АНТИКОАГУЛЯНТНОЕ СРЕДСТВО НЕПРЯМОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ НОВОЙ ГИБРИДНОЙ МОЛЕКУЛЫ ВАРФАРИНА С ОСТОЛЕВОЙ КИСЛОТОЙ Российский патент 2019 года по МПК A61K31/352 C07D311/06 C07D407/12 A61P7/02 

Изобретение относится к медицине и химико-фармацевтической промышленности, и касается нового непрямого антикоагулянта на основе одной гибридной молекулы варфарина, а именно 2-оксо-3-(3-оксо-1-фенилбутил)-2Н-хромен-4-ил 2-(7-метокси-2-оксо-2Н-хромен-8-ил)ацетат, формулы 1,

которое обладает выраженным влиянием на систему свертывания крови и может найти применение в медицинской практике при лечении сердечнососудистых заболеваний.

Тромботические окклюзии артерий и вен являются основной причиной смерти и инвалидизации большинства больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Инфаркт миокарда, различные виды ишемического инсульта, тромбоз левого желудочка, искусственные клапаны сердца, венозные тромбо-эмболические осложнения (ВТЭО) - тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА) и тромбоз глубоких вен (ТГВ) - вот далеко не полный перечень заболеваний требующих, с позиции медицины доказательств, длительной антитромботической терапии [Кропачева, Е.С. Исследование фармакогенетики варфарина и клопидогрела для оптимизации антитромботической -терапии: пособие для врачей. - ООО М., "Издательская группа "Дуэт", 2015. 76 с.].

Антикоагулянты непрямого действия являются краеугольным камнем современной антитромботической терапии. Известно, что варфарин является одним из важных препаратов из производных кумарина (2Н-хромен-2-она, 2Н-1-бензопиран-2-она) и наиболее часто применяемым антикоагулянтом данной группы лекарственных препаратов. Варфарин, назначаемый для профилактики тромбоэмболических осложнений у больных с фибрилляцией предсердий (ФП), искусственными клапанами и пороками сердца, а также для длительного лечения пациентов, перенесших тромбоз глубоких вен или тромбоэмболию легочной артерии. [Eikelboom J.W., Hirsh J, Spence F.A.r, et. al. Antiplatelet Drugs. Antithrombotic Therapy and Prevention of Thrombosis, 9th ed: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines. CHEST 2012. 141(2) (Suppl). e89S-e119S; Диагностика и лечение больных острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST ЭКГ. Рекомендации ВНОК. Ред. Руда М.Я. // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2007. 6(8). Приложение 1. С. 415-500].

Однако использование варфарина в медицинской практике ограничено ввиду его тяжелых побочных эффектов. Среди них нужно выделить возможность возникновения серьезных кровотечений [Ageno W., et. al. Oral anticoagulant therapy. Antithrombotic therapy and prevention of thrombosis, 9th ed: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. CHEST 2008. 141(2). e44s-e88s; Ansell J., Hirsh J., Hylek E., et. al. The pharmacology and management of the vitamin K antagonists, 8th ed: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. CHEST 2008. 133(6) (Suppl). 160s-198s].

С другой стороны, одной из актуальных задач современной фармацевтической науки является поиск высокоэффективных лекарственных средств, имеющих как природное, так и синтетическое происхождение.

Остол, 7-метокси-8-(3-метил-2-бутенил)-2Н-хромен-2-он, является природным кумарином, полученным из плодов растений Prangos ferulacea, Cnidium monnieri, и многих растений из семейства Apicaceae [Kuznetsova G.A., Abyshev A.Z. Natural (-)-7-methoxy-8-(β,γ-dihydroxyisopentyl)-coumarin // Chemistry of Natural Compounds. 1965. Vol. 1. №. 4. P. 220-223; Zhou Z. - W., Liu P. - X. Progress in study of chemical constituents and anti-tumor activities of Cnidium monnieri II Zhongguo Zhongyao Zazhi. 2005. Vol. 30, №. 17. P. 1309-1313; Jelodarian Z., Shokoohinia Y., Rashidi M., Ghiasvand, N., Hosseinzadeh L., Iranshahi M. New polyacetylenes from Echinophora cinerea (Boiss.) Hedge et Lamond // Nat. Prod. Res. 2017. №. 31. P. 2256-2263].

