Способ стимуляции продукции нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro Российский патент 2023 года по МПК C12N5/79 A61K35/30 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro.

Существуют способы стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ стимуляции выработки нейротрофных факторов роста in vitro астроцитами (одна из фракций нейроглиальных клеток) субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга с помощью ингибитора протеинкиназы р38, который добавляют в концентрации 300 мкмоль в культуру нервной ткани и инкубируют при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха [1].

Недостатком данного способа является сложность его выполнения, связанная с необходимостью получения отдельной фракции нейроглиальных клеток - астроцитов, с помощью высокотехнологичных и трудоемких методов иммуносепарации клеток [1].

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала эффективных способов стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro и упрощение способа.

Поставленная задача достигается тем, что in vitro в специальной культуральной среде при добавлении ингибиторов JAKs культивируют нефракционированные клетки субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве клеток, вырабатывающих нейротрофные ростовый факторы, нефракционированных клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга, и применение в качестве стимулятора выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии - ингибиторов JAKs.

На сегодняшний день известно, что интенсивность и сбалансированность постнатального нейрогенеза определяется как сохранностью популяции нейральных стволовых клеток [2, 3], так и функциональным состоянием клеток нейроглии [4]. Глиальные элементы координируют нейрогенез путем формирования прямых межклеточных контактов, а также посредством выработки широкого спектра цитокинов, в том числе ростовых факторов, стимулирующих реализацию ростового потенциала нейральных клеток-предшественников и, являющихся регуляторами функций и пластичности нейронов [3, 5]. При этом считается, что наиболее активными продуцентами нейтротрофических факторов роста являются астроциты. Однако известно, что другие популяции нейроглиальных клеток (олигодендроциты, микроглиальные клетки) также способны их секретировать [1, 4, 5].

Секреция гуморальных регуляторов осуществляется при участии системы внутриклеточной сигнализации, представленной каскадами последовательно активируемых друг другом сигнальных молекул [6]. Однако роль отдельных звеньев (это касается и Янус-киназ (JAKs)) сигнальных каскадов в продукции нейротрофинов разными популяциями глии до сих пор во многом не известна.

Одним из перспективных подходов к решению задач регенеративной медицины является «Стратегия таргетной фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках» [7, 8, 9]. Данная концепция фармакотерапии предполагает использование в качестве мишеней отдельных сигнальных молекул, в том числе клеток-регуляторов функций прогениторных элементов [9]. В связи с этим выявление роли внутриклеточных сигнальных молекул (потенциальных мишеней) в функционировании нейроглиальных клеток может послужить основой для разработки принципиально новых средств с нейрорегенеративной активностью.

Таким образом, участие и роль JAKs в продукции нейротрофных факторов роста нейглиальными клетками до сих пор не известна.

Факт использования нефракционированных клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга и добавление в специальную культуральную среду ингибиторов JAKs с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов in vitro, для специалиста является неочевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом:

Взвесь нефракционированных клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга в концентрации 2×10⁶/мл инкубируют в специальной культуральной среде, содержащей ингибиторы JAKs в эффективной концентрации, в течение 2 сут. в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха для получения кондиционных сред. По окончании инкубации кондиционные среды центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 минут и с помощью пипетки собирают содержащую нейротрофные ростовые факторы надосадочную жидкость (супернатант)

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах-самцах линии C57BI/6 в количестве 10 шт., массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ. Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Пример 1

Клетки нейроглии получали из субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга. Суспензию нефракционированных клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 48 часов в среде «MACS Neuro Medium» (Miltenyi Biotec, Германия), с добавлением 200 нмоль ингибитора JAKs (Pan JAK Inhibitor «Ruxolitinib», InvivoGen, США), либо 100 нмоль ингибитора JAKs (JAK Inhibitor I, Calbiochem, США) Концентрации ингибиторов JAKs были отобраны в предварительных экспериментах в качестве наиболее эффективных. Контролем служили культуры нейроглиальных клеток без добавления ингибиторов JAKs.

Для определения секреторной активности (продукции нейротрофинов - совокупности ростовых факторов, активных в отношении нейральных СК) изучали влияние кондиционных сред на уровень нейросферообразования в тест-системе. Тест-система представляла собой культуру нефракционированных клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга в концентрации 10⁵/ мл в среде «MACS Neuro Medium» (Miltenyi Biotec, Германия). Под нейросферой подразумевались клеточные образования, содержащие более 100 клеток - нейральные колониеобразующие единицы (КОЕ-Н) [2, 10].

В ходе эксперимента показано, что добавление любого из используемых ингибиторов JAKs в культуру нейроглиальных клеток значительно повышало уровень нейротрофных ростовых факторов в кондиционных средах (до 181,6% и 160,3% от исходного уровня при использовании Pan JAK Inhibitor и JAK Inhibitor I соответственно) (табл.).

Полученные результаты свидетельствуют о важной роли JAKs-опосредованного сигналинга в регуляции секреторной функции нейроглиальных клеток [11]. При этом блокада JAKs в клетках нейроглии в условиях in vitro сопровождалась выраженной стимуляцией продукции ими нейротрофных ростовых факторов.

