, J_CF=6,6 Гц), 129,2, 128,4, 127,3, 119,1 (d, J_CF=22,5 Гц), 116,7 (d, J_CF=7,9 Гц), 113,4 (d, J_CF=23,4 Гц), 63,0, 61,0, 53,8, 53,1, 31,9, 22,5, 14,0. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 129,1. МСВР (ИЭ): 413,2345 (М+1); рассчитано для C₂₃H₃₀FN₄O₂: 413,2353.

4-((4-(2-(2-(5-фтор-2-гидрокси-3-пропилбензилиден)гидразинил)-2-оксоэтил)пиперазин-1-ил)метил)бензолсульфамид (38)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H2 (164 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47е (91 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 38 (221 мг, 89,9%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, (CD₃)₂CO) δ11,68 (br s, 1H), 10,92 (s, 1H), 8,46 (s, 1H), 7,84 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,49 (d, 2H, J=8,0 Гц), 6,98 (dd, 1H, J=3,0, 9,5 Гц), 6,93 (dd, 1H, J=3,0, 8,5 Гц), 6,59 (br s, 2H), 3,57 (s, 2H), 3,18 (s, 2H), 2,64-2,59 (m, 6H), 2,50 (br s, 4H), 1,63 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,93 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, (CD₃)₂CO) δ 166,6, 156,1 (d, J_CF=233,1 Гц), 153,4 (d, J_CF=1,4 Гц), 149,7 (d, J_CF=2,9 Гц), 143,9, 143,6, 132,8 (d, J_CF=6,9 Гц), 129,9, 126,8, 119,0 (d, J_CF=22,8 Гц), 118,3 (d, J_CF=8,1 Гц), 114,2 (d, J_CF=23,6 Гц), 62,5, 61,6, 54,2, 53,4, 32,3, 23,1, 14,1. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, (CD₃)₂CO) δ - 127,7. МСВР (ИЭ): 492,2074 (М+1); рассчитано для C₂₃H₃₁FN₅O₄S: 492,2081.

2-(4-бензоилпиперазин-1-ил)-N'-(5-фтор-2-гидрокси-3-пропилбензилиден)ацетогидразид (39)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H3 (131 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47е (91 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-10% MeOH/этилацетат) дает соединение 39 (189 мг, 88,9%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,13 (s, 1H), 10,48 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,38-7,32 (m, 5H), 6,83 (dd, 1H, J=3,0, 9,0 Гц), 6,55 (dd, 1H, J=3,0, 8,5 Гц), 3,80 (br s, 2H), 3,46 (br s, 2H), 3,18 (s, 2H), 2,59-2,54 (m, 6H), 1,57 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,88 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 170,5, 165,6, 155,3 (d, J_CF=235,1 Гц), 152,6 (d, J_CF=1,4 Гц), 150,2 (d, J_CF=2,5 Гц), 135,3, 132,5 (d, J_CF=6,8 Гц), 130,1, 128,7, 126,9, 119,1 (d, J_CF=22,6 Гц), 116,6 (d, J_CF=7,9 Гц), 113,4 (d, J_CF=23,4 Гц), 60,7, 53,5 (br), 47,5 (br), 42,0 (br), 31,8, 22,4, 13,9. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 129,0. МСВР (ИЭ): 427,2144 (М+1); рассчитано для C₂₃H₂₈FN₄O₃: 427,2145.

2-(4-(4-цианобензил)пиперазин-1-ил)-N'-(5-фтор-2-гидрокси-3-пропилбензилиден)ацетогидразид (40)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H9 (137 мг» 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47е (91 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-15% MeOH/этилацетат) дает соединение 40 (180 мг, 82,1%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,07 (s, 1Н), 10,16 (s, 1Н), 8,25 (s, 1H), 7,57 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,42 (d, 2H, J=8,0 Гц), 6,86 (dd, 1Н, J=3,0, 9,0 Гц), 6,68 (dd, 1Н, J=3,0, 8,0 Гц), 3,55 (s, 2H), 3,18 (s, 2H), 2,70-2,57 (m, 6H), 2,51 (br s, 4H). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,0, 155,4 (d, J_CF=235,1 Гц), 152,7 (d, J_CF=1,4 Гц), 150,0 (d, J_CF=2,5 Гц), 144,0, 132,6 (d, J_CF=6,8 Гц), 132,2, 129,5, 119,1 (d, J_CF=22,6 Гц), 119,0, 116,6 (d, J_CF=8,0 Гц), 113,4 (d, J_CF=23,5 Гц), 110,9, 62,3, 60,9, 53,7, 53,1, 31,9, 22,4, 14,0. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 129,0. МСВР (ИЭ): 438,2301 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₉FN₅O₂: 438,2305.