Следует подчеркнуть, что остол является перспективной кумариновой платформой промышленного масштаба в поиске новых лекарств, полученных путем химической модификации или гибридизации. Остол и его синтетические аналоги проявляют широкий спектр биологического действия. Они обладают противораковой, противовосполительной, противовирусной, гипогликемической, иммуномодулирующей и антикоагулятной активностью. [Zhang Z. R., el. al. Osthole: a review on its bioactivities, pharmacological properties, and potential as alternative medicine // Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015; Rosselli S. et. al. Antibacterial and anticoagulant activities of coumarins isolated from the flowers of Magydaris tomentosa II Planta medica, Vol. 73. №. 02. P. 116-120; Liang Y.C. et al. Hypoglycemic activity of osthole // Патент США. 2012. №8198320].

Кроме того, за последние несколько лет с развитием фармацевтической химии, гибридный подход при создании новых высокоактивных гибридных лекарственных средств, получил значительное внимание, поскольку он позволил синтезировать целый ряд гибридных субстанций с улучшенной биологической активностью по отношению к исходным соединениям. [Calderone V. An update on hybrid drugs in cardiovascular drug research // Expert. Opin. Drug Discov. 2008. Vol. 3. №. 12. P. 1397-1408; Mishra S., Singh P. Hybrid molecules: The privileged scaffolds for various pharmaceuticals. European journal of medicinal chemistry. 2016. Vol. 124. P. 500-536].

В связи с изложенным, разработка новых непрямых антикоагулянтов из других групп гетероциклических или гибридных соединений на основе варфарина, лишенных вышеперечисленных побочных действий, обладающих выраженной антикоагулятной активностью, является актуальной для практической медицины.

Задача изобретения - расширение арсенала антикоагулянтов непрямого действия, поиск нового средства на основе химической структуры варфарина, имеющего более низкую токсичность, чем препарат, применяющиеся в медицинской практике, а именно варфарин и обладающего выраженным влиянием на систему свертывания крови.

Сущность получения гибридного соединения из остолевой килоты и варфарина - (2-оксо-3-(3-оксо-1-фенилбутил)-2Н-хромен-4-ил 2-(7-метокси-2-оксо-2Н-хромен-8-ил)ацетат (1) заключается в двухстадийном синтезе:

а) Окисление остола с получением остолевой кислоты

Получение остолевой кислоты (3) при окислении остола (2) с помощью хромового ангидрида в ледяной уксусной кислоте при комнатной температуре в течение 48 часов по следующей схеме:

Чистое вещество получают после обработки и перекристаллизации из этанола.

б) Ацилирование варфарина хлорангидридам остолевой кислоты

Суспензию из остолевой кислоты и тионилхлорида нагревают до кипения (при 75°С) и выдерживают при слабом кипении в течение 4-5 ч до завершения реакции. Избыток тионилхлорида упаривают при пониженном давлении. Полученный продукт используют без дополнительной очистки в следующем синтезе. Заявляемое соединение (1) синтезируют взаимодействием полученного хлорангидрида остолевой кислоты (4) с варфарином (5) в безводном хлористом метилене с пиридином в качестве акцептора хлороводорода при комнатной температуре (20-25°С) по следующей схеме:

Чистое вещество получают после обработки и перекристаллизации из метанола.

Изобретение иллюстрируется примерами синтеза, исследования острой токсичности и антикоагулянтной активности.

Пример 1. Методика синтеза остолевой кислоты (3)

1,0 г природного остола в 25 мл ледяной уксусной кислоте помещают в колбу емкостью 100 мл, прибавляют 1,0 г хромового ангидрида в 20 мл 50% ледяной уксусной кислоте, содержимое колбы перемешивают при комнатной температуре в течение 48 ч. Затем реакционную смесь разбавляют 10 мл водой и экстракгируют хлороформом. Разделяют органический слой, а водную фазу экстракгируют 2 раза по 20 мл хлороформом (или метилен хлоридом). Объединенный экстракт промывают водой до рН=5 (~4 раза), подсушивают над Na₂SO₄. После отгонки растворителя и перекристаллизации из этанола получают 0,4 г (64,6%) белого порошка остолевой кислоты с т. пл. 251-252°С.

Структура полученной остолевой кислоты установлена современными методами: ТСХ, ИК-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии (рис. 1-3).

ТСХ-система: метилен хлористый - этанол (20:1). ТСХ-пластинка: Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ (силикагель СТХ-1А, УФ-254 нм). Детекция пятен осуществлялась с помощью УФ лампы при длине волны 254 нм или 365 нм. Заявляемое соединение имеет R_f 0,17.

