ЦИТОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДА РАСПРОСТРАНЕННОГО ГНОЙНОГО ПЕРИТОНИТА Российский патент 2019 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к анестезиологии и реаниматологии и может быть использовано для определения исхода распространенного гнойного перитонита (РГП).

Несмотря на достижения в медицине летальность при РГП, являющаяся главным критерием оценки эффективности применяемых способов лечения, удерживается на уровне 20-30%, достигая наиболее высоких цифр (50% и более) при третичном перитоните и перитоните, сопровождающемся развитием полиорганной недостаточности и септического шока [7]. В связи с этим появляется необходимость разработки метода раннего прогноза исхода данного заболевания.

Известен способ прогнозирования исхода комплексного лечения больных РГП при интраабдоминальном введении имозимазы [3]. Для осуществления способа определяют показатели плазминогена, продуктов деградации фибриногена и фибрина (ПДФ), а также показатели агрегации и дезагрегации тромбоцитов при поступлении и в процессе лечения больного. При увеличении скорости агрегации тромбоцитов на 5 сутки в 2 раза, дезагрегации тромбоцитов на 3-5-е сутки в 5-8 раз, возрастании на 8 сутки концентрации плазминогена в 1,5 раза и снижении ПДФ на 8 сутки в 2,5 раза прогнозируют благоприятный исход заболевания. При снижении скорости агрегации на 5 сутки в 2 раза с потерей дезагрегации тромбоцитов на 8 сутки и отсутствии изменения уровня ПДФ прогноз считают неблагоприятным. Недостатки способа: метод реализуется при интраабдоминальном введении имозимазы, что может вызвать аллергические реакции и местное кровотечение; длительность осуществления анализа; многократный (ежедневный) забор крови.

Известен способ прогнозирования неблагоприятного течения заболевания у больных РГП и абдоминальным сепсисом [2]. У больных исследуют содержание веществ средней и низкой молекулярной массы в плазме, эритроцитах и моче с первых суток послеоперационного периода и ежесуточно, после чего рассчитывают индекс синдрома эндогенной интоксикации. При значениях индекса более 4,5 прогнозируют неблагоприятное течение заболевания. Недостатком известного способа является длительность осуществления анализа и многократный (ежедневный) забор крови.

Известен также способ прогнозирования исхода заболевания больных распространенным гнойным перитонитом, заключающийся в том, что у больных РГП на 2-е сутки заболевания определяют концентрацию общего холестерина, холестерина липопротеидов высокой плотности, величину лейкоинтоксикационного индекса и индекса сдвига лейкоцитов [4]. В зависимости от уровня и направленности изменения данных показателей прогнозируют неблагоприятный исход заболевания. Недостатком данного способа является то, что прогноз исхода РГП осуществляется только на 2 сутки после постановки диагноза, что задерживает начало мероприятий, направленных на обеспечение благоприятного исхода РГП.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования исхода РГП [5], сущность которого состоит в том, что с помощью биолюминесцентного метода определяют активность ферментов: лактатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы и глутатионредуктазы в лимфоцитах периферической крови больных. Рассчитывают метаболический коэффициент (МК), и при значении МК ниже 0,005 прогнозируют неблагоприятный исход РГП. Недостатком способа является трудоемкость определения активности указанных ферментов в лимфоцитах крови: необходимо выделить лимфоциты из периферической крови и с помощью биолюминесцентного метода определить активность ферментов. Кроме того, биолюминесцентный метод определения активности ферментов редко используется в клинико-диагностических лабораториях.

Задачей изобретения является создание информативного способа раннего и быстрого прогнозирования исхода РГП методом проточной цитометрии.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что у больных сразу после постановки диагноза РГП с помощью метода проточной цитометрии определяют процентное содержание В1-лимфоцитов и активированных Т-регуляторных клеток в крови. Затем рассчитывают коэффициент Т-клеточной регуляции (КТКР), представляющий собой соотношение процентного содержания В1-лимфоцитов к процентному содержанию активированных Т-регуляторных клеток, то есть:

КТКР=B1-лимфоциты /активированные Т-регуляторные клетки.

При значении КТКР равном или выше 4,23 прогнозируют неблагоприятный исход РГП, а при КТКР ниже 4,23 - благоприятный исход РГП.