Предлагаемый в качестве изобретения способ позволяет эффективно стимулировать выработку нейротрофинов клетками нейроглии in vitro.

Цитируемая литература

1. Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Полякова Т.Ю., Жданов В.В., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Чурин А.А., Фомина Т.И. Роль MAPK ERK1/2 и р38 в регуляции секреторной функции различных популяций нейроглии при этанолиндуцированной нейродегенерации // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2021. - Т. 171, №6. - С. 681-685.

2. Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Полякова Т.Ю., Жданов В.В., Симанина Е.В., Ставрова Л.А. Специфические особенности внутриклеточной сигнальной трансдукции в регуляции функций нейральных стволовых клеток и коммитированных нейрональных предшественников // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2020 - №4. - С. 231-236.

3. Zyuz'kov G.N., Miroshnichenko L.A., Simanina E.V., Stavrova L.A., Polyakova T.Yu. Intracellular signaling molecules of nerve tissue progenitors as pharmacological targets for treatment of ethanol-induced neurodegeneration // Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology 2021, Vol. 32, iss. 6, DOI: 10.1515/JBCPP-2020-0317.

4. Verkhratsky A, Ho MS, Zorec R, Parpura V. The Concept of Neuroglia // Adv Exp Med Biol. 2019; 1175:1-13. doi: 10.1007/978-981-13-9913-8_1.

5. Chang H.M., Wu H.C., Sun Z.G., Lian F., Leung PCK. Neurotrophins and glial cell line-derived neurotrophic factor in the ovary: physiological and pathophysiological implications // Hum Reprod Update. 2019 Mar 1; 25(2):224-242. doi: 10.1093/humupd/dmy047.

6. Ron D, Berger A. Targeting the intracellular signaling "STOP" and "GO" pathways for the treatment of alcohol use disorders // Psychopharmacology (Berl). 2018 Jun; 235(6): 1727-1743. doi: 10.1007/s00213-018-4882-z.

7. Zyuz'kov G.N. Targeted Regulation of Intracellular Signal Transduction in Regeneration-Competent Cells: A new Direction for Therapy in Regenerative Medicine // Biointerface Research in Applied Chemistry, 2021. - Vol. 11. - Issue 4. - P. 12238-12251. https://doi.org/10.33263/BRIAC114.1223812251.

8. Zyuz'kov G.N., Suslov N.I., Miroshnichenko L.A., Simanina E.V., Polyakova T.Yu., Stavrova L.A., Zhdanov V.V, Minakova M.Yu., Udut E.V., Udut V.V. Halogenated (Cl-ion) songorine is a new original agonist of fibroblast growth factor receptors of neuronal-committed progenitors possessing neuroregenerative effect after cerebral ischemia and hypoxia in experimental animals // Biointerface Research in Applied Chemistry, 2019. - Vol. 9. - Issue 5. - P. 4317-4326. https://doi.org/10.33263/BRIAC95.317326

9. Zyuz'kov Gleb N., Miroshnichenko Larisa A., Polyakova Tatyana Yu., Stavrova Larisa A., Simanina Elena V. Wound healing properties of the protein kinase A inhibitor and the mechanisms of their development // Bangladesh Journal of Pharmacology 2021; vol 16, No. 2: 19-26. DOI: 10.3329/bjp.v16i1.50575.

10. Zyuz'kov G.N., Stavrova L.A., Miroshnichenko L.A., Polyakova T.Yu., Simanina E.V. Prospects for the Use of NF-кb Inhibitors to Stimulate the Functions of Regeneration-Competent Cells of Nerve Tissue and Neuroregeneration in Ethanol-Induced Neurodegeneration // Biointerface Research in Applied Chemistry, 2021. - Vol. 11. - Issue 1. - P. 8065-8074. https://doi.org/10.33263/BRIAC111.80658074.

11. Zyuz'kov G.N., Miroshnichenko L.A., Polyakova T.Yu., Stavrova L.A., Simanina E.V., Zhdanov V.V. Specific Roles of JAKs and STAT3 in Functions of Neural Stem Cells and Committed Neuronal Progenitors during Ethanol-Induced Neurodegeneration // Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2020, Volume 168, Issue 3, pp 356-360. DOI 10.1007/s 10517-020-04708-w.

Изобретение относится к клеточной биологии, в частности к способу стимуляции выработки нейротропных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro. Для осуществления настоящего способа клетки субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга культивируют в специальной культуральной среде MACS Neuro Medium в течение 2 суток в CO₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха при добавлении стимулятора. В качестве стимулятора используют ингибиторы Janus kinases (JAKs) в концентрации 100-200 нмоль. Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал эффективных способов стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro и при этом упростить способ. 1 табл., 1 пр.

Способ стимуляции выработки нейротрофных ростовых факторов клетками нейроглии in vitro, заключающийся в культивировании в специальной культуральной среде MACS Neuro Medium клеток субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга в течение 2 суток в CO₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха при добавлении стимулятора, отличающийся тем, что в качестве культивируемых клеток используют нефракционированные клетки субвентрикулярной зоны больших полушарий головного мозга, а в качестве стимулятора - ингибиторы Janus kinases (JAKs) в концентрации 100-200 нмоль (наномоль).