СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ НАРУЖНОГО ГЕНИТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗА Российский патент 2018 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития наружного генитального эндометриоза (НГЭ).

Эндометриоз занимает 3 место в структуре гинекологической патологии. Имеет полиморфную клиническую картину, в связи с чем, возникают трудности в своевременной постановке диагноза, что приводит к отсроченному началу лечения и формированию тяжелых распространенных форм заболевания.

Лапароскопия является золотым стандартом диагностики эндометриоза. Обеспечивает не только визуальное подтверждение, но и дает возможность забора материала для выполнения гистологического исследования [1].

Вместе с тем, некоторые эксперты считают, что диагноз «эндометриоз» может быть поставлен даже в отсутствии гистологического подтверждения, и проведение лапароскопии для диагностических целей, не должно быть обязательным, если от вмешательства невозможно предвидеть четкие терапевтические выгоды. Это мнение включено в некоторые, но не все международные методические рекомендации [2].

В публикациях последних лет наметилась тенденция к ограничению показаний для выполнения инвазивных методов исследования с целью диагностики эндометриоза. Так, в частности, ряд авторов утверждает, что безоперационный диагноз, основанный на симптомах, данных физикального осмотра и трансвагинального ультразвукового исследования можно поставить большинству женщин с эндометриозом [3].

При использовании УЗ- и МРТ-диагностики, несмотря на широкое применение этих методов в гинекологической практике, ни один из них не позволяет выявить поверхностные импланты на брюшине малого таза и крестцово-маточных связках [4-7].

Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза по исследованию периферической крови больного и определения спонтанной НСТ - активности нейтрофилов после их инкубации с ПАМГ-2 [8]. К недостаткам данного способа следует отнести следующее: активность нейтрофилов относится к тем показателям, которая может изменяться при даже незначительных воспалительных процессах; способ неспецифичен и трудновыполним.

Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза по определению в периферической венозной крови показателя относительного содержания CD16+ моноцитов в моноцитарном гейте и при его значениях, равных или меньших 45%, диагностируют НГЭ [9]. Самым существенным недостатком в предложенном способе является особенно сложное его выполнение. Для определения содержания CD16+в моноцитарном гейте фиксируются сначала три основных параметра. Это осуществляется высококвалифицированным специалистом, что снижает возможность широкого использования метода.

Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ диагностики наружного генитального эндометриоза путем исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют уровень липопротеинов высокой плотности и при величине 0,77 ммоль/л и выше диагностируют наружный генитальный эндометриоз [10]. Недостатком данного метода является отсутствие возможности диагностики стадий эндометриоза.

Эндометриоз - это дисгормональное, иммунозависимое, генетически детерминированное заболевание, связанное с доброкачественным разрастанием ткани, морфологически и функционально подобной эндометрию, за пределами полости матки [1].

Генетически обусловленные изменения продукции и свойств иммунорегуляторных цитокинов, факторов ангиогенеза и ферментов метаболизма эстрогенов у женщин лежат в основе развития НГЭ. Нами выявлена ассоциация следующих генотипов - С-511T гена. IL1B, С-590Т гена IL4, G-174C гена IL6, С-592А гена IL10, С-509Т гена TGFB; -604Т/С гена KDR, 735G/A гена Ang-2; A-4889G гена CYP1A1, С-734А гена CYP1A2 с развитием эндометриоза. Полученные результаты являются маркерами, а на основе анализа их частот нами создана математическая модель прогнозирования риска развития данного заболевания.

Задача заявляемого изобретения является разработка способа прогнозирования риска развития наружного генитального эндометриоза.

Поставленная задача решается следующим способом: из периферической венозной крови выделяют ДНК с последующим исследованием полиморфных вариантов генов цитокинов: С-511Т гена IL1B, С-590Т гена IL4, G-174C гена IL6, С-592А гена IL10, С-509Т гена TGFB, с помощью аллель-специфической амплификации специфических участков генома; полиморфизма генов факторов ангиогенеза: -604Т/С гена KDR, 735G/A гена Ang-2 и ферментов метаболизма эстрогенов: A-4889G гена CYP1A1, С-734А гена CYP1A2 с помощью полимеразной цепной реакции с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПЦР ПДРФ-анализа).

Кровь для молекулярно-генетических методов исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях (у женщин с эндометриозом утром в день операции). Образцы крови хранили при -70°С до момента исследования.

Выделение ДНК из периферической крови проводили сорбентным методом согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «ДНК-сорб-В» (ООО «ИнтерЛабСервис», г. Москва).

На первом этапе определяли свободное слагаемое (константу) и весовые коэффициенты для согласованных предикторов, вошедших в модель, затем проводили расчет вероятностей отнесения пациентки к тому или иному классу.

Далее, рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле:

Y=-45,807+k₁+k₂+k₃+k₄+k₅+k₆+k₇+k₈+k₉,

где k₁ выбирается в зависимости от полиморфных вариантов гена IL1B: при генотипе СС k₁=19,035, при генотипе CT k₁=18,887, при генотипе ТТ k₁₌0;

k₂ выбирается в зависимости от полиморфных вариантов гена IL1B: при генотипе СС k₂=19,915, при генотипе СТ k₂=20,115, при генотипе ТТ k₂=0;

k₃ выбирается в зависимости от полиморфных вариантов гена IL6: при генотипе GC k₃=3,283, при генотипе GG k₃=3,439, при генотипе СС k₃=0;

k₄ выбирается в зависимости от полиморфных вариантов гена IL10: при генотипе АА k₄=-20,148, при генотипе СА k₄=-19,309, при генотипе СС k₄=0;

k₅ выбирается в зависимости от полиморфных вариантов гена TGFB: при генотипе СС k₅=1,413, при генотипе СТ k₅=-18,656, при генотипе ТТ k₅=0;

k₆ выбирается в зависимости от полиморфных вариантов гена CYP1A1: при генотипе АА k₆=1,568, при генотипе AG k₆=-0,379, при генотипе GG k₆=0;

k₇ выбирается в зависимости от полиморфных вариантов гена CYP1A2: при генотипе АА k₇=-1,128, при генотипе СА k₇=-1,737, при генотипе СС k₇=0;

k₈ выбирается в зависимости от полиморфных вариантов гена KDR: при генотипе СС k₈=-2,426, при генотипе CTk₈=-1,586, при генотипе ТТ k₈=0;

k₉ выбирается в зависимости от полиморфных вариантов гена Ang2: при генотипе АА k₉=2,864, при генотипе AG k₉=1,722, при генотипе GG k₉=0.

Значение вероятности наличия наружного генитального эндометриоза определяют по формуле:

,

где Р - значение вероятности развития признака,

е - основание натурального логарифма, математическая константа, равная 2,72,

если значение Р равно или больше 0,5, прогнозируется высокий риск развития наружного генитального эндометриоза, а если значение Р меньше 0,5 прогнозируется низкий риск развития наружного генитального эндометриоза.

Работоспособность заявленного способа подтверждена следующими клиническими примерами.

Клинический пример 1. Пациентка 35 лет, поступила в гинекологическую клинику Сибирского государственного медицинского университета 16.04.2012 г. Диагноз Z30.2 (Хирургическая стерилизация маточных труб). 17.04.2012 г. ей была выполнена лапароскопия, стерилизация маточных труб. Диагноз «наружный генитальный эндометриоз» по данным осмотра во время операции был исключен.

Из периферической крови выделено ДНК с последующим исследованием полиморфных вариантов генов цитокинов: С-511Т гена IL1B, С-590Т гена IL4, G-174C гена IL6, С-592А гена IL10, С-509Т гена TGFB, с помощью аллель-специфической амплификации специфических участков генома; полиморфизма генов факторов ангиогенеза: -604Т/С гена KDR, 735G/A гена Ang-2 и ферментов метаболизма эстрогенов: A-4889G гена CYP1A1, С-734А гена CYP1A2 с помощью полимеразной цепной реакции с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПЦР ПДРФ-анализа).

Получены следующие данные: IL1=CT, IL4=CC, IL6=GC, IL10=CA, TGFBC509T=CC, CYP1A1A4889G=АА, CYP1A2C734A=CC, KDRT604C=ТТ, Ang2G735A=АА.

Риск развития эндометриоза оценивался по формуле:

Y=(Y=-45,807+k₁+k₂+k₃+k₄+k₅+k₆+k₇+k₈+k₉)=

(-45,807+18,887+19,915+3,283-19,309+1,413+1,568+0+0+2,864)=-17,186=-17,2

Значение вероятности развития наружного генитального эндометриоза определялось по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y)=2,72^-17,2/(1+2,72^-17,2)=0,0000000335.

Таким образом, слишком малая вероятность риска развития наружного генитального эндометриоза у респондентки, что не противоречит заключению лапароскопии.

Клинический пример 2. Пациентка 25 лет, поступила в гинекологическую клинику Сибирского государственного медицинского университета 21.10.2011 г. Диагноз Наружный генитальный эндометриоз II стадии. Эндометриоз правого яичника, крестцово-маточных связок. Первичное бесплодие. 24.10.2011 г. выполнена лапароскопия, хромогидротубация, эксцизия очагов эндометриоза.

Из периферической крови выделено ДНК с последующим исследованием полиморфных вариантов генов цитокинов: С-511Т гена IL1B, С-590Т гена IL4, G-174C гена IL6, С-592А гена IL10, С-509Т гена TGFB, с помощью аллель-специфической амплификации специфических участков генома; полиморфизма генов факторов ангиогенеза: -604Т/С гена KDR, 735G/A гена Ang-2 и ферментов метаболизма эстрогенов: A-4889G гена CYP1A1, С-734А гена CYP1A2 с помощью полимеразной цепной реакции с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПЦР ПДРФ-анализа).

Получены следующие данные: IL1=CT, IL4=CC, IL6=GG, IL10=CC, TGFBC509T=CC, CYP1A1A4889G=АА, CYP1A2C734A=CC, KDRT604C=TC, Ang2G735A=AA.

Риск развития эндометриоза оценивался по формуле:

Y=(Y=-45,807+k₁+k₂+k₃+k₄+k₅+k₆+k₇+k₈+k₉)=

(45,807+19,035+19,915+3,439+0+1,413+1,568+0-1,586+2,864)=4,02

Значение вероятности развития наружного генитального эндометриоза определялось по формуле: Р=e^Y/(l+e^Y)=2,72^4,02/(1+2,72⁴'⁰²)=0,98. Высокая вероятность наружного генитального эндометриоза. Гистологическое исследование подтвердило наличие у пациентки наружного генитального эндометриоза.

Предлагаемый способ основан на анализе результатов клинических наблюдений, лапароскопической картины и данных гистологическогого исследования операционного материала.

Статистическая обработка результатов исследования и моделирование выполнялась с помощью пакетов программ «Statistica 10.0 for Windows» и IBM statistics SPSS 22.0.

По заявленному способу было обследовано 359 пациенток репродуктивного возраста, среди которых у 251 был (лапароскопически и гистологически) подтвержден диагноз наружный генитальный эндометриоз, а у 108 исключен. Чувствительность данного метода составила 95,4%, специфичность - 79,5%, диагностическая эффективность теста- 89,98%.

Вышеизложенное подтверждает диагностическую ценность заявленного метода.

Таким образом, заявленный способ обладает рядом преимуществ:

1. Метод высокочувствителен и специфичен.

2. Малоинвазивен.

3. Необходимо однократное проведение исследования.

4. Применение в клинической практике позволяет своевременно диагностировать наружный генитальный эндометриоз.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Wykes CB et al., 2004; Адамян Л.В. и соавт., 2006; RCOG, 2007; SOGC, 2010; Adamson D., Pasta D., 2010; ASRM, 2012; P.R. Coninckx et al., 2012; U. Leone Roberti Maggiore et al., 2015;

2. Vercellini et al. Nature Reviews Endocrinology 2014; 261-275;

3. Vercellini P., Giudice L.C., Evers J.L.H., Abrao M.S. Hum Reprod 2015;

4. Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андреева Е.Н. Эндометриозы: руководство врачей. М., Медицина, 2006, 416 с.;

5. Ищенко А.И., КудринаЕ.А. Эндометриоз: современные аспекты. М., Медицина, 2008, 176 с.;

6. Steinkeler J.A., WoodField С.А., Hillstrom М.М. Female Infertility: A Systematic Approach to Radiologic Imaging and Diagnosis. Radio Graphics 2009, Vol.29, N.5, P. 1353-1370;

7. Кулаков В.И., Адамян Л.В., Волобуев А.И. и соавт.Магнитнорезонансная томография в диагностике различных форм эндометриоза. Вестник рентгенологии и радиологии, 2003, №4, с. 45-59;

8. Патент РФ №2164687 «Способ диагностики наружного генитального эндометриоза», публикация патента 27.03.2001 г., Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова;

9. Патент РФ №2291439 «Способ диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин с бесплодием», публикация патента 10.01.2007, Федеральное государственное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию";

10. Патент РФ №2526823 «Способ диагностики наружного генитального эндометриоза», публикация патента 27.08.2014, Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и представляет собой способ прогнозирования риска развития наружного генитального эндометриоза, заключающийся в том, что выделяют ДНК из периферической венозной крови с последующим исследованием полиморфных вариантов С-511Т гена IL1B, С-590Т гена IL4, G-174C гена IL6, С-592А гена IL10, С-509Т гена TGFB, -604Т/С гена KDR, 735G/A гена Ang-2 и A-4889G гена CYP1A1, С-734А гена CYP1A2 и рассчитывают значение Р по формуле:

,

где Р - значение вероятности развития признака, Y - значение уравнения регрессии, рассчитываемое по формуле: Y = -45,807+k₁+k₂+k₃+k₄+k₅+k₇+k₈+k₉; где k_i выбирают в зависимости от полиморфных вариантов генов; и в случае, если значение Р равно или больше 0,5, прогнозируют высокий риск развития наружного генитального эндометриоза, а если значение Р меньше 0,5, прогнозируют низкий риск развития наружного генитального эндометриоза. Способ обеспечивает прогнозирование риска развития наружного генитального эндометриоза, что дает возможность для своевременного начала лечения этого заболевания. 2 пр.

Способ прогнозирования риска развития наружного генитального эндометриоза, заключающийся в том, что выделяют ДНК из периферической венозной крови с последующим исследованием полиморфных вариантов генов цитокинов: С-511Т гена IL1B, С-590Т гена IL4, G-174C гена IL6, С-592А гена IL10, С-509Т гена TGFB, с помощью аллель-специфической амплификации специфических участков генома; полиморфизма генов факторов ангиогенеза: -604Т/С гена KDR, 735G/A гена Ang-2 и ферментов метаболизма эстрогенов: A-4889G гена CYP1A1, С-734А гена CYP1A2 с помощью полимеразной цепной реакции с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПНР ПДРФ-анализа); и рассчитывают значения вероятности наличия наружного генитального эндометриоза по формуле:

,

где Р - значение вероятности развития признака,

е - основание натурального логарифма, математическая константа, равная 2,72,

Y - значение уравнения регрессии, рассчитываемое по формуле:

Y = -45,807+k₁+k₂+k₃+k₄+k₅+k₇+k₈+k_9;

где k₁ выбирают в зависимости от полиморфных вариантов гена IL1B: при генотипе СС k₁ = 19,035, при генотипе CT k₁ = 18,887, при генотипе ТТ k₁ = 0;

k₂ выбирают в зависимости от полиморфных вариантов гена IL1B: при генотипе СС k₂ = 19,915, при генотипе СТ k₂ = 20,115, при генотипе ТТ k₂ = 0;

k₃ выбирают в зависимости от полиморфных вариантов гена IL6: при генотипе GC k₃ = 3,283, при генотипе GG k₃ = 3,439, при генотипе СС k₃ = 0;

k₄ выбирают в зависимости от полиморфных вариантов гена IL10: при генотипе АА k₄ = -20,148, при генотипе СА k₄ = -19,309, при генотипе CC k₄ = 0;

k₅ выбирают в зависимости от полиморфных вариантов гена TGFB: при генотипе СС k₅ = 1,413, при генотипе CT k₅ = -18,656, при генотипе ТТ k₅ = 0;

k₆ выбирают в зависимости от полиморфных вариантов гена CYP1A1: при генотипе АА k₆ = 1,568, при генотипе AG k₆ = -0,379, при генотипе GG k₆ = 0;

k₇ выбирают в зависимости от полиморфных вариантов гена CYP1A2: при генотипе АА k₇ = -1,128, при генотипе СА k₇ = -1,737, при генотипе СС k₇ = 0;

k₈ выбирают в зависимости от полиморфных вариантов гена KDR: при генотипе СС k₈ = -2,426, при генотипе CT k₈ = -1,586, при генотипе ТТ k₈ = 0;

k₉ выбирают в зависимости от полиморфных вариантов гена Ang2: при генотипе АА k₉ = 2,864, при генотипе AG k₉ = 1,722, при генотипе GG k₉ = 0;

и в случае, если значение Р равно или больше 0,5, прогнозируют высокий риск развития наружного генитального эндометриоза, а если значение Р меньше 0,5, прогнозируют низкий риск развития наружного генитального эндометриоза.