Значение 4,23 получено опытным путем на основании сопоставления значений рассчитываемого КТКР и данных последующего наблюдения за клиническим состоянием больных РГП. Значение КТКР равное или выше 4,23 свидетельствует о снижении Т-регуляторной активности иммуновоспалительного процесса и повышении количества В1-лимфоцитов.

Иммунологические механизмы являются неотъемлемой составляющей патогенеза РГП, определяя интенсивность иммуновоспалительного процесса, характер течения восстановительного периода и исход заболевания. Исходные (дооперационные) нарушения в иммунной системе могут иметь решающее значение для возникновения различных осложнений заболевания, отрицательно влияющих на благоприятный исход РГП. При этом высокая интенсивность воспаления также может являться неблагоприятным признаком исхода РГП. Т-регуляторные клетки (фенотип CD3⁺CD4⁺CD127^LowCD25^High) являются одним из основных механизмов контроля развития гипериммунных состояний, включая ингибирование интенсивности воспаления [1, 9]. Снижение их количества или функциональной активности может привести к неконтролируемому воспалительному процессу и, соответственно, к повышению риска неблагоприятного исхода. В1-лимфоциты (фенотип CD19⁺CD5⁺) являются минорной фракцией В-клеток, локализуются преимущественно в брюшной и плевральной полостях, синтезируют IgM и IgA к бактериальным антигенам [6, 8].Соответственно, повышение их количества характеризует активацию иммуновоспалительных процессов в брюшной полости.

Способ выполняется следующим образом.

У больных сразу после постановки диагноза РГП забирают венозную кровь (для анализа достаточно 200 мкл) свободным током в пробирки с ЭДТА. По 100 мкл крови переносят в 2 пробирки для проточного цитофлуориметра. В 1-ой пробирке с помощью моноклональных антител, меченных флуоресцентной меткой, прокрашивают активированные Т-регуляторные клетки. Например, CD3-ECD(phycoerythrin-TexasRed-X), CD4-PC7 (phycoerythrin-cyanin 7), CD25-PC5 (phycoerythrin-cyanin 5), CD62L-FITC (fluoresceinisothiocyanate) и CD127-PE (phycoerythrin). Во 2-ой пробирке прокрашивают В1-лимфоциты. Например, CD5-FITC, CD19-ECD и CD45-PC5. Пробирки помещаются в темное место на 15 минут. Затем в обе пробирке вводят 1 мл лизирующего раствора (например, VersLyse (Beckman Coulter, США)) и они также помещаются в темное место на 15 минут. Анализ прокрашенных клеток осуществляют на любом проточном цитофлуориметре (например, FC-500 (BeckmanCoulter, USA)). Для повышения степени точности анализа необходимо проанализировать не менее 50000 лимфоцитов в каждой пробе.

Затем рассчитывают коэффициент Т-клеточной регуляции (КТКР): КТКР=В1-лимфоциты / активированные Т-регуляторные клетки. При значении КТКР ниже 4,23 прогнозируют благоприятный исход РГП, при значении КТКР равном и выше 4,23 прогнозируют неблагоприятный исход заболевания.

Данный способ апробирован на 36 больных РГП. По результатам обследования больных РГП по заявленному способу установлено, что из 36 больных РГП у 21 (58%) прогнозировался благоприятный исход заболевания. У этих больных величина КТКР составила 1,15 - 4,22 (ниже 4,23). У 15 (42%) больных РГП прогнозировался неблагоприятный исход заболевания, величина КТКР у них составила 4,23 - 7,89 (равно и выше 4,23). По результатам дальнейшего клинического наблюдения установлено совпадение прогноза в 100% случаев.

Клинический пример 1. Больная И., 42 года (история болезни №38596) доставлена в КГБУЗ «Краевая клиническая больница» г. Красноярска с клиникой перитонита. Из анамнеза известно, что болеет в течение 2-х суток.

Проведено исследование заявленным способом. Процентное содержание активированных В1-лимфоцитов составило 18,16%, Т-регуляторных клеток - 8,45%, соответственно, КТКР составил 2,15 (ниже 4,23), что дало основание прогнозировать благоприятный исход РПГ.

Больная оперирована в экстренном порядке. На операции выявлен распространенный гнойный перитонит. Произведена санация, дренирование брюшной полости. Через 48 часов произведена программированная санация брюшной полости.