2-(4-(4-цианобензоил)пиперазин-1-ил)-N'-(5-фтор-2-гидрокси-3-пропилбензилиден)ацетогидразид (41)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H10 (144 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47е (91 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М), Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-10% MeOH/этилацетат) дает соединение 41 (196 мг, 86,5%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,03 (s, 1Н), 10,17 (s, 1Н), 8,19 (s, 1Н), 7,66 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,46 (d, 2H, J=8,0 Гц), 6,84 (dd, 1Н, J=3,0, 9,0 Гц), 6,59 (dd, 1Н, J=3,0, 8,5 Гц), 3,82 (br s, 2H), 3,41 (br s, 2H), 3,22 (s, 2H), 2,66 (br s, 2H), 2,57 -2,52 (m, 2H), 1,55 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,87 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 168,3, 165,4, 155,3 (d, J_CF=235,5 Гц), 152,6 (d, J_CF=1,1 Гц), 150,3 (d, J_CF=2,0 Гц), 139,7, 132,6 (d, J_CF=6,8 Гц), 132,5, 127,7, 119,2 (d, J_CF=22,6 Гц), 118,0, 116,4 (d, J_CF=7,9 Гц), 113,6, 113,4 (d, J_CF=23,3 Гц), 60,7, 53,4 (br), 47,4 (br), 42,0 (br), 31,7, 22,3, 13,9. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 128,7. МСВР (ИЭ): 452,2098 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₇FN₅O₃: 452,2098.

N'-(5-фтор-2-гидрокси-3-пропилбензилиден)-2-(4-(4-фторбензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (42)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H11 (133 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47е (91 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 42 (202 мг, 93,8%) в виде желтого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,07 (s, 1Н), 10,16 (s, 1Н), 8,26 (s, 1H), 7,26 (dd, 2H, J=5,5, 8,5 Гц), 6,99 (t, 2H, J=8,5 Гц), 6,88 (dd, 1Н, J=3,0, 9,0 Гц), 6,70 (dd, 1Н, J=3,0, 8,0 Гц), 3,48 (s, 2H), 3,18 (s, 2H), 2,66-2,58 (m, 6H), 2,50 (br s, 4H), 1,62 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,94 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,1, 162,1 (d, J_CF=243,8 Гц), 155,5 (d, J_CF=235,0 Гц), 152,8 (d, J_CF=0,9 Гц), 150,1 (d, J_CF=2,0 Гц), 133,7, 132,7 (d, J_CF=6,8 Гц), 130,7 (d, J_CF=7,9 Гц), 119,2 (d, J_CF=22,5 Гц), 116,7 (d, J_CF=7,9 Гц), 115,2 (d, J_CF=21,0 Гц), 113,5 (d, J_CF=23,4 Гц) 62.1, 61.0, 53.8, 53.0, 31.9, 22.5, 14.1. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 118,8, - 129,0. МСВР (ИЭ): 431,2250 (М+1); рассчитано для C₂₃H₂₉F₂N₄O₂: 431,2259.

