СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ПРОДУКЦИИ НЕЙРОТРОФНЫХ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ КЛЕТКАМИ НЕЙРОГЛИИ IN VITRO Российский патент 2025 года по МПК A61K38/00 C12N5/00 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, и касается способа стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейро-глии in vitro.

Существуют способы стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ стимуляции выработки нейротрофных факторов роста in vitro глиальными клетками субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга с помощью ингибитора JAKs, который добавляют в концентрации 100 мкМ в культуру нервной ткани и инкубируют при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха [1]. Указанный способ выбран в качестве прототипа.

Недостатком данного способа является незначительная стимуляция выработки нейротрофинов клетками глии [1].

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа и расширение арсенала эффективных способов стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro.

Поставленная задача достигается тем, что in vitro в специальной культуральной среде при добавлении ингибитора PI3K культивируют нефракционированные клетки субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве клеток, вырабатывающих нейротрофные ростовый факторы, нефракционированных клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга, и применение в качестве стимулятора выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии - ингибитора PI3K.

На сегодняшний день известно, что интенсивность и сбалансированность постна-тального нейрогенеза определяется как сохранностью популяции нейральных стволовых клеток [2, 3], так и функциональным состоянием клеток нейроглии [4]. Глиальные элементы координируют нейрогенез путем формирования прямых межклеточных контактов, а также посредством выработки широкого спектра цитокинов, в том числе ростовых факторов, стимулирующих реализацию ростового потенциала нейральных клеток-предшественников и, являющихся регуляторами функций и пластичности нейронов [3, 5]. При этом считается, что все популяции нейроглиальных клеток (астроциты, олигодендро-циты, микроглиальные клетки) являются активными продуцентами нейротрофических факторов роста [1, 4, 5].

Секреция гуморальных регуляторов осуществляется при участии системы внутриклеточной сигнализации, представленной каскадами последовательно активируемых друг другом сигнальных молекул [6]. Однако роль отдельных звеньев (это касается и PI3K) сигнальных каскадов в продукции нейротрофинов клетками нейроглии до сих пор во многом не известна.

Одним из перспективных подходов к решению задач регенеративной медицины является «Стратегия таргетной фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках» [7, 8, 9]. Данная концепция фармакотерапии предполагает использование в качестве мишеней отдельных сигнальных молекул, в том числе клеток-регуляторов функций прогениторных элементов [9]. В связи с этим выявление роли внутриклеточных сигнальных молекул (потенциальных мишеней) в функционировании нейроглиальных клеток может послужить основой для разработки принципиально новых средств с нейрорегенеративной активностью.

Таким образом, участие и роль PI3K в продукции нейротрофных факторов роста нейглиальными клетками до сих пор не известна.

Факт использования нефракционированных клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга и добавление в специальную культуральную среду ингибитора PI3K с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов in vitro, для специалиста является неочевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом:

Взвесь нефракционированных клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга в концентрации 2×10⁶/мл инкубируют в специальной культуральной среде, содержащей ингибитор PI3K в эффективной концентрации, в течение 2 сут в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха для получения кондиционных сред. По окончании инкубации кондиционные среды центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 минут и с помощью пипетки собирают содержащую нейротрофные ростовые факторы надосадочную жидкость (супернатант).

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах-самцах линии C57BI/6 в количестве 10 шт., массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ. Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Пример 1

Клетки нейроглии получали из субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга. Суспензию нефракционированных клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 48 часов в среде «MACS Neuro Medium» (Miltenyi Biotec, Германия), с добавлением 50 мкМ ингибитора PI3K (LY294002, Calbiochem, США) и 10 мкМ ингибитора PI3K (CL27c, Molnova, США). Концентрации ингибиторов PI3K были отобраны в предварительных экспериментах в качестве наиболее эффективных. Контролем служили культуры нейроглиальных клеток без добавления ингибитора PDK и способ прототип [1]. Выработка нейротропных ростовых факторов способа прототипа являлась критерием эффективности предлагаемого изобретения.

По способу прототипу: полученную суспензию нефракционированных клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга в концентрации 2х 10⁶/ мл инкубировали в среде «MACS Neuro Medium» (Miltenyi Biotec, Германия) с добавление ингибитора JAKs (Pan JAK Inhibitor «Ruxolitinib», InvivoGen, США) в концентрации 200 нМ в течение 2 сут в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха для получения кондиционных сред.

Для определения секреторной активности (продукции нейротрофинов - совокупности ростовых факторов, активных в отношении нейральных СК) изучали влияние кондиционных сред на уровень нейросферообразования в тест-системе. Тест-система представляла собой культуру нефракционированных клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга в концентрации 10⁵/ мл в среде «MACS Neuro Medium» (Miltenyi Biotec, Германия). Под нейросферой подразумевались клеточные образования, содержащие более 100 клеток - нейральные колониеобразующие единицы (КОЕ-Н) [2, 10].