В послеоперационном периоде в течение 7 дней в условиях ОРИТ проводилась инфузионная, антибактериальная, симптоматическая терапия, перевязки. Затем, по стабилизации состояния, переведена в хирургическое отделение, где была продолжена консервативная терапия.

Послеоперационный период без осложнений. Больная выписана на 23-е сутки в удовлетворительном состоянии на амбулаторное лечение у хирурга по месту жительства.

Клинический пример 2.

Больной Г., 52 года (история болезни №35678) доставлен в КГБУЗ «Краевая клиническая больница» г. Красноярска с клиникой перитонита. Из анамнеза известно, что болеет в течение 2-х суток, а сутки назад боли в животе приняли разлитой характер. Проведено исследование заявленным способом. Процентное содержание В1-лимфоцитов - 17,93%, активированных Т-регуляторных клеток - 13,24%, КТКР составил 1,35 (ниже 4,23). Прогнозируется благоприятный исход РПГ.

Больной оперирован в экстренном порядке. На операции выявлена перфоративная язва желудка, распространенный гнойный перитонит. Произведено ушивание перфоративной язвы, санация, дренирование брюшной полости. Через 48 часов произведена программированная санация брюшной полости.

В послеоперационном периоде в течение 5 дней в условиях ОРИТ проводилась инфузионная, антибактериальная, симптоматическая терапия, перевязки. Затем консервативная терапия продолжена в хирургическом отделении.

Послеоперационный период без осложнений. Больной выписан на 21-е сутки в удовлетворительном состоянии на амбулаторное лечение у хирурга по месту жительства.

Клинический пример 3.

Больная Г., 68 лет (история болезни №23896) доставлена в КГБУЗ «Краевая клиническая больница» г. Красноярска с клиникой перфорации полого органа, перитонита. Из анамнеза известно, что болеет в течение 6 дней.

Проведено исследование заявленным способом. Процентное содержание В1-лимфоцитов - 19,86%, активированных Т-регуляторных клеток - 4,07%, соответственно, КТКР составил 4,88 (выше 4,23). Прогнозируется неблагоприятный исход РПГ.

Больная в экстренном порядке оперирована. На операции выявлена перфорация ободочной кишки, распространенный гнойный перитонит. Произведена колостомия, санация, дренирование брюшной полости. Через 48 часов произведена программированная санация брюшной полости.

В послеоперационном периоде в условиях ОРИТ проводилась инфузионная, антибактериальная, симптоматическая терапия, перевязки. Несмотря на проводимую терапию состояние больной прогрессивно ухудшалось, нарастала полиорганная недостаточность с развитием септического шока. На 14-и сутки госпитализации констатирована смерть.

Клинический пример 4.

Больной С, 57 лет (история болезни №65714) доставлен в КГБУЗ «Краевая клиническая больница» г. Красноярска с клиникой ущемленной вентральной грыжи, перитонита. Из анамнеза известно, что болеет в течение 3 дней.

Проведено исследование заявленным способом. Процентное содержание В1-лимфоцитов - 15,09%, активированных Т-регуляторных клеток - 2,11%, соответственно, КТКР составил 7,15 (выше 4,23). Прогнозируется неблагоприятный исход РПГ.

Больному в экстренном порядке произведена герниолапаротомия. На операции выявлен некроз участка тонкой кишки с перфорацией, распространенный гнойный перитонит. Произведена резекция тонкой кишки с наложением анастомоза, санация, дренирование брюшной полости. На 2-е и 4-е сутки после первичной операции произведены программированные санации брюшной полости.

В послеоперационном периоде в условиях ОРИТ проводилась инфузионная, антибактериальная, симптоматическая терапия, перевязки. Послеоперационный период на 13-е сутки после последней программной санации осложнился эвентрацией. Произведено ушивание эвентрации. Несмотря на проводимую терапию состояние больного прогрессивно ухудшалось, нарастала полиорганная недостаточность. На 28-е сутки госпитализации констатирована смерть.

Технический результат предлагаемого способа:

- возможность раннего прогнозирования неблагоприятного исхода РГП (в течение 1 часа после постановки диагноза) на распространенном в клинико-диагностических лабораториях оборудовании;

- инвазивное вмешательство ограничено однократным забором из вены малого объема крови (достаточно 200 мкл);

- высокий уровень достоверности прогноза - 100%.