N'-(5-фтор-2-гидрокси-3-пропилбензилиден)-2-(4-(4-фторбензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (43)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H12 (140 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47е (91 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-10% MeOH/этилацетат) дает соединение 43 (195 мг, 87,7%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,07 (s, 1Н), 10,32 (s, 1Н), 8,18 (s, 1Н), 7,36 (dd, 2H, J=5,0, 8,5 Гц), 7,05 (t, 2H, J=8,5 Гц), 6,84 (dd, 1Н, J=3,0, 9,0 Гц), 6,57 (dd, 1Н, J=3,0, 8,5 Гц), 3,81 (br s, 2H), 3,48 (br s, 2H), 3,20 (s, 2H), 2,62-2,50 (m, 6H), 1,56 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,88 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,6, 165,6, 163,5 (d, J_CF=249,3 Гц), 155,4 (d, J_CF=235,4 Гц), 152,7 (d, J_CF=0,9 Гц), 150,3, 132,6 (d, J_CF=6,8 Гц), 131,3 (d, J_CF=3,4 Гц), 129,4 (d, J_CF=8,4 Гц), 119,2 (d, J_CF=22,6 Гц), 116,5 (d, J_CF=7,9 Гц), 115,8 (d, J_CF=21,6 Гц), 113,4 (d, J_CF=23,4 Гц), 60,7, 53,5 (br), 47,7 (br), 42,1 (br), 31,8, 22,4, 13,9. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 112,6, - 128,8. МСВР (ИЭ): 445,2049 (М+1); рассчитано для C₂₃H₂₇F₂N₄O₃: 445,2051.

N'-(5-фтор-2-гидрокси-3-пропилбензилиден)-2-(4-(4-(трифторметил)бензил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (44)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H13 (158 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47е (91 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-20% MeOH/этилацетат) дает соединение 44 (184 мг, 76,5%) в виде светло-желтого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,08 (s, 1H), 10,18 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 7,56 (d, 2H, J=8,0 Гц), 7,43 (d, 2H, J=8,0 Гц), 6,88 (dd, 1H, J=3,0, 9,0 Гц), 6,69 (dd, 2H, J=3,0, 8,5 Гц), 3,56 (s, 2H), 3,20 (s, 2H), 2,64-2,58 (m, 6H), 2,52 (br s, 4H), 1,62 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,93 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 166,1, 155,5 (d, J_CF=235,1 Гц), 152,8 (d, J_CF=1,2 Гц), 150,0 (d, J_CF=2,6 Гц), 142,4, 132,7 (d, J_CF=6,8 Гц), 129,5 (d, J_CF=32,1 Гц), 129,3, 125,3 (q, J_CF=3,8 Гц), 124,4 (d, J_CF=270,5 Гц), 119,2 (d, J_CF=22,6 Гц), 116,7 (d, J_CF=7,9 Гц), 113,5 (d, J_CF=23,5 Гц), 62,3, 61,0, 53,8, 53,1, 31,9, 22,5, 14,0. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 65,4, - 128,9. МСВР (ИЭ): 481,2216 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₉F₄N₄O₂: 481,2227.

N'-(5-фтор-2-гидрокси-3-пропилбензилиден)-2-(4-(4-(трифторметил)бензоил)пиперазин-1-ил)ацетогидразид (45)

Синтезируют в соответствии с общей методикой D: H14 (165 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 47е (91 мг, 0,50 ммоль, 1,0 экв.), 1,2 М раствор HCl (29 мкл, 0,035 ммоль, 0,070 экв.), этанол (3 мл, 0,15 М). Очистка с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (градиент, 0-10% MeOH/этилацетат) дает соединение 45 (140 мг, 56,7%) в виде белого твердого вещества. ¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 11,04 (s, 1H), 10,19 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,65 (d, 2H, J=8,5 Гц), 7,48 (d, 2H, J=8,0 Гц), 6,86 (dd, 1H, J=3,0, 9,0 Гц), 6,60 (dd, 1H, J=3,0, 8,0 Гц), 3,85 (br s, 2H), 3,44 (br s, 2H), 3,22 (s, 2H), 2,67 (br s, 2H), 2,60-2,51 (m, 4H), 1,58 (sext, 2H, J=7,5 Гц), 0,90 (t, 3H, J=7,5 Гц). ¹³C-ЯМР (125 МГц, CDCl₃) δ 169,0, 165,5, 155,4 (d, J_CF=235,4 Гц), 152,7 (d, J_CF=0,9 Гц), 150,4 (d, J_CF=2,4 Гц), 138,9, 132,7 (d, J_CF=6,8 Гц), 132,0 (d, J_CF=32,6 Гц), 127,5, 125,8 (q, J_CF=3,6 Гц), 123,7 (d, J_CF=271,0 Гц), 119,3 (d, J_CF=22,6 Гц), 116,5 (d, J_CF=7,9 Гц), 113,4 (d, J_CF=23,4 Гц), 60,8, 53,5 (br), 47,5 (br), 42,0 (br), 31,8, 22,4, 14,0. ¹⁹F-ЯМР (470 МГц, CDCl₃) δ - 66,0, - 128,7. МСВР (ИЭ): 495,2008 (М+1); рассчитано для C₂₄H₂₇F₄N₄O₃: 495,2019.