В ходе эксперимента показано, что добавление ингибиторов PI3K в культуру нейроглиальных клеток значительно повышало уровень нейротрофных ростовых факторов в кондиционной среде (до 256,7 и 227,9%% от исходного уровня) (табл.1). При этом увеличение данного параметра регистрировалось как в сравнении с таковым в кондиционных средах, полученных от глиальных клеток головного мозга без ингибиторов, так и в отношении аналогичного показателя при добавлении в культуру нейроглии ингибитора JAKs (по способу прототипу) (таблица).

Полученные результаты свидетельствуют о важной роли Р13К-опосредованного сигналинга в регуляции секреторной функции нейроглиальных клеток. При этом блокада PI3K в клетках нейроглии в условиях in vitro сопровождалась выраженной стимуляцией продукции нейротрофных ростовых факторов.

Предлагаемый в качестве изобретения способ позволяет эффективно стимулировать выработку нейротрофинов клетками нейроглии in vitro.

Цитируемая литература:

1. Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Котловская Л.Ю., Чайковский А.В. Участие JAKs и STAT3 в регуляции функций регенеративно-компетентных клеток нервной ткани при Р-амилоид-индуцированной нейродегенерации // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2022. - Т. 173, №4. - С.426-430. DOI: 10.47056/0365-9615-2022-173-4-426-430

2. Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Полякова Т.Ю., Жданов В.В., Симанина Е.В., Ставрова Л.А. Специфические особенности внутриклеточной сигнальной трансдук-ции в регуляции функций нейральных стволовых клеток и коммитированных нейрональ-ных предшественников // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2020.- №4. - С. 231-236.

3. Zyuz'kov G.N., Miroshnichenko L.A., Simanina E.V., Stavrova L.A., Polyakova T.Yu. Intracellular signaling molecules of nerve tissue progenitors as pharmacological targets for treatment of ethanol-induced neurodegeneration // Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology 2021, Vol.32, iss. 6, DOI: 10.1515/JBCPP-2020-0317

4. Verkhratsky A., Ho M.S., Zorec R., Parpura V. The Concept of Neuroglia // Adv Exp Med Biol. 2019;1175:1-13. doi: 10.1007/978-981 -13-9913-8_l

5. Chang H.M., Wu H.C., Sun Z.G., Lian F., Leung PCK. Neurotrophins and glial cell line-derived neurotrophic factor in the ovary: physiological and pathophysiological implications // Hum Reprod Update. 2019 Mar l;25(2):224-242. doi: 10.1093/humupd/dmy047

6. Ron D., Berger A. Targeting the intracellular signaling "STOP" and "GO" pathways for the treatment of alcohol use disorders // Psychopharmacology (Berl). 2018 Jun; 235 (6): 1727-1743. doi: 10.1007/s00213-018-4882-z

7. Zyuz'kov G.N. Targeted Regulation of Intracellular Signal Transduction in Regeneration-Competent Cells: A new Direction for Therapy in Regenerative Medicine // Biointer-face Research in Applied Chemistry, 2021. - Vol.11. - Issue 4. - P. 12238-12251. https://doi.org/10.33263/BRIAC114.1223812251

8. Zyuz'kov G.N., Suslov N.I., Miroshnichenko L.A., Simanina E.V., Polyakova T.Yu., Stavrova L.A., Zhdanov V.V, Minakova M.Yu., Udut E.V., Udut V.V. Halogenated (Cl-ion) songorine is a new original agonist of fibroblast growth factor receptors of neuronal-committed progenitors possessing neuroregenerative effect after cerebral ischemia and hypoxia in experimental animals // Biointerface Research in Applied Chemistry, 2019. - Vol.9. - Issue 5. - P. 4317-4326. https://doi.org/10.33263/BRIAC95.317326

9. Zyuz'kov Gleb N., Miroshnichenko Larisa A., Polyakova Tatyana Yu., Stavrova Larisa A., Simanina Elena V. Wound healing properties of the protein kinase A inhibitor and the mechanisms of their development // Bangladesh Journal of Pharmacology 2021; vol 16, No. 2: 19-26. DOI: 10.3329/bjp.vl6il.50575

10. Zyuz'kov G.N., Stavrova L.A., Miroshnichenko L.A., Polyakova T.Yu., Simanina E.V. Prospects for the Use of NF-кЬ Inhibitors to Stimulate the Functions of Regeneration-Competent Cells of Nerve Tissue and Neuroregeneration in Ethanol-Induced Neurodegeneration // Biointerface Research in Applied Chemistry, 2021. - Vol.11. - Issue 1. - P. 8065-8074. https://doi.org/10.33263/BRIAC111.80658074

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro. Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа и расширение арсенала эффективных способов стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro. Поставленная задача достигается тем, что in vitro в культуральной среде MACS Neuro Medium при добавлении ингибиторов PI3K: LY294002 или CL27c, культивируют нефракционированные клетки субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха. Предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать выработку нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro. 1 табл., 1 пр.

Способ стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro, заключающийся в культивировании в CO₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 48 часов в среде MACS Neuro Medium клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга при добавлении стимулятора, отличающийся тем, что в качестве культивируемых клеток используют нефракционированные клетки субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга, а в качестве стимулятора применяют ингибиторы PI3K: LY294002 в концентрации 50 мкМ или CL27c в концентрации 10 мкМ.