Таким образом, способ информативен, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики, позволяет своевременно осуществить прогноз неблагоприятного исхода РГП и может быть рекомендован для применения в клинической практике.

Источники информации.

1. Гариб Ф.Ю., Ризопулу А.П. Регуляторные (супрессорные) Т-клетки: дифференцировка, маркеры и механизмы действия // Российский иммунологический журнал. - 2016. - Т. 10, №1 (19). - С. 3-15.

2. Пат №2236006 РФ. Способ прогнозирования неблагоприятного течения заболевания у больных распространенным гнойным перитонитом и абдоминальным сепсисом / Щукевич Л.Е. и др.; Патентообладатель: Новокузнецкий государственный ин-т усовершенствования врачей; заявл. 11.12.2002; опубл. 10.09.2004.

3. Пат №2275632 РФ. Способ прогнозирования исхода комплексного лечения больных распространенным гнойным перитонитом при интраабдоминальном введении имозимазы / Бондарева Г.В. и др.; Патентообладатель ГУ Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН; заявл. 17.11.2003; опубл. 27.04.2006.

4. Пат №2292048 РФ. Способ прогнозирования исхода заболевания больных распространенным гнойным перитонитом / Иванов И.В. и др.; Патентообладатель Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН; заявл. 08.10.2003; опубл. 20.01.2007.

5. Пат 2498300 РФ. Способ прогнозирования исхода распространенного гнойного перитонита / Савченко А.А. и др. Патентообладатель ГБОУ ВПО "Красноярский гос. мед. ун-т им. В.Ф. Войно-Ясенецкого" МЗ и соц. развития РФ; заявл. 25.07.2012; опубл. 10.11.2013.

6. Сидорова Е.В. В-1 лимфоциты. Происхождение, дифференцировка, функции // Успехи современной биологии. - 2009. - Т. 129, №1. - С. 27-38.

7. Суковатых Б.С., Блинков Ю.Ю., Букреева А.Е., Ештокин С.А., Иванов П.А., Жуковский В.А. Применение иммобилизованных форм гипохлорита натрия в комплексном лечении распространенного гнойного перитонита // Вестник хирургии им. И.И. Грекова. - 2011. - Т. 170, №6. - С. 32-36.

8. Macias-Garcia A., Heizmann В., Sellars М., Marchal P., Dali Н., Pasquali J.L., Muller S., Kastner P., Chan S. Ikaros is a negative regulator of B1 cell development and function // J. Biol. Chem. - 2016. - Vol. 291, no. 17. - P. 9073-9086.

9. Trehanpati N., Vyas A.K. Immune Regulation by T Regulatory Cells in Hepatitis В Virus-Related Inflammation and Cancer // Scand. J. Immunol. - 2017. - Vol. 85, no. 3 - P. 175-181.

Изобретение относится к медицине и представляет собой цитометрический способ прогнозирования исхода распространенного гнойного перитонита, включающий забор и исследование крови, отличающийся тем, что у больных сразу после постановки диагноза РГП с помощью метода проточной цитометрии определяют процентное содержание В1-лимфоцитов и активированных Т-регуляторных клеток в крови, после чего рассчитывают коэффициент Т-клеточной регуляции (КТКР), представляющий собой соотношение процентного содержания В1-лимфоцитов к процентному содержанию активированных Т-регуляторных клеток, и при значении КТКР, равном или выше 4,23, прогнозируют неблагоприятный исход РГП, а при КТКР ниже 4,23 прогнозируют благоприятный исход РГП. Способ позволяет в ранний период заболевания определить риск неблагоприятного исхода и обеспечивает высокий уровень достоверности прогноза. 4 пр.

Цитометрический способ прогнозирования исхода распространенного гнойного перитонита, включающий забор и исследование крови, отличающийся тем, что у больных сразу после постановки диагноза РГП с помощью метода проточной цитометрии определяют процентное содержание В1-лимфоцитов и активированных Т-регуляторных клеток в крови, после чего рассчитывают коэффициент Т-клеточной регуляции (КТКР), представляющий собой соотношение процентного содержания В1-лимфоцитов к процентному содержанию активированных Т-регуляторных клеток, и при значении КТКР, равном или выше 4,23, прогнозируют неблагоприятный исход РГП, а при КТКР ниже 4,23 прогнозируют благоприятный исход РГП.