Схема 3.1: Примеры исходных веществ, используемых для синтеза различных гидразидов.

Пример 3 Библиография

1. Putt, K.S.; Chen, G.W.; Pearson, J.M.; Sandhorst, J.S.; Hoagland, M.S.; Kwon, J. Т.; Hwang, S.K.; Jin, H.; Churchwell, M.I.; Cho, M.H.; Doerge, D.R.; Helferich, W.G.; Hergenrother, P.J., Small-molecule activation of procaspase-3 to caspase-3 as a personalized anticancer strategy. Nat. Chem. Biol. 2006, 2, 543-550.

2. Peterson, Q.P.; Hsu, D.C.; Goode, D.R.; Novotny, C.J.; Totten, R.K.; Hergenrother, P.J., Procaspase-3 Activation as an Anti-Cancer Strategy: Structure-Activity Relationship of Procaspase-Activating Compound 1 (PAC-1) and Its Cellular Co-Localization with Caspase-3. J. Med. Chem. 2009, 52, 5721-5731.

3. Hsu, D.C.; Roth, H.S.; West, D.C.; Botham, R.C.; Novotny, C.J.; Schmid, S.C.; Hergenrother, P.J., Parallel Synthesis and Biological Evaluation of 837 Analogues of Procaspase-Activating Compound 1 (PAC-1). ACS Comb. Sci. 2012, 14, 44-50.

4. Vichai, V.; Kirtikara, K., Sulforhodamine В colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat. Protoc. 2006, 1, 1112-1116.

Пример 5. Фармацевтические лекарственные формы

Следующие составы иллюстрируют типичные фармацевтические лекарственные формы, которые можно использовать для терапевтического или профилактического введения соединения формулы, описанного в данной заявке, соединения, подробно описанного в данной заявке, или его фармацевтически приемлемую соль или сольват (далее по тексту - «Соединение X»):

(i) Таблетка 1 мг/табл. «Соединение X» 100,0 Лактоза 77,5 Повидон 15,0 Натрий кроскармелоза 12,0 Микрокристаллическая целлюлоза 92,5 Магния стеарат 3.0 300,0 (ii) Таблетка 2 мг/табл. «Соединение X» 20,0 Микрокристаллическая целлюлоза 410,0 Крахмал 50,0 Натриевый гликолат крахмала 15,0 Магния стеарат 5.0 500,0 (iii) Капсула мг/капс. Соединение X» 10,0 Коллоидный диоксид кремния 1,5 Лактоза 465,5 Желатинированный крахмал 120,0 Магния стеарат 3.0 600,0 (iv) Инъекция 1 (1 мг/мл) мг/мл «Соединение X» (в форме свободной кислоты) 1,0 Двухосновный фосфат натрия 12,0 Одноосновный фосфат натрия 0,7 Хлорид натрия 4,5 1,0 N Раствора гидроксида натрия в достаточном количестве (регулирование рН до 7,0-7,5) Вода для инъекций в достаточном количестве до 1 мл (iv) Инъекция 2 (10 мг/мл) мг/мл «Соединение X» (в форме свободной кислоты) 10,0 Одноосновный фосфат натрия 0,3 Двухосновный фосфат натрия 1,1 Полиэтиленгликоль 400 200,0 0,1 N Раствора гидроксида натрия в достаточном количестве (регулирование рН до 7,0-7,5) Вода для инъекций в достаточном количестве до 1 мл (vi) Аэрозоль мг/флакон «Соединение X» 20 Олеиновая кислота 10 Трихлормонофторметан 5000 Дихлордифторметан 10000 Дихлортетрафторэтан 5000 (vii) Наружный гель 1 % по весу «Соединение X» 5% Карбомер 934 1,25% Триэтаноламин в достаточном количестве (регулирование рН до 5-7) Метилпарабен 0,2% Очищенная вода в достаточном количестве до 100 г (viii) Наружный гель 2 % по весу «Соединение X» 5% Метилцеллюлоза 2% Метилпарабен 0,2% Пропилпарабен 0,02% Очищенная вода в достаточном количестве до 100 г (ix) Наружная мазь % по весу «Соединение X» 5% Пропиленгликоль 1% Безводная мазевая основа 40% Полисорбат 80 2% Метилпарабен 0,2% Очищенная вода в достаточном количестве до 100 г (х) Наружный крем 1 % по весу «Соединение X» 5% Белый пчелиный воск 10% Жидкий парафин 30% Бензиловый спирт 5% Очищенная вода в достаточном количестве до 100 г (xi) Наружный крем 2 % по весу «Соединение X» 5% Стеариновая кислота 10% Глицерилмоностеарат 3% Простой эфир полиоксиэтиленстеарила 3% Сорбитол 5% Изопропилпальмитат 2% Метилпарабен 0,2% Очищенная вода в достаточном количестве до 100 г