ИК спектр (KBr, ν, см^-1): 3072 (С-Н), 2949 (СН₃), 2852 (СН₂), 1707-1737 (С=O), 1606 (СН=СН α-пирона), 1165-1288 (С(=O)-O), 1041-1120 (С-О).

Спектр ЯМР ¹Н (ДМСО-d₆), δ, м.д. (J, Гц): 3.68 (с, 2 Н, -СН₂-), 3.89 (с, 3Н, -ОСН₃), 6.29 (д, J=9.29 Hz, 1 Н, Н-3), 7.09 (д, J=8.53 Hz, 1 Н, Н-6), 7.64 (д, J=8.53 Hz, 1 Н, Н-5), 8.00 (д, J=9.54 Hz, 1 Н, Н-4), 12.42 (уш. с, 1 Н, -СООН).

Спектр ЯМР ¹³С (ДМСО-d₆), δ, м.д.: 28,51 (С-11), 56,87 (С-13), 108,38 (С-6), 111,08 (С-3), 112,76 (С-10), 112,96 (С-8), 128,68 (С-6), 145,15 (С-4), 153,16 (С-9), 160,51 (С-7), 160,56 (С=O α-пирона), 171,91 (С=O).

ЭСИ-масс-спектр: Найдено, m/z: 235,062 [М+Н]⁺. С₁₂Н₁₀О₅. Вычислено, m/z: 235,061.

Приведенные спектральные данные согласуются с таковыми, которые известны в литературе [Kuznetsova G.A., Abyshev A.Z. Natural (-)-7-methoxy-8-(β,γ-dihydroxyisopentyl)-coumarin // Chemistry of Natural Compounds. 1965. Vol. 1. №. 4. P. 220-223; Abyshev A.Z. et al. Synthesis and pharmacology of monomeric coumarins and their copolymers // Pharmaceutical Chemistry Journal. 1977. T. 11. №. 3. C. 331-337].

Пример 2. Методика синтеза 2-оксо-3-(3-оксо-1-фенилбутил)-2Н-хромен-4-ил 2-(7-метокси-2-оксо-2Н-хромен-8-ил)ацетата (1)

В колбу емкостью 100 мл, снабженную мешалкой и холодильником, помещают 0,50 г остолевой кислоты (2,10 ммоль) и 2 мл тионилхлорида (2,20 ммоль). Реакционную смесь нагревают до кипения (при 75°С) и выдерживают при слабом кипении в течение 4-5 ч до завершения реакции. Избыток тионилхлорида упаривают при пониженном давлении. Полученный продукт используют без дополнительной очистки в следующем синтезе. К смеси 0.65 г (2.10 ммоль) варфарина, 0.50 мл (6.2 ммоль) сухого пиридина в 20 мл сухого CH₂Cl₂, медленно прибавляют 0,50 г (2,0 ммоль) хлорангидрида остолевой кислоты (3). Смесь перемешивают при комнатной температуре (20-25°С) в течение 12 часов. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат промывают 5% NaOH (~3 раза), затем подкисляют 3% раствором HCl. Разделяют органический слой, а водную фазу экстрагируют 2 раза по 20 мл метиленом хлористым. Объединенный экстракт промывают водой (~3 раза) и подсушивают над Na₂SO₄ безводным.

После отгонки растворителя и перекристаллизации из метанола получают 0,75 г (71,5%) заявляемое вещество (1) брутто-формулы С₃₁Н₂₄О₈ с т. пл. 190-192°С.

Структура полученного соединения установлена современными методами: ТСХ, ИК-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии (рис. 4-6).

ТСХ-система: бензол - этилацетат (3:1). ТСХ-пластинка: Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ (силикагель СТХ-1А, УФ-254 нм). Детекция пятен осуществлялась с помощью УФ лампы при длине волны 254 нм или 365 нм. Заявляемое соединение имеет R_f 0,46.

ИК спектр (KBr, ν, см^-1): 3045 (С-Н), 2945 (СН₃), 2843 (СН₂) 1770 (С=O сложного эфира), 1703-1728 (С=O α-пирона), 1606 (СН=СН α-пирона), 1136-1286 (С(=O)-O), 1016-1116 (С-О).

ИК спектр (вазелиновое масло, ν, см^-1): 2953 (СН₃), 2852-2924 (СН₂) 1768 (С=O сложного эфира), 1701-1724 (С=O α-пирона), 1606 (СН=СН α-пирона), 1132-1284 (С(=O)-O), 1018-1116(C-O).

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃), δ, м.д. (J, Гц): 2.18 (с, 3Н, Н-14) 3.39 (дд, J=18.07, 6.53 Hz, 1 Н, Н-12) 3.58 (дд, J=18.07, 7.28 Hz, 1 Н, Н-12) 3.98 (с, 3 Н, -ОСН₃) 4.37 (с, 2 Н, Н-11'') 4.81 (т, J=7.28 Hz, 1 Н, Н-11) 6.29 (д, J=9.54 Hz, 1 Н, Н-3'') 6.95 (д, J=8.78 Hz, 1 Н, Н-6'') 7.19 (J=7.28 Hz, 1 Н, Н-4') 7.22-7.37 (м-комплекс, 6 Н, Н-6,8, Н-2'-3', Н - 5'-6') 7.46-7.54 (м-комплекс, 2 Н, Н-5'', Н-7) 7.61 (д, J=8.03 Hz, 1 Н, Н-4'') 7.68 (д, J=9.54 Hz, 1 Н, Н-5).

Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃), δ, м.д.: 28,2 (С-11), 30,21 (С-14), 36,56 (С-12), 44,99 (С-13''), 56,46 (С-11''), 107,46 (С-3), 109,25 (С-6''), 113,02 (С-3''), 113,33 (С-10''), 115,86 (С-10), 116,45 (С-8), 121,38 (С-8''), 123,68 (С-5), 124,66 (С-6), 126,86 (С-4'), 127,85 (С-2', 6'), 128,43 (С-3¹, 5'), 128,62 (С-7), 131,97 (С-5''), 140,27 (С-1'), 143,74 (С-4''), 152,27 (С-4), 153,34 (С-9), 155,56 (С-9''), 160,49 (С-7''), 160,54 (С-2''), 161,23 (С-2), 167,17 (С-12'').

ЭСИ-масс-спектр: Найдено, m/z: 525,152 [М+Н]⁺. С₃₁Н₂₅О₈. Вычислено, m/z: 525,155.

Таким образом, приведенные хроматографические и спектральные данные полностью согласуются со структурой заявляемого соединения.

Пример 3. Определение острой токсичности заявляемого соединения.

Определение острой токсичности (ЛД₅₀) проводят на белых беспородных мышах массой 18-20 г, разделенных на 4 группы по 3 животных в каждой, по экспресс-методу Прозоровского [Прозоровский В.Б. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки // Фармакол. и токсикол. 1978. №4. С. 497]. Исследуемые вещества вводят перорально в виде суспензий в смеси ДМСО - вода (1:5) с использованием стабилизатора - твин - 80 в интервале доз от 300 до 2500 мг/кг и по таблице определяют острую токсичность.

Результаты эксперимента, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что заявляемое средство по классификации Hodge и Sterner [Hodge, Н.С. Sterner J.H. Tabulation of toxicity classes // American Industrial Hygiene Association Journal. 1949. Vol. 10. P. 93-96] относится к 5-му классу токсичности и являются практически нетоксичным соединением.

Пример 4. Испытание антикоагулянтной активности заявляемого соединения на тесте определения протромбинового времени у мышей.

Антикоагулянтную активность заявляемого соединения изучает на белых нелинейных половозрелых мышах-самцах массой 18-20 г. Животные получают из питомника «Рапполово» (Ленинградская область), прошли необходимый карантин и содержались в стандартных условиях сертифицированного вивария на обычном пищевых рационе, со свободным доступом к воде.

Исследование выполнили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.) а также с Национальным стандартом РФ ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», приказом Минздрава России от 01.04.2016 г.. №199н «Об утверждении Правил лабораторной практики», согласно утвержденному письменному протоколу.

Животные разделяют на группы по 6 особей в каждой: 1 - контрольная-интактные животные, получавшие очищенную воду с добавлением диметилсульфоксида (ДМСО), 2 - мышей, получавшие препарат сравнения варфарин в дозе 5 мг/кг, остальные-мыши, получавшие заявляемое соединение, соответственно. Расчет доз заявляемого соединения осуществлялют путем пересчета по молярной эквивалентности дозе субстанции варфарина. Животные получают соответствующие вещества в течение 7 дней, после чего проводят забор крови из глаз мышей с определением тромбоцитов и дальнейшим двукратным центрифугированием (1000 и 3000 об/мин) с целью получения плазмы и отделения форменных элементов. Состояние животных оценивают визуально, отслеживают летальность в ходе эксперимента. Для оценки антикоагулянтной активности исследуемых соединений используют готовые тест-системы к гемокоагулометру марки "Humaclot Duo Plus" (Human GmbH, Германия). Статистическую обработку проводят с использованием t-критерия Сьюдента, результаты считают достоверными при p<0,05.

На основании данных, приведенных в таблице 2 видно, что протромбиновое время заявляемого соединения оказывается выше протромбинового времени препарата сравнения - варфарина. Это свидетельствует о том, что заявляемое соединение обладает антикоагулянтной активностью. Проведено вычисление MHO (международное нормализованное отношение) или INR (табл. 2).

Необходимо отметить тот факт, что применение испытуемой субстанции было более безопасным, нежели варфарин. В группе животных, получавших варфарин в течении недели погибло 40% мышей, у остальных отмечалась повышенная кровоточивость десен, кровь шла из носа, прямой кишки, гистологическое исследование выявило массовые кровоизлияния в легких, печени, почках, сердце и желудке "варфариновых" мышей. В опытной группе кровоизлияний и кровотечений не выявлено.

На рисунке 7 представлен гистологические срезы внутренних органов мышей. При этом изучаемые органы фиксируются в 10% нейтральном забуференном формалине в течение недели. После фиксации объекты заливают парафином. Полученные парафиновые блоки нарезают на ротационном микротоме толщиной 10 мкм. Срезы окрашивают гематоксилин-эозином. Исследование проводят при увеличении в 200-400 раз на 5 областях. При этом в контрольных органах не наблюдаются отеки тканей, а при использовании варфарина наблюдаются многочисленные кровоизлияния на всех пяти областях.

При использовании заявленного вещества выраженных отеков паренхимы тканей и кровоизлияний не наблюдается.

На срезах внутренних органов мышей, получавших заявленное вещество, наблюдаются следующие данные:

Дыхательная система. Бронхи со слабо выраженной реактивной пролиферацией респираторного цилиндрического эпителия, в просвете - редко содержится небольшое количество слизи. Альвеолы с тонкими стенками, в просвете - немногочисленные альвеолярные макрофаги. Лимфоидный аппарат с признаками слабо выраженной гиперплазии или без нее. Плевра обычного строения.

Сердечно-сосудистая система. Миокард левого и правого желудочков с явлениями слабо выраженного интерстициального отека, значимой воспалительной инфильтрации нет. Эндокард с явлениями слабо выраженного отека. Сосуды без патологии.

Пищеварительная система. Слизистая желудка с рассеянной слабо выраженной лимфо-гистиоцитарной инфильтрацией. Лимфоидные фолликулы в части случаев с признаками слабо выраженной гиперплазии. Подслизистый, мышечный слои и адвентиция без особенностей. Печень с сохраненным дольковым и балочным строением, портальные тракты со скудной лимфо-гистиоцитарной инфильтрацией или без нее, гепатоциты с зернистой или очаговой слабо выраженной вакуольной дистрофией.

Мочевыделителъная система. Почки обычного строения. Клубочки с умеренно полнокровными капиллярами, без патологии. Эпителий канальцев коркового и мозгового вещества с мелкоочаговой вакуольной дистрофией. Интерстиций с крайне скудной инфильтрацией лимфоцитами или без нее. Слизистая чашечек и лоханок без патологии.

Таким образом, заявляемое вещество - 2-оксо-3-(3-оксо-1-фенилбутил)-2Н-хромен-4-ил 2-(7-метокси-2-оксо-2Н-хромен-8-ил)ацетат (1) является практически нетоксичным соединением и обладает более высокой антикоагулянтной активностью, чем препарат сравнения варфарин. Безопасность применения заявляемого соединения подтверждена гистологическими исследованиями. Поэтому, выявленные свойства позволяют рекомендовать заявляемого вещества для проведения клинических испытаний как нового относительно безопасного антикоагулянта непрямого действия с целью дальнейшего внедрения его в медицинскую практику.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой антикоагулянтное средство непрямого действия, включающее 2-оксо-3-(3-оксо-1-фенилбутил)-2Н-хромен-4-ил 2-(7-метокси-2-оксо-2Н-хромен-8-ил)-ацетат в качестве активного вещества. Лекарственное средство по настоящему изобретению обладает выраженным влиянием на систему свертывания крови и имеет более низкую токсичность, чем препараты, применяющиеся в медицинской практике. 7 ил., 2 табл., 4 пр.

Антикоагулянтное средство непрямого действия, включающее 2-оксо-3-(3-оксо-1-фенилбутил)-2Н-хромен-4-ил 2-(7-метокси-2-оксо-2Н-хромен-8-ил)-ацетат в качестве активного вещества.