Эти составы можно получить обычными способами, хорошо известными в фармацевтической области. Следует иметь в виду, что указанные выше фармацевтические композиции можно изменять в соответствии с хорошо известными фармацевтическими приемами, чтобы использовать различные количества и типы активного ингредиента «Соединение X». Аэрозольный состав (vi) можно использовать в сочетании со стандартной, с отмеряемой дозой аэрозольной упаковкой. Кроме того, конкретные ингредиенты и пропорции приведены в иллюстративных целях. Ингредиенты можно взаимозаменять на соответствующие эквиваленты, и можно изменять пропорции в зависимости от требуемых свойств искомой лекарственной формы.

Несмотря на то, что конкретные воплощения были описаны выше со ссылкой на раскрытые воплощения и примеры, такие воплощения являются исключительно иллюстративными и не ограничивают объем настоящего изобретения. Изменения и модификации могут вноситься в соответствии с обычной квалификацией среднего специалиста в данной области, не отступая от изобретения в его самых широких аспектах, как определено в нижеследующей формуле изобретения.

Любые публикации, патенты и патентные документы включены в настоящую заявку посредством ссылки, как если бы включались в качестве ссылки по отдельности. Не следует принимать из этих документов каких-либо ограничений, не совместимых с настоящим раскрытием. Изобретение было описано со ссылкой на различные конкретные и предпочтительные воплощения и методики. Тем не менее, следует понимать, что многие изменения и модификации можно вносить, оставаясь при этом в пределах сущности и объема настоящего изобретения.

Изобретение относится к новым соединениям формулы I:

, а также фармацевтическим композициям на их основе. Технический результат: получены новые соединения, активирующие прокаспазу-3, которые могут индуцировать гибель раковых клеток. 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр., 10 ил.

1. Соединение, которое активирует прокаспазу-3, где соединение является новым соединением Формулы I:

,

где

R¹ представляет собой замещенный бензоил; который может быть замещен Н, F, -CN или CF₃;

каждая R² независимо представляет собой Н или гало;

n - это 1 или 2;

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение, которое активирует прокаспазу-3, где соединение представляет собой соединение Формулы (X):

,

где R¹⁰ представляет собой Н, F, CN или CF₃;

R²⁰ представляет собой Н или F; и

R³⁰ представляет собой Н, (C₁-C₃)алкил или (С₁-С₃)алкенил;

или его фармацевтически приемлемая соль.

3. Соединение по п. 2, где R³⁰ представляет собой Н, пропил или 2-пропенил.

4. Соединение по п. 3, где соединение представляет собой:

или

5. Соединение по любому из пп. 1-4, где соединение индуцирует гибель раковых клеток в культуре.

6. Фармацевтическая композиция, индуцирующая гибель раковых клеток, содержащая эффективное количество соединения по любому из пп. 1-4 и фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель.

7. Способ индуцирования гибели раковой клетки, содержащий (a) идентификацию восприимчивости раковой клетки к индуцированию гибели с помощью активирующего прокаспазу соединения; и (b) воздействие на раковую клетку эффективным количеством активирующего прокаспазу соединения; где активирующее прокаспазу соединение означает соединение по любому из пп. 1-4.

8. Способ индукции апоптоза клетки, содержащий введение в клетку эффективного количества соединения по любому из пп. 